探讨ⅢA-N2期NSCLC原发瘤体与N2淋巴结及外周血中EGFR基因突变的差异性

李喆　郭建峰　杨杨　刘延风　许瑞彬　戎铁华　张兰军



·临床研究与应用·

探讨ⅢA-N2期NSCLC原发瘤体与N2淋巴结及外周血中EGFR基因突变的差异性

李喆①郭建峰①杨杨①刘延风①许瑞彬①戎铁华②张兰军②

摘要目的：探讨ⅢA-N2期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）原发瘤体、N2淋巴结及外周血中表皮生长因子受体基因（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变状况是否存在差异性，从基因层面为目前所提倡的“个体化医疗”提供一些有价值的参考指标。方法：用突变富集—液相芯片法检测中山大学肿瘤防治中心及延安大学附属医院2014年11月至2015年11月间手术切除并经病理证实49例病理分期为ⅢA-N2期的NSCLC原发瘤体、N2淋巴结及外周血中EGFR基因19号及21号外显子突变状况，并对检测结果整理分析。结果：49例患者中，有18例（36.7%）从原发瘤体中检测出EGFR基因突变，11例（22.4%）从N2淋巴结中检测出EGFR基因突变，而从外周血中仅有2例（4.1%）检测出EGFR基因突变；其中9例仅有原发瘤体中EGFR基因突变，2例仅有N2淋巴结中EGFR基因突变；而外周血中检测出EGFR基因突变的2例，同时也在原发瘤体及N2淋巴结中检测出EGFR基因突变。结论：在NSCLC原发瘤体及转移淋巴结中EGFR基因突变状况存在一定的差异性；在ⅢA-N2期NSCLC患者外周血中，EGFR基因突变检出率较低。以上结果提示肿瘤在转移过程中从分子水平上可能已经发生改变，存在一定的差异性，为今后EGFR-TKIs治疗NSCLC乃至于其他针对基因靶点的个体化治疗提供有价值的思考。

关键词非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变突变富集—液相芯片

肺癌目前已成为全球恶性肿瘤相关死亡的首要原因，特别是在一些大城市［1］。在肺癌中，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的病理类型，约占80%左右［2］。表皮生长因子受体基因（epiclermal growth factor receptor，EGFR）突变的晚期NSCLC患者从EGFR-TKIs治疗中获益，开创了NSCLC靶向治疗的新时代［3-4］，目前服用EGFR-TKIs治疗晚期NSCLC的必要前提是检测EGFR基因是否存在突变。虽然EGFR基因突变的类型很多，但大多数集中在19号外显子的缺失和21号外显子的L858R错义突变上，并且容易出现在亚裔、女性、不吸烟、腺癌的患者中［5-6］；而具有这些临床特性的患者也被证实能更好的从EGFR-TKIs治疗中获益［7］。然而，并不是每一例患者都能从EGFR-TKIs治疗中获益，即便是他的EGFR基因是突变的。这就表明，EGFR基因突变不仅与一些临床特性存在关联性，更有可能与分子水平存在异质性。对于大多数服用EGFR-TKIs治疗的患者来说，虽然他们已是被证实转移的晚期病例，但所用来检测EGFR基因突变的标本却是原发瘤体。EGFR基因突变状况在肿瘤原发灶和转移淋巴结及远处转移灶之间是否存在一致性呢？一些学者研究发现NSCLC原发灶与转移淋巴结间有相当一部分存在EGFR突变不一致性，不一定原发灶有EGFR突变转移淋巴结就一定突变，淋巴结有EGFR突变原发灶亦有可能没有突变［8］。也有不少研究组织在晚期NSCLC患者外周血液中检出相当比例的EGFR突变［9-10］。在本研究中，用突变富集-液相芯片法检测中山大学肿瘤医院中心及延安大学附属医院2014年11月至2015年11月间49例病理分期为ⅢA-N2期的NSCLC原发瘤体、N2淋巴结及外周血中EGFR基因19号及21号外显子突变状况，并对检测结果进行整理及分析。

1　材料与方法

1.1病例资料

收集中山大学肿瘤防治中心及延安大学附属医院2014年11月至2015年11月间手术切除并经病理证实且分期为ⅢA-N2期的49例患者的NSCLC原发瘤体、N2淋巴结、术前外周血标本及完整病例资料。所有患者术前均未行任何抗肿瘤治疗（包括化疗、靶向治疗及放疗）。这些患者的中位年龄为57.6（36～74）岁，其中71.4%（35/49）为男性。所有患者的病理分型均按照世界卫生组织（WHO）的标准进行划分，其中腺癌41例（83.7%），鳞癌8例（16.3%）。49例患者中，有30例曾经有吸烟史占61.2%，剩余19例占38.8%未曾吸烟。

1.2EGFR基因突变检测

本研究与广州益善生物技术有限公司合作，用突变富集-液相芯片技术对所有标本进行EGFR基因19、21外显子突变检测。组织样本首先用DNA提取试剂盒进行DNA抽提，以抽提好的DNA为样本，首先通过多重PCR获得各基因外显子上含有常见等位基因型的基因片段，PCR反应体系为水13.8 μL，5× PCR缓冲液10 μL，25 mM MgCl24 μL，dNTP混合液2 μL，各基因外显子引物混合液10 μL，DNA聚合酶0.2 μL，样品10 μL，PCR反应条件为52℃退火温度30循环；然后将PCR产物经核酸外切酶酶切及碱性磷酸酶水解，去除多余的引物和dNTP，反应体系为核酸外切酶0.5 μL，碱性磷酸酶0.5 μL，2×缓冲液10 μL，PCR产物9 μL，37℃酶切水解反应2 h；产物再以等位基因特异引物延伸（allele specific primer extension，ASPE）引物上的特异性序列特异的识别各等位基因型，并形成延伸产物（Product），ASPE反应体系为水7.8 μL，10×PCR缓冲液2 μL，25 mM MgCl20.5 μL，dNTP（不含dCTP）混合液1 μL，生物素标记的dCTP 0.5 μL，各等位基因型引物混合液5 μL，DNA聚合酶0.2 μL，酶切水解产物3 μL，ASPE反应条件为56℃退火温度30循环；ASPE引物上的Tag序列与聚苯乙烯微球上的Anti-Tag序列特异结合，即杂交反应，杂交反应体系为微球12 μL，杂交液33 μL，ASPE产物5 μL，杂交体系经95℃变性3 min，37℃杂交30 min后加入25 μL SA-PE工作液，继续37℃反应10 min，用Luminex 200系统分析每个样品的荧光值。

1.3统计学分析

采用Χ2检验分析EGFR基因突变与各临床特征之间的关系；Spearman秩相关系数（Spearman's ρ）被用来判断原发瘤体与N2淋巴结中EGFR基因突变之间是否存在关联性，检验方法为Pearson's correlation test，当Spearman's P≥0.70时两者被认为存在较强关联性。在所有统计学分析中，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1病例临床特征

所纳入的49例患者中位年龄57.6（36～74）岁，35例为男性，占71.4%；有吸烟史的患者30例（61.2%）；腺癌41例（83.7%），鳞癌8例（16.3%）。所有患者均行肺癌根治术（原发瘤体肺叶完整切除+纵隔淋巴结清扫），并经术后病理证实为NSCLC且分期为ⅢA-N2期。所有患者术前均未行任何抗肿瘤治疗（包括化疗、靶向治疗及放疗）（表1）。

2.249例患者原发瘤体和N2淋巴结及外周血中EGFR基因突变情况

所有标本均采用突变富集-液相芯片法检测EGFR基因19、21外显子是否存在突变。其中原发瘤体中EGFR基因突变检出率为36.7%（18/49），N2淋巴结检出率为22.4%（11/49），外周血中为4.1%（2/49）。在检出EGFR基因突变的原发瘤体中，19外显子片段缺失突变及21外显子氨基酸置换突变均占50%（9：9）；而在EGFR基因突变的N2淋巴结中，19及21外显子突变比例为6：5；在所检出EGFR基因突变的2例外周血标本中，均为21外显子氨基酸置换突变（表2）。

表1　49例患者临床特征Table 1　Patients'characteristics

2.3分析比较EGFR基因突变在原发瘤体和N2淋巴结及外周血中的差异性

在配对的原发瘤体与N2淋巴结中，EGFR基因突变存在22.4%（11/49）的差异：9例（18.4%）原发瘤体中存在突变，而N2淋巴结中未检出；2例（4.1%）N2淋巴结中存在EGFR基因突变，却在原发瘤体中未检出。用Pearson's correlation test进行分析，EGFR基因在原发瘤体与N2淋巴结中的突变状况无明显统计学上关联性（Spearman's P=0.503，P＜0.001）。然而，外周血中检测出EGFR基因突变的2例，同时也在原发瘤体及N2淋巴结中检测出突变。

2.4EGFR基因突变与患者临床特征之间的关系

采用Χ2检验分析EGFR基因突变与各临床特征之间的关系，发现在原发瘤体检出的EGFR基因突变与女性（P=0.001）、不吸烟者（P=0.002）之间存在统计学上的相关性；突变虽然在腺癌中的检出率高于鳞癌（41.5%vs.12.5%），但是却与腺癌没有表现出明显统计学上的相关性（P=0.229）。在N2淋巴结中检出的RGFR基因突变与不吸烟这一临床特征之间存在统计学上的相关性（P=0.001），与其他临床特征无关。

表2　EGFR基因在原发瘤体与N2淋巴结外周血中突变情况Table 2　Mutations in the tyrosine kinase domain of the EGFR gene in primary tumor，corresponding lymph node metastasis and plasma DNA samples

3　讨论

本研究采用突变富集-液相芯片法对配对的NSCLC原发肿瘤组织、N2淋巴结及外周血标本中EGFR基因突变情况进行比较分析，发现EGFR基因在同一例患者NSCLC原发瘤体、N2淋巴结及外周血中存在一定的差异性。Park等［8］首先报道应用DNA直接测序法和定量的异源双链分析法检测EGFR基因在101例配对的NSCLC原发灶与转移淋巴结中的突变状态，发现肿瘤细胞转移至淋巴结后并不是像原发瘤体一样具有相同的EGFR基因突变。Schmid等［11］用直接双向测序法对96例配对的肺腺癌原发灶与转移淋巴结中的EGFR/KRAS/BRAF突变状态进行检测分析，发现这些基因在腺癌原发瘤体与周围转移淋巴结中突变状态存在一定的不一致性。Chang等［12］用免疫组织化学法和DNA直接测序法对56例配对的NSCLC原发灶与转移淋巴结中的p53及EGFR基因表达及突变情况进行检测分析，发现NSCLC原发灶与转移淋巴结之间p53及EGFR基因状态存在明显的不一致性。Sun等［13］对80例配对的NSCLC原发灶与转移淋巴结中的KRAS及EGFR基因突变状态用直接测序法进行检测分析，发现华人NSCLC患者原发瘤体与周围转移淋巴结中KRAS及EGFR基因突变状态存在相当比例的异质性。Bai等［9］对230例晚期NSCLC患者的配对组织和血浆中EGFR突变情况用变性高效液相色谱技术（DHPLC）进行检测分析，结果显示组织标本和外周血的一致性为78%，而以组织标本检测为金标准，外周血EGFR突变检测的假阳性为18.8%，假阴性20.2%。外周血EGFR突变预示良好的疗效与无病进展生存期。这是迄今为止样本量最大的一组报道，提示外周血检测具有可行性。其后续研究在样本量达到800例时，2种标本的一致性仍近70%。Massuti等［14］对著名的SLOG研究进行的回顾性外周血游离DNA检测分析，发现350例晚期NSCLC中，164例有配对的外周血标本中EGFR突变的一致性为59.1%（97/164），假阴性率为40.9%，且无假阳性。

目前对EGFR基因突变进行检测的方法很多，包括直接测序法、DHPLC法（变性高效液相色谱法）、ARMS法（突变特异性扩增系统）、突变富集-液相芯片技术、荧光标记PCR产物法以及PCR taqman分析法等。虽然直接测序法被广泛的用来检测RGFR基因突变，且在容易产生假阴性的肿瘤细胞少于30%的标本中还可以被用来检测突变［15］，但是此法灵敏度较低，不适合检测福尔马林固定和石蜡包埋标本中一些基因的体细胞突变情况，也不能检测血浆样本［16］。广州益善生物技术有限公司所采用的突变富集-液相芯片技术的灵敏度非常高，达到0.1%［17］，可用来检测NSCLC患者血清或血浆中游离DNA的体细胞突变情况。在本研究中，与广州益善生物技术有限公司合作用突变富集-液相芯片技术检测NSCLC患者原发瘤体、转移淋巴结及外周血标本中EGFR基因突变状况。

对肿瘤异质性的研究清楚地表明在多种人类肿瘤细胞群中存在广泛的细胞遗传学、基因遗传学及表观遗传学上的变化［18］，肿瘤细胞群在不同转移部位的异质性也被发现［19］。

本研究采用突变富集-液相芯片技术检出的EGFR突变状况至少可以说明NSCLC转移后的癌细胞在基因层面不一定能与原发瘤体保持一致性。虽然之前提到的3项研究显示NSCLC原发肿瘤组织与外周血中EGFR突变率一致性较高，而本研究的一致性只有11.1%（2/18），原因可能是本研究所选用的为手术的ⅢA-N2期的NSCLC患者标本。除此在不同组织中EGFR突变状态存在差异外，EGFR突变易发生在女性、腺癌、不吸烟者的NSCLC患者中，与临床病理特征密切相关。

尽管本研究与之前的部分研究不一致，但EGFR基因突变在原发瘤体与转移灶之间的异质性研究结果也能为针对EGFR基因的靶向治疗提供一些思考，对于在靶向治疗前基因检测标本的选择，特别是EGFR基因突变在原发瘤体与转移灶之间的差异是否影响EGFR-TKI治疗的效果有待进一步的研究。

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（2016-03-25收稿）

（2016-05-025修回）

（编辑：杨红欣校对：孙喜佳）

Epidermal growth factor receptor mutations in primary tumors，N2 lymph nodes，and plasma samples in Chinese patients with stageⅢA-N2 non-small cell lung cancer

Zhe LI1，Jianfeng GUO1，Yang YANG1，Yanfeng LIU1，Ruibin XU1，Tiehua RONG2，Lanjun ZHANG2
Correspondence to：Lanjun ZHANG；E-mail：zhlanj@mail.sysu.edu.cn
1Department of Thoracic Surgery，Yan'an University Affiliated Hospital，Yan'an 716000，China；2Department of Thoracic Surgery，State Key Laboratory of Oncology in South China，Sun Yat-Sen University Cancer Center，Guangzhou 510060，China

AbstractObjective：Mutations in epidermal growth factor receptor（EGFR）can predict tumor response to tyrosine kinase inhibitors （TKIs）in non-small cell lung cancer（NSCLC）.However，not all cases of NSCLC with EGFR mutations can respond well；thus，discovering the heterogeneity of NSCLC at the molecular level is necessary.This study aimed to determine the discrepancy in EGFR mutations in primary tumors，N2 lymph nodes，and plasma samples.Methods：Primary tumors，N2 lymph nodes，and plasma samples obtained from 49 patients with stageⅢA-N2 NSCLC were analyzed for EGFR mutations in exons 19 and 21 by using mutant-enriched liquidchip technology.Results：In 49 patients，we detected 18（36.7%）EGFR mutations in primary tumors，11（22.4%）mutations in N2 lymph nodes，and 2（4.1%）mutations in plasma samples.Eleven（22.4%）cases showed discordance in EGFR mutations between primary tumors and N2 lymph nodes.In nine cases，EGFR mutations were detected only in primary tumors，whereas EGFR mutations were detected only in N2 lymph nodes in two cases.In addition，EGFR mutations were detected in the plasma samples of two patients，who also carry mutations in their primary tumors.Conclusion：A considerable proportion of NSCLC cases showed discrepancy in EGFR mutations between primary tumors and N2 lymph nodes.In addition，the detection rate of EGFR mutations was lower in plasma samples obtained from patients with stage IIIA-N2 NSCLC.All of the results indicated tumor heterogeneity at the molecular level during metastasis，and this heterogeneity may have implications during treatment with TKIs.

Keywords：non-small cell lung cancer，epidermal growth factor receptor，gene mutation，mutant-enriched liquidchip technology

doi：10.3969/j.issn.1000-8179.2016.12.347

作者单位：①延安大学附属医院胸外科（陕西省延安市716000）；②中山大学肿瘤防治中心胸科，华南肿瘤学国家重点实验室

通信作者：张兰军zhlanj@mail.sysu.edu.cn

作者简介

李喆专业方向为胸部肿瘤临床与实验研究。E-mail：shuangjixiu@126.com

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