阻断CLC-3氯通道对结直肠癌细胞株生存率和侵袭转移能力的影响及其分子机制*

王艳萍　姬林松　樊宏伟　向晓辉　徐威



阻断CLC-3氯通道对结直肠癌细胞株生存率和侵袭转移能力的影响及其分子机制*

王艳萍①姬林松②樊宏伟①向晓辉③徐威③

摘要目的：通过研究CLC-3在结直肠组织中的表达，探讨CLC-3对结直肠癌细胞株SW480、SW620的细胞生存率、侵袭转移能力的影响及其潜在的机制。方法：采用RT-PCR方法测定不同分期结直肠癌组织和正常结直肠组织中CLC-3的mRNA表达水平。运用CLC-3阻断剂DIDS、NPPB阻断SW480、SW620细胞的CLC-3表达后，采用CCK-8法实验检测细胞生存率，细胞侵袭实验检测细胞侵袭转移情况；并采用免疫印迹法测定阻断CLC-3表达后SW480、SW620细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达。结果：结直肠癌组织中CLC-3 mRNA表达水平高于结直肠炎黏膜组织和正常结直肠组织（P<0.05），且CLC-3 mRNA表达和结直肠分期相关。抑制CLC-3表达后，SW480、SW620细胞的生存率和侵袭转移能力降低（P<0.05），且β-catenin、C-myc、cyclin D1、Ki-67、survivin表达降低（P<0.05）。结论：CLC-3高表达与结直肠的发生发展有潜在联系，其机制可能与Wnt/β-catenin有关，为CLC-3作为治疗结直肠癌的潜在新靶点提供实验基础。

关键词CLC-3结直肠癌Wnt/β-catenin细胞生存率侵袭转移

作者单位：①南阳市中心医院消化科（河南省南阳市473000）；②骨科；③中国人民武装警察部队后勤学院附属医院肝胆外科

*本文课题受国家自然科学基金（编号：81500489）资助

结直肠癌是全球高发肿瘤之一，并且近年来发病率以4.2%的速度递增［1］。结直肠癌病因尚未明确，容易发生转移，预后差，病死率逐年递增。结直肠癌的发生与发展涉及多基因参与、多因素相互作用，癌基因和抑癌基因之间相互作用的失常导致细胞的恶性增殖产生癌变。容积调节性氯通道（volume regu⁃lated chloride channel，VRCC）是一类广泛分布于哺乳动物组织和细胞的阴离子通道，在调节细胞容积、免疫反应、细胞膜电位、胞内酸碱平衡以及细胞的增殖、分化和凋亡等过程中发挥了重要作用［2］。近年来的研究已证实CLC-3氯通道蛋白是VRCC的分子基础，使用CLC-3氯通道的阻断剂如4，4'-二异硫氰基芪-2，2'-二磺酸（4，4′-diisothiocyanatostilbene-2，2'-disulfonic acid disodium salt hydrate，DIDS）、5-硝基-2-（3苯丙氨基）苯甲酸（5-nitro-2-（3-phenylpropyl⁃amino）benzoic acid，NPPB）可以抑制人宫颈癌细胞、骨肉瘤细胞、成纤维细胞、T淋巴细胞、内皮细胞等细胞增殖，阻断细胞周期G1/S转换，产生G1/S阻滞［3-6］，提示CLC-3氯通道参与了肿瘤细胞增殖的过程。本研究重点探讨CLC-3与结直肠癌细胞的内在联系，以及可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源选取2013年6月至2015年6月在南阳市中心医院结直肠活检和手术切除的标本80例，其中结直肠癌60例，术前液基细胞检测正常、术后病理证实为正常结直肠组织标本20例。患者临床资料显示，结直肠癌患者平均年龄（53.8±7.4）岁，男性38例、女性22例；T分期：T1期6例，T2期20例，T3期34例。正常结直肠患者（normal，N）平均年龄（48.6± 6.3）岁，男性12例、女性8例。结直肠癌患者无其他病理因素影响，3个月内未进行化疗。所有标本及临床资料的收集均征得患者或家属同意并签署了知情同意书。所得的组织一部分进行病理组织学观察，一部分冻存于液氮罐保存。

1.1.2 主要抗体和试剂胎牛血清（fetal bovine se⁃rum，FBS）、RPMI 1640培养基购于美国Gibco公司；DIDS、NPPB购于美国Santa Cruz公司；SW480、SW620细胞株购于中国科学院上海细胞库；β-catenin、C-myc、cyclin D1、Ki-67、survivin抗体购于美国Santa cruz公司；人工基底膜胶购于美国biosciences clintyech公司；CCK-8试剂盒购于广州赖德生物科技有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR检测各种组织中CLC-3的表达取正常结直肠组织、结直肠癌组织各60 mg，按照Trizol说明书提取总RNA，运用紫外分光光度仪测定RNA样品的OD280值并定量。以逆转录酶催化合成cDNA，并在聚合酶催化下进行PCR扩增。扩增条件为94℃1 min，60℃30 s；72℃45 s，共35个循环；72℃延长10 min，4℃终止反应。在2.0%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统上自动成像并进行定量分析。PCR的引物序列如下：CLC-3的上游引物序列为5'-TC⁃CATATGCCTGTGGCTCTG-3'，下游引物序列为5'-CTGAGGCAGCTGATAGCACCT-3'；β-actin的上游引物序列为5'-TTGTTTTCTGCGCAAGTTAG-3'，下游引物序列为5'-ACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3'。以βactin为内参，目的基因cDNA条带积分吸光度值与βactin条带积分吸光度值之比为所测mRNA表达的相对值。

1.2.2 免疫组织化学染色法检测各种组织中CLC-3的蛋白表达，将结肠组织切片置于二甲苯中脱蜡，依次放入无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中进行洗涤脱水，置于3%过氧化氢溶液10 min，封闭，加入CLC-3抗体，4℃过夜，显色。苏木素复染，返蓝，乙醇脱水，置于二甲苯中浸泡，加入中性树胶，封片晾干。根据染色细胞所占面积和细胞染色强度两项指标进行综合评分判断。综合评分为（染色细胞分数+细胞染色强度分数）/2，0～0.5分为（-）；0.5～1.5分为（+）；1.5～2.5分为（++）；>2.5分为（+++）。

1.2.3 细胞培养与药物处理SW480、SW620细胞培养于含10%FBS的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。取对数生长期细胞，分别加入DIDS（100 μM）和NPPB（100 μM），孵育48 h。1.2.4 CCK-8法测定细胞生存率将SW480、SW620细胞分别培养至对数期，以2×104/mL密度加入100 μL 96孔培养板中，给予DIDS、NPPB处理48 h后，加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养4 h。选择450 nm波长，检测各孔光密度（optical den⁃sity，OD）值，计算细胞生存率。

1.2.5 细胞侵袭实验在Transwell小室的下室加入上清200 μL RPMI 1640培养基，上下室之间铺直径为13 mm、孔径为8 μm聚碳酸酯微孔滤膜，膜上均匀铺50 μg/孔的人工基底膜胶，37℃温箱中聚合30 min。在上室中加入含5×106/mL细胞悬液400 μL，37℃、5%CO2孵育箱中放置12 h。吸去上室液体，擦去膜表面未侵袭的细胞及Matrigel，生理盐水漂洗，甲醇固定30 min，常规H&E染色。计数显微镜（×200）视野下的穿膜细胞数，取其平均值，进行统计学分析。1.2.6免疫印迹法检测相关蛋白表达SW480、SW620细胞经过相应处理后，使用细胞裂解液裂解细胞并离心收集上清蛋白，以BSA蛋白定量法对总蛋白进行蛋白质定量。随后于100℃水浴中变性5 min，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，卸下分离胶覆上硝酸纤维膜进行电转，封闭液封闭后，孵育相应抗体过夜，继而室温孵育对应的HRP标记Ⅱ抗1 h，用ECL试剂盒显影并用X片感光冲洗，胶片用凝胶成像系统扫描灰度值分析。

1.3 统计学分析

数据处理采用SPSS 13.0软件。结果以均数±标准误（mean±SEM）表示，采用Bonferroni校正的t检验统计组间差异，采用Pearson相关性检测进行回归性分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠组织中CLC-3 mRNA表达水平检测

采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测正常结直肠组织和结直肠癌组织中CLC-3 mRNA表达。结果表明结直肠癌组织中CLC-3 mRNA水平明显高于正常结直肠组织，差异具有统计学意义（P<0.05），随着结直肠癌T分期的增高，CLC-3的mRNA水平逐渐增加，相关性分析表明两者间呈正相关，并具有统计学意义（P<0.05，图1）。

图1 正常结直肠组织和结直肠癌T1期、T2期、T3期结直肠组织中CLC-3的表达Figure 1 mRNA expression of CLC-3 in the CRC and normal colorectal tissues detected by RT-PCR

2.2 正常结直肠组织和结直肠癌T1期、T2期、T3期结直肠组织中CLC-3的蛋白表达水平检测

采用免疫组织化学检测正常结直肠组织和结直肠癌组织中CLC-3的蛋白表达。结直肠癌组织中CLC-3的蛋白表达明显低于正常结直肠组织（P< 0.05），随着结直肠T分期的增高，CLC-3的免疫组织化学染色逐渐增强，表明CLC-3的蛋白表达逐渐增加，相关性分析表明两者具有相关性，并具有统计学意义（P<0.05，图2，表1）。

2.3 SW480、SW620细胞生存率检测

采用CCK-8法分别检测SW480、SW620细胞生存率，结果表明采用CLC-3阻断剂DIDS、NPPB后，SW480、SW620细胞生存率明显降低，其中NPPB的作用更为显著，两抑制剂与对照组相比差异均具有统计学意义（均P<0.05，图3）。

2.4 SW480、SW620细胞侵袭转移检测

Transwell小室实验结果显示，分别使用100 μM DIDS和100 μM NPPB孵育SW480细胞48 h后，细胞侵袭转移数明显减少，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）；同样DIDS和NPPB也均可明显抑制SW620细胞的侵袭转移能力（P<0.05）。结果表明阻断CLC-3后可抑制结直肠癌细胞株SW480、SW620细胞的侵袭迁移能力（图4）。

2.5 SW480、SW620细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的检测

免疫印迹实验结果表明，孵育了DIDS和NPPB后，SW480、SW620细胞中β-catenin、C-myc、cyclin D1、Ki-67、survivin的蛋白表达均明显降低，与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05，图5）。

图2 正常结直肠组织和T1期、T2期、T3期结直肠癌组织中CLC-3的蛋白表达（IHC×400）Figure 2 The protein expression of CLC-3 in the CRC tissue and normal colorectal tissues examined by immunohistochemistry（IHC×400）

表1 各结直肠组织中CLC-3的蛋白表达Table 1 Protein expression of CLC-3 in the CRC and normal colorectal tissues

图3 DIDS、NPPB对SW480、SW620细胞生存率的影响Figure 3 Effect of DIDS and NPPB on the viabilities of SW480 and SW620 cells detected by CCK-8 assay.n=6；*P<0.05 vs.control

图4 DIDS、NPPB对SW480、SW620细胞迁移率的影响Figure 4 Effect of DIDS and NPPB on the migration of SW480 and SW620 cells.Mean±SD

图5 DIDS、NPPB对Wnt/β-catenin信号通路的作用Figure 5 Effect of DIDS and NPPB on the protein expression related to the Wnt or β-catenin signaling pathway in the SW480 and SW620 cells

3 讨论

结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率占所有恶性肿瘤的10%～15%，且呈逐年上升趋势。同时结直肠癌的死亡率仅次于肺癌和肝癌，居我国恶性肿瘤第3位［1］。研究认为结直肠癌高发病率和死亡率的主要原因是结直肠癌细胞具有持续的增殖能力和难以控制的转移特性，快速生长的癌细胞不断消耗人体大量营养物质，进而破坏人体组织器官的功能，最终导致人体超出负荷而死亡［7］。目前关于结直肠癌的研究证据还不足以阐明其发病机制。因此从分子水平深入揭示结直肠癌细胞异常增殖机制，对于探讨结直肠癌的癌变机制和降低结直肠癌患者死亡率具有重要意义。

细胞离子通道的结构和功能正常是维持生命过程的基础，主要类型有钾、钠、钙、氯和非选择性阳离子通道。近来的研究发现，离子通道参与肿瘤、心血管疾病、神经降解性疾病及炎症性疾病等多种疾病的发生发展［8］。CLC-3氯通道作为VRCC分子基础［6］，广泛分布于脑、心肌、肝脏及脉管系统等机体各器官组织，对调控细胞增殖、凋亡，维持细胞容积，调节肌张力及细胞兴奋性等生理过程发挥重要作用［4］。更为重要的是，已有研究证实CLC-3在肠道组织有表达并参与调控肠道炎症反应［2，9］。但目前关于CLC-3在结直肠癌组织中的表达及其分子意义的报道少之又少。本研究运用RT-PCR方法检测CLC-3在结直肠癌组织中的表达情况，并探讨该分子在不同分期的结直肠患者组织中的表达变化。结果发现，结直肠癌患者组织中CLC-3 mRNA表达水平明显高于正常结直肠组织，而且随着T分期的增高，其表达水平逐渐增加，说明CLC-3的表达与结直肠癌的恶化程度呈明显的相关性。进一步使用VRCC特异性抑制剂DIDS、NPPB阻断CLC-3的表达，观察该分子在结直肠癌细胞增殖和侵袭迁移过程中的分子学意义。CCK-8以及Transwell实验结果显示，阻断CLC-3表达后，结直肠癌细胞SW480和SW620的生存率和迁移能力明显受到抑制，提示CLC-3参与了调控结直肠癌细胞生长和迁移的过程。

Wnt蛋白是一种分泌型糖蛋白，以自分泌和旁分泌方式发挥其生物学效应［10］。研究证实Wnt能与膜受体卷曲蛋白Fz和辅助受体低密度脂蛋白LRP5/6受体家族结合，进而启动Wnt通路。Wnt信号通路一旦激活，将导致β-catenin入核，使细胞质β-catenin减少，直接激活下游基因C-myc、cyclinD1、Ki-67、sur⁃vivin，介导癌细胞的增殖迁移，参与恶性肿瘤的发生发展［11］。本研究为进一步探讨CLC-3阻断剂抑制结直肠癌细胞增殖迁移的可能机制，通过免疫印迹的方法观察了经DIDS、NPPB处理结直肠癌细胞后，Wnt信号通路中重要成员β-catenin及其下游信号通路相关分子C-myc、cyclin D1、Ki-67、survivin的蛋白表达。实验结果发现DIDS、NPPB分别处理了SW480和SW620细胞后，明显下调β-catenin、C-myc、cyclin D1、Ki-67、survivin的蛋白表达，说明阻断CLC-3表达对结直肠癌细胞增殖迁移能力的抑制作用可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。

本研究证实了CLC-3在结直肠癌组织中呈高表达，并随着肿瘤T分期的增高，CLC-3表达也呈上调趋势，提示CLC-3表达与结直肠癌的发生发展有密切关系。通过功能学研究进一步发现阻断CLC-3可抑制结直肠癌细胞的增殖迁移能力，并且该过程可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。该研究有助于了解CLC-3表达增加与结直肠癌发展及转移的关系，为CLC-3成为结直肠癌治疗的新靶点提供实验依据。

参考文献

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（2016-01-16收稿）

（2016-03-14修回）

（编辑：杨红欣校对：张亻抿）

Blockade of CLC-3 chloride channel inhibited the viability and invasion of colorectal cancer cells

Yanping WANG1，Linsong JI2，Hongwei FAN1，Xiaohui XIANG3，Wei XU3
Correspondence to: Linsong JI；E-mail: jilsong@126.com
1Department of Gastroenterology，Nanyang Central Hospital，Nanyang 473000，China；2Department of Orthopaedics，Nanyang Central Hospital，Nanyang 473000，China；3Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Hospital of Logistical College，CPLA，Tianjin 300162，China This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.81500489）

AbstractObjective: To examine the expression of CLC-3 in colorectal tissues and the effect of CLC-3 on the viability and invasion of colorectal cancer（CRC）SW480 and SW620 cells.Methods: The mRNA levels of CLC-3 in CRC cell lines were determined by RT-PCR.CLC-3 expression was inhibited by adding DIDS or NPPB to the CRC cells.Subsequently，cell viability and invasion were assessed by CCK-8 assay and Transwell assay，respectively.In addition，the effects of DIDS and NPPB on the Wnt or β-catenin signaling pathways were determined by Western blot analysis.Results: The mRNA level of CLC-3 was remarkably increased in the CRC tissues compared with that in normal colorectal tissues（P<0.05）and was positively correlated with the T stage of CRC.The blockade of CLC-3 inhibited the viability and invasion of CRC cells（P<0.05）.The expression of β-catenin，C-myc，cyclin D1，Ki-67，and survivin were evidently reduced by the inhibition of CLC-3（P<0.05）.Conclusion: The inhibition of CLC-3 decreases the cell viability and invasion of CRC cells by reducing the expression of the proteins related to the Wnt or β-catenin signaling pathway.

Keywords:CLC-3，colorectal cancer，Wnt/β-catenin signaling pathway，cell viability，invasion

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.09.065

通信作者：姬林松jilsong@126.com

作者简介

王艳萍专业方向为消化道肿瘤的治疗。

E-mail：nywylin@yeah.net

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