食管癌环境和遗传危险因素交互作用的分子基础和精准预防*

王立东　宋昕　赵学科　吴敏杰②　周福有



·食管癌专栏·

食管癌环境和遗传危险因素交互作用的分子基础和精准预防*

王立东①宋昕①赵学科①吴敏杰①②周福有③

王立东教授，国家杰出青年科学基金获得者，全国优秀科技工作者，现任郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室主任。中国抗癌协会食管癌专业委员会常委，中国抗癌协会肿瘤病因专业委员会副主任委员，河南省抗癌协会副理事长，国际食管疾病协会董事。历经20余年时间，建立50万例食管癌和贲门癌临床信息和生物样品大数据库，发现9个食管癌和贲门癌易感基因（Nat Genet，2010，2014；Hum Mol Genet，2012；Gut，2015），从遗传学角度发现维生素和微量元素缺乏及亚硝胺暴露等食管癌高危因素的分子基础，揭示环境和遗传因素交互作用对食管癌发生的影响。出版专著8部，发表论文545篇，其中SCI收录论文102篇，11篇SCI论文他引＞100次。获省部级一等奖3项。

摘要食管癌是极具中国特色的疾病，在流行病学特征、组织学发生和发病危险因素等方面与西方发达国家人群存在巨大差异，中国很难借鉴西方食管癌研究成果，因此，攻克食管癌是中国科学家的责任和挑战。本文围绕中国人食管癌遗传高易感性（易感基因）及其与环境致癌因素的交互作用、食管鳞状上皮癌变多阶段演进的分子机理这两个问题，结合这些领域的研究进展做一简要阐述。

关键词食管鳞癌易感基因精准医学环境遗传因素交互作用

食管癌是极具中国特色的疾病，在流行病学特征、组织学发生和发病危险因素等方面与西方发达国家人群存在巨大差异，中国很难借鉴西方食管癌研究成果，攻克食管癌是中国科学家的责任和挑战。中西方食管癌差异主要表现在：1）中国食管癌的流行病学特征是高发病率和死亡率、显著的地域分布差异（高、低发区发病率相差500倍）和明显家族聚集现象（家族史阳性患者占40%）。全球每年新增约50万例食管癌患者中，一半以上发生在中国，比西方国家发病率高100倍，而5年生存率仅15%左右［1-2］。2）中国人食管癌组织学发生主要来自食管鳞状上皮，食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC，简称鳞癌）是其主要组织学类型，占97%，而食管腺癌不到2%。正常→各级癌前病变（基底细胞过度增生，不典型增生，原位癌）→早期浸润鳞癌的多阶段演进癌变过程是中国人ESCC主要组织学发病模式［3］；而西方人群食管癌主要起源于Barrett's食管（食管鳞状上皮被柱状上皮所取代）腺上皮，食管腺癌是其主要组织学类型，占80%，鳞癌仅占20%。西方人群组织学发病模式为反流性食管炎→Barrett's食管→不典型增生→早期浸润腺癌［4-5］。3）中国ESCC发生的主要危险因素是维生素缺乏（特别是核黄素、维生素A和叶酸等）和亚硝胺暴露［6］；而西方人群主要危险因素是肥胖和反流性食管炎［5］，其所致的Barrett's食管是西方人群主要食管癌前病变，与此相反，中国Barrett's食管极少见，瘦人ESCC风险较高［7］（表1）。

特别值得指出的是，中国ESCC高发区几乎总是与贲门癌并存，二者堪称“姊妹癌”。后者病理类型主要为腺癌。因二者临床主要症状（进行性吞咽困难）和流行区域相似，上世纪80年代前，中国学者把贲门癌归类为食管癌［8］。近年，西方国家将食管和胃结合部上下5cm内发生的腺癌归类为食管胃交界部或结合部腺癌，并进一步根据解剖部位分为3种类型，即，Ⅰ型：食管远端腺癌，食管胃交界部上1～5 cm；Ⅱ型：GCA，食管胃交界部上1cm至交界部下2 cm；Ⅲ型：贲门下癌，食管胃交界部下2～5 cm［9］。很显然，中国人以Ⅱ型为主（＞97%），Ⅰ型极少见（＜2%），Ⅲ型亦较少。这是中国与西方人群食管癌流行特征又一显著不同之处［10-11］。

表1　中、西方人群食管癌差异Table 1　Characterization of esophageal cancer by Chinese and western populations

在河南省老一代科学家工作的基础上，本研究团队历经20余年走访食管癌高发区12万个村庄，500余家医院，进行高发区现场人群普查，进行长期随访建立459 506例食管癌和各级癌前病变临床信息和生物样品资料库，采用全基因组测序和全基因组关联分析技术，探讨食管癌遗传高易感性（易感基因）及其与环境致癌因素的交互作用和食管鳞状上皮癌变多阶段演进的分子机理，为建立用于高危人群筛查、早期发现和个体化防治及新药研发提供分子靶标和新思路。本研究就中国ESCC和GCA遗传易感性，癌变多阶段演进的分子基础及环境和遗传因素交互作用对食管癌发生的影响做一简要阐述。

1　ESCC遗传易感性的分子基础及其与环境致癌因素交互作用

本研究采用全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）、基因和蛋白表达分析及PCR产物测序等方法，从分子遗传学角度研究中国汉族ESCC患者高易感的分子基础，并在中国少数民族食管癌高发区哈萨克族和维吾尔族食管癌患者和正常人群以及GCA患者中进行验证；在此基础上，进一步研究遗传分子变化与食管癌高发区主要环境致癌因素的交互作用。

1.1中国人ESCC易感SNP位点和基因

10例中国人ESCC易感SNP位点和基因研究结果（表2），揭示ESCC高危人群遗传的分子基础［12-15］。对2.5万例中国汉族ESCC和对照组行GWAS和验证发现2个中国人群ESCC重要易感位点rs2274223、rs13042395，分别定位于10q23的PLCE1基因和20p13的C20orf54基因（又称核黄素转运基因，RFT2）；进一步的验证发现，这2个SNP位点也明显与新疆哈萨克族和维吾尔族人群ESCC高风险密切相关［12］。欧美学者将这2个SNP位点在西方人群消化道其他肿瘤如食管腺癌、胃癌、胆囊癌，甚至非消化道肿瘤，如肺癌等进行验证得到许多新的发现［16-18］。这一研究成果也催生了对PLCE1和C20orf54易感基因功能研究的广泛兴趣。随后，发表在Nature Genetics杂志上的另外2项中国不同地区ESCC和GCA的GWAS研究也重复验证了PLCE1易感基因［19］。值得指出的是，该研究小组联合其他2个研究小组进行多中心联合分析，又发现3个新的ESCC易感基因，PLCE1也到重复验证［15］。

如前所述，中国ESCC高发区人群显著区别于西方人群的一个特征是这些人群GCA的发生率也非常高，甚至出现同时或先后发生ESCC和GCA的患者（双源癌）［20］。鉴于此，该项目又对4 000例GCA患者进行验证，结论为食管鳞癌GWAS研究发现的2个SNP位点也与来自同一地区人群的GCA高风险密切相关。

表2　中国汉族食管鳞癌和贲门腺癌易感SNP位点和基因Table 2　High-risk SNP loci and related genes for esophageal squamous cell carcinoma and gastric cardia adenocarcinoma in Chinese Han population

值得指出的是，GCA与胃远端腺癌的高风险SNP不完全一致，本研究在GCA GWAS发现的位于染色体5p13.1的高风险SNP位点rs10074991（PRKAA1基因）（P=7.36×10-12）与远端胃癌高风险一致（P=2.42× 10-23），但在远端胃癌发现的位于染色体6p21.1的高风险SNP位点rs2294693（UNC5CL基因附近）（P= 2.50×10-8）却与贲门癌高风险无任何关系［13］。

1.2中国人群主要致病因素

核黄素、维生素A、叶酸体内利用障碍和环境亚硝胺暴露导致DNA烷基化损伤修复缺陷。上世纪60年代，已有研究发现维生素缺乏，特别是核黄素、维生素A中间代谢产物维甲酸和叶酸，是中国ESCC主要致癌因素。长期膳食补充这些维生素后，如核黄素盐，发现有明显干预作用［21］，但存在明显个体差异。本研究团队意外发现3个中国人ESCC高风险易感基因分别与核黄素细胞内外转运（RFT2）基因，叶酸在体内正常代谢（亚甲基四氢叶酸还原酶，MTHFR）基因［22］和维甲酸与受体结合相关基因（维甲酸受体基因β）发生多态性改变（RFT2和MTHFR基因）或基因启动子区域甲基化（维甲酸受体基因β）［23］，从而导致基因、蛋白异常表达或基因沉默，进一步导致这些维生素利用障碍，最终引起细胞增生紊乱和癌变。

在食管癌高发区河南林州的人群和实验室研究已发现亚硝胺暴露是该地区食管癌又一重要的致癌因素。亚硝胺主要是通过DNA烷基化损伤起到致癌作用。本研究团队发现河南林州高发区人群发生明显O6烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶基因多态改变（AGT），后者导致亚硝胺引起的烷基修复缺陷，从而提高食管癌易感性［24］。

上述研究阐明了中国人ESCC高易感的分子遗传基础，揭示了环境和遗传因素交互作用影响食管癌变的分子机理，从分子遗传水平丰富了维生素缺乏和亚硝胺暴露与食管癌变关系的理论，对膳食补充维生素所产生的食管癌前病变干预个体差异现象提供了新见解，且据此提出个体化预防的新观念。很显然，这些研究成果为ESCC高危人群筛查、早期发现和个体化预防及新药研制提供了理论依据、分子靶标和新思路。

2　食管鳞状上皮癌变多阶段演进的分子机理研究

本研究团队利用食管癌手术切除的组织标本和高发区无症状人群早期食管癌内镜普查和黏膜活检组织样品，采用基因PCR产物测序、mRNA和蛋白表达等方法，从基因突变、mRNA和蛋白表达、杂合性缺失（LOH）等变化，围绕食管鳞状上皮癌变多阶段演进的分子机理这一问题，重点探索正常上皮和各级癌前病变组织分子变化特征及其与病变形态学和病变进展的关系。研究结果集中在以下几个方面。

2.1p53-Rb信号传导通路变异

p53-Rb信号传导通路变异是中国人食管鳞状上皮癌变极早期阶段关键分子改变，是导致持续癌变主要分子机制。利用1 300例ESCC和配对癌旁正常上皮以及无症状人群食管癌前病变和正常活检组织系统分析p53-Rb信号通路基因突变、LOH、甲基化和磷酸化以及mRNA和蛋白表达，主要包括p53、Rb、p14、p15、p16、p21、Cyclin D1、PCNA、Bax、MDM2、Bcl-2等变化特征及其与癌前病变形态学和病变进展的关系。这些基因和蛋白在食管癌变多阶段演进过程中的变化关系如图1［25］。主要发现：这些分子改变发生在食管癌变的极早期阶段，甚至在形态学正常的食管上皮乳头区细胞已发生p53基因突变和蛋白聚集［26］，因此提出食管上皮乳头区是最早发生癌变的部位；这些分子改变随病变程度加重而明显升高，食管癌低发区居民上皮分子改变明显低于高发区；Rb变化以发生LOH为主，PCNA和CyclinD1主要以蛋白过度表达为主，p14、p15、p16等主要以甲基化改变为主。还发现同一个体，不同食管部位同时发生重度癌前病变，其癌前病变形态相似而分子改变不同［27］，为食管癌变多中心起源提供了理论依据。

2.2关键分子改变与食管癌前病变的关系

在基因突变、蛋白和mRNA表达及DNA甲基化等水平鉴定一批参与食管上皮细胞过度增生、凋亡等的

关键分子改变及其与食管癌前病变形态学变化的关系。与西方人群食管癌前病变主要是由反流性食管炎导致食管鳞状上皮被柱状上皮所取代而形成的Barrett's食管（化生），进一步发展成腺上皮不典型增生（癌前病变）和早期浸润性腺癌不同，中国食管鳞状上皮癌变极早期的一个重要特征是鳞状上皮细胞增生异常，形态学上表现为基底细胞过度增生（basal cell hyperplasia，BCH），进一步发展成不典型增生（dysplasia，DYS）和原位癌（carcinoma in situ，CIS），这些病变被认为是中国人食管癌的癌前病变［8］。客观、定量分析癌前病变细胞增生程度对科学评价Ⅱ级预防效果，阐明影响癌变早期的分子变化是该领域关键问题。这些病变的另一特点是双向发展不稳定特性，即部分可以持续向癌的方向发展，部分多年不变，甚至退回正常。单纯从形态学变化特征难以解释这种现象。本研究团队利用高发区无症状人群早期食管癌普查所获得的正常和食管癌前病变活检组织，建立活检组织体外1小时H3-胸腺嘧啶核苷（H3-TdR）组织培养，按上皮结构分层计数H3-TdR标记增生细胞方法［3］，并结合无症状人群食管各级癌前病变细胞65种肿瘤相关蛋白表达异常和增生程度关系（图2）［28］，揭示食管癌变早期分子变化特征和规律，证明形态学正常的上皮细胞已不同程度发生癌基因异常甲基化、肿瘤抑制基因突变和蛋白表达异常，形态相似的癌前病变其分子改变不同［8，20，24，26-27］。这些研究为阐明癌前病变双向发展不稳定特性的分子机理，科学评价食管癌前病变干预效果，高危人群分子分型等方面提供重要理论依据和指标。有关食管上皮细胞增生定量分析方法已被应用到肿瘤预防领域。

▶图1　p53-Rb信号传导通路在食管癌变多阶段演进中的关系Figure 1　p53-Rb pathway in esophageal multistage carcinogenesis

图2　65种肿瘤相关蛋白在食管癌变多阶段演进过程中的表达变化Figure 2　Alterations of 65 tumor related proteins in esophageal multistage carcinogenesis

3　结语

本研究以河南省近年有关食管癌环境和遗传发病危险因素交互作用和多阶段演进的分子基础研究进展为例，简要阐明食管癌遗传因素的分子基础（易感基因），并从分子遗传学角度揭示食管癌发病高危因素维生素和微量元素缺乏及亚硝胺暴露等环境因素作用的分子基础，阐明环境和遗传因素交互作用对食管癌发生的影响，据此提出食管癌个体化预防的新思路，为食管癌精准预防提供了新的研究方向。同时，简要阐明食管癌变多阶段演进的分子变化，为食管癌前病变的分子分型和Ⅱ级预防提出新的见解。组学和临床流行病学大数据的积累将为实现食管癌精准医学（防治）奠定重要基础，也是未来中国ESCC研究有望取得重大突破的主要领域。中国人GCA和ESCC在发病危险因素和流行特征及分子基础等方面有许多相似性，也是最具中国特色的疾病，应当作为一种“姊妹癌”进行系统对比研究。

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（2016-01-07收稿）

（2016-04-20修回）

（编辑：郑莉校对：杨红欣）

·读者·作者·编者·

Molecular basis and precision medicine for interactions of genetic and environmental risk factors in esophageal cancer

Lidong WANG1，Xin SONG1，Xueke ZHAO1，Minjie WU1，2，Fuyou ZHOU3
Correspondence to：Lidong WANG；E-mail：ldwang2007@126.com

1Henan Key Laboratory for Esophageal Cancer Research of the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2Basic Medical College，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，China；3Department of Surgery，Anyang Tumor Hospital，Anyang 455000，China

This work was supported by the National Ministry of Science and Technology 863 Project（No.SQ2015AA0202183）and the National Natural Science Fund Committee，Guangdong Joint Major Project（No.U1301227）

AbstractEsophageal cancer is a unique malignant disease in China.A fundamental difference exists between the Chinese population and the western population on esophageal cancer in terms of epidemiology，histogenesis，and carcinogenic risk factors.Therefore，applying the western academic achievements to Chinese is difficult.Thus，Chinese scientists have the responsibility to conquer esophageal cancer in China.This article reviews the progress of esophageal cancer focused on the molecular mechanism for interactions of genetic and environmental risk factors and human esophageal multistage carcinogenesis.

Keywords：esophageal squamous cell carcinoma，high susceptibility gene，precision medicine，evionment，genetic factor，interaction

doi：10.3969/j.issn.1000-8179.2016.12.028

作者单位：①郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室（郑州市450052）；②新乡医学院癌症研究中心；③安阳肿瘤医院胸外科

*本文课题受国家科技部863项目（编号：SQ2015AA0202183），国家自然科学基金委员会，广东省联合重大项目资助（编号：U1301227）资助通信作者：王立东ldwang2007@126.com