高危型HPV载量与分型检测对宫颈高级别病变预测价值的前瞻性队列研究*

李凌　李隆玉　杨起楠　徐小玲　童希忠　王利民



高危型HPV载量与分型检测对宫颈高级别病变预测价值的前瞻性队列研究*

李凌①李隆玉①杨起楠②徐小玲③童希忠④王利民⑤

摘要目的：评价高危型人乳头瘤病毒（high risk human papillomavirus，hrHPV）载量和分型检测在中国农村地区妇女人群中预测宫颈鳞状上皮高级别病变发生的价值。方法：2012年5月至2015年5月以农村妇女人群为基础选取江西省兴国县、靖安县和玉山县2 257例，年龄35～64岁纳入本前瞻性队列研究。同时采用HC-2（hybrid capture-2）和导流杂交技术（HybriMax）两种方法分别检测hrHPV载量和亚型，两种方法中任一亚型阳性者行阴道镜及活检检查，并将HC-2检测阳性结果中病毒载量<10.0 RLU/CO认定为低病毒载量，病毒载量≥10.0 RLU/CO为高病毒载量。对hrHPV结果阴性或病理诊断为CIN1的2 211例妇女行24个月无干预随访。根据随访分别评价hrHPV载量和HybriMax分型两种检测方法预测宫颈鳞状上皮高级别病变（CIN grade 2 or worse，CIN2+）的效果。结果：纳入基线、随访数据完整的女性共1 636例。2年内采用HC-2检测的132例基线高病毒载量妇女中CIN2+的发生率为3.03%（4/132），其相对危险度（RR）值为42.24（95%CI为4.76～375.2）；采用HybriMax分型检测的159例基线分型HPV16或18型阳性妇女中CIN2+的发生率为2.51%（4/159），RR值为33.06（95%CI为3.72～293.9）。对2年内HC-2检测中高病毒载量例数和HybriMax分型检测中HPV16/18型别阳性例数进行比较，CIN2+的发病率差异无统计学意义（P>0.05）。结论：HPV高载量和HPV16/18型别阳性妇女人群进展为CIN2+的风险均较高。在不具有持续监测hrHPV条件的农村地区，HC-2检测的病毒载量≥10.0 RLU/CO阈值设定，与HybriMax分型检测HPV16/18型别均对hrHPV初筛有分流作用，并对CIN2+发生有预测作用。

关键词病毒载量病毒亚型高危型人乳头瘤病毒子宫颈癌前病变农村地区

作者单位：①江西省妇幼保健院肿瘤科（南昌市330006）；②南昌大学医学院临床医学系；③江西省靖安县子宫颈癌防治研究所；④江西省玉山县妇幼保健院；⑤江西省兴国县妇幼保健院

*本文课题受中国抗癌协会贫困地区癌症救助试点项目资助

高危型人乳头瘤病毒（high risk human papilloma⁃virus，hrHPV）是子宫颈癌的主要致病因素，故hrHPV检测作为子宫颈癌筛查的重要方法已被广泛认可［1］。2014年我国“两癌”检查项目中也开始引入了hrHPV初筛方案。然而，全球大约80%女性在50岁之前都曾感染过HPV，其中绝大多数感染可自限性清除，仅10%左右发生持续性感染，最终只有约1%逐步进展为子宫颈癌［2］。因此，仅根据hrHPV检测阳性作为子宫颈癌高危人群判断标准不符合人群筛查的成本-效益原则，HPV检测的真正目的是发现危险人群，而不是简单地检查出感染者。特别是在无条件多次监测HPV感染的卫生资源匮乏地区，如何筛查出真正的危险人群，以及hrHPV初筛阳性者分流方法的探索是目前研究的热点。研究发现，hrHPV病毒载量和不同亚型是造成宫颈病变不同转归的重要因素［3-5］。

临床上对于初筛hrHPV阳性、病理诊断阴性或CIN1者进行随访有一定困难，尤其在落后的农村地区，妇女能坚持随访的可能性较小［6］，易造成延误治疗或过度治疗。本研究为前瞻性队列研究，针对同一筛查人群同时行病毒载量和分型检测，对hrHPV初筛阳性、病理阴性或CIN1者行24个月的无干预随访，评估其预测CIN2+的价值，以期更精准地筛查出危险人群和为hrHPV初筛阳性者分流策略提供参考。

1 材料与方法

1.1 资料来源

以2012年5月至2015年5月江西省兴国县、靖安县和玉山县农村妇女为基础，采取整群抽样的方法在每个县选择1个乡镇，每个乡镇各选择8～10个自然村，年龄35～64岁符合入选标准人群均纳入队列研究。入选标准：1）有性生活史；2）既往无子宫颈癌病史；3）非妊娠期；4）具有生理学上完整的宫颈；5）可以理解并签署知情同意书，健康和认知状况良好；6）近5年内未接受过子宫颈癌筛查；7）可以接受宫颈检查。项目中初次基线筛查妇女为2 257例，2年后对初次基线筛查hrHPV病理阴性或CIN1的2 211例妇女进行随访，实际完成随访且资料完整者1 636例（74.0%），失访或退出队列者共575例（图1）。

图1 筛查流程示意图Figure 1 Flow chart of screening

1.2方法

1.2.1 基本信息以我国“两癌”筛查项目为基础，收集研究对象的基本信息，包括人口学信息、既往病史、性行为史和月经生育史等。对全部研究对象的子宫颈癌筛查采用HC-2（hybrid capture-2）和导流杂交技术法（HybriMax）两种检测方法，分别检测hrHPV载量和亚型。HC-2检测以病毒载量≥1.0 RLU/CO （relative light unit/cut off ratio）为阳性，15种型别（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82）中HybriMax检测出任一亚型为阳性。两种检测方法结果中任一阳性者、均阴性者随机取10%受检者行阴道镜活检检查。如阴道镜未发现明显异常，则行四象限活检加颈管刮术送病理检查。全部活检组织由江西省妇幼保健院病理科进行制片和双人独立阅片，病理诊断结果采用CIN命名系统。根据病理结果分为病理阴性组、CIN1组、CIN2组和CIN3+组（CIN3及以上病变），对初次基线子宫颈癌筛查结果阴性或病理诊断为CIN1的2 211例妇女行24个月的无干预随访。随访时全部研究对象均行阴道镜检查，方法同初次基线子宫颈癌筛查。

1.2.2 hrHPV DNA的检测1）HC-2技术基本实验原理是采用基因杂交化学发光-信号放大技术。可同时检测13种hrHPV（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型），但不提供具体型别信息。HC-2提供病毒载量的测定信息，当病毒载量≥1.00 RLU/CO为阳性，病毒载量<1.00 RLU/CO为阴性。样本中HPV DNA载量越高，病毒载量也越高。本研究中根据hrHPV的病毒载量分为阴性组（病毒载量<1.00 RLU/CO）、低载量组（病毒载量为1.00～9.99 RLU/CO）和高载量组（病毒载量≥10.00 RLU/ CO）。2）HybriMax方法采用HPV核酸扩增分型检测试剂盒（广东凯普生物科技股份有限公司）进行分型检测，15种hrHPV型别为HPV 16、18、31、33、35、39、 45、51、52、56、58、59、68、73和82型，可提供hrHPV具体型别信息，但不提供病毒载量值。如统计含有HPV16/18型的混合感染者时计入HPV16/18型感染组，反之计入其他13种型别感染组。上述两种HPV检测均在江西省妇幼保健院进行。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。初次筛查的HPV和病理结果采用χ2检验分析；进展为CIN2+作为观察的终点，采用Logistic回归分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 初次基线子宫颈癌筛查的检测结果

以农村妇女为主，2 257例纳入研究并完成初次基线筛查，平均年龄为（43.67±7.96）岁，平均随访时间为（24.74±1.34）个月。2 257例中筛查1 547例（68.54%），1 547例筛查时已绝经妇女为875例（38.77%），平均绝经年龄为（49.56±4.12）岁。

2.2 初次基线HPV检查结果和不同宫颈病变分布

对完成初次基线筛查的2 257例行HC-2检测，HPV阳性率为13.16%（297/2 257）。随着病变严重程度的增加，病毒高载量的女性比例亦增加，其中病理阴性组高载量女性比例为4.07%（86/2 114）、CIN1组为31.96%（31/97）、CIN2 +组为69.57%（32/46）。CIN2+组与病理阴性组和CIN1组高载量女性比例的差异均具有统计学意义（均P<0.01，表1）。

对完成初次基线筛查的2 257例行HybriMax分型检测，HPV阳性率为15.82%（357/2 257）。高级别病变中感染HPV16/18型的女性比例最高，其中病理阴性组中感染HPV16/18型比例为4.92%（104/2 114）、CIN1组为39.17%（38/97）、CIN2+组为47.83%（22/46）。CIN2+组与病理阴性组中感染HPV16/18型比例的差异具有统计学意义（P<0.001），但与CIN1组比例的差异无统计学意义（P=0.327，表2）。

表1 2 257例女性初次基线筛查的hrHPV载量与宫颈病变程度的关系　例（%）Table 1 Relationship of cervical lesions with hrHPV load of 2，257 women at baseline n（%）

2.3初次基线筛查hrHPV结果对宫颈高级别病变预测效果的比较

随访2年后，初次基线筛查病理阴性和CIN1者中随着病毒载量的升高，CIN2+发生风险也随之升高，相对危险度也随之增大。病毒高载量组中CIN2+累积发生率为3.03%（4/132），明显高于低载量组0.91%（1/110）和阴性组0.07%（1/1 394）；病毒高载量组中CIN2+发生风险是阴性组的42.24倍（RR为42.24，95%CI为6.2～316.7），低载量组中CIN2+发生风险是阴性组的12.67倍（RR为12.67，95%CI为 1.2～46.5）。初次基线筛查病理阴性和CIN1者中HPV16/18型别组CIN2+累积发生率为2.51%（4/159），高于HPV其他13种型别的1.84%（3/163）和阴性组0.08%（1/1 314）；HPV16/18型别组中CIN2+发生风险是阴性组的33.06倍（RR为33.06，95%CI为6.2～316.7），其他HPV的13种型别中CIN2+发生风险是阴性组的24.18倍（RR为24.18，95%CI为3.1～182.5）。hrHPV病毒高载量组和HPV16/18型别组的CIN2+累积发生率的差异均无统计学意义（P>0.05，表3）。

表2 2 257例女性初次基线筛查的hrHPV感染亚型与宫颈病变程度的关系　例（%）Table 2 Relationship of cervical lesions with type-specific hrHPV of 2，257 women at baseline n（%）

表3 1 636例初次基线筛查病理阴性和CIN1女性随访24个月的结果Table 3 Histological outcome of the initial pathological screening of 1，636 women with normal biopsy and CIN1 at baseline after a follow-up of 24 months

3 讨论

hrHPV检测作为子宫颈癌初筛方法可在尚未建立细胞学筛查体系的国家和地区应用，这一点已被广泛认同［5，7］。2013年WHO发布的《子宫颈癌前病变筛查和管理指南》也建议在有条件采用HPV检测的地区使用该方法进行子宫颈癌的初筛。本研究初次基线HPV检测中不论是HC-2还是HybriMax方法对CIN2+病变检测的灵敏度和特异度均较高，与大部分文献报道相近［1，3，5］。本研究中三个筛查现场是我国“两癌”筛查HPV检测试点项目县，结果同时再次验证了hrHPV检测作为子宫颈癌初筛的方法，效果是肯定的。

人群中大量的HPV一过性感染并不会造成子宫颈癌和癌前病变，所以hrHPV检测在子宫颈癌筛查中的主要意义是筛查出需要干预的风险人群［8］，初筛阳性后的分流是解决这个问题的一种方法。ASCCP筛查指南（2015年）指出，管理hrHPV阳性女性的方法是采用HPV16/18型分流。高危人群中的HPV感染的危害性更多是与病毒持续感染有关，而非一过性的HPV感染，所以HPV感染的持续监测更为重要。在中国广大的经济欠发达农村地区，持续感染的监测是需要资金支持，在卫生资源匮乏地区hrHPV阳性人群分流方法一直受到关注。Schlecht等［9］于1993年至1997年对巴西2 081例妇女行HPV载量与高级别病变的前瞻性队列研究中发现，HPV DNA> 1 000拷贝数/细胞可作为预测HPV持续感染和病情进展的危险因素。本研究通过初次基线筛查检测hrHPV载量和hrHPV亚型，随访2年的结果显示，采用HC-2方法将阳性患者的病毒载量分为低载量组（hrHPV载量为1.00～9.99 RLU/CO）和高载量组（hrHPV载量≥10.00 RLU/CO）时，对CIN2+发生风险可以得到良好的预测效果（RR为42.24，95%CI为6.2～316.7），这与HPV16/18型别分流的预测效果基本一致（RR为33.06，95%CI为3.1～182.5）。在中国农村地区的研究也证实了病毒载量阈值的设定对CIN2+有预测能力，但该研究中并未与HPV分型的分流效果进行比较［4］。对于hrHPV分型检测，大量的研究发现HPV16/18型别在高级别病变中所占比例最大，并已达成基本一致的共识［10-12］。

我国于2009年启动了针对农村地区妇女的“两癌”筛查项目，但是以细胞学和肉眼观察作为初筛方式的筛查方案因缺乏完善的质控体系而效果不甚理想［6，13］，hrHPV检测作为重要的筛查方法进入“两癌”筛查项目已迫在眉睫。目前对于hrHPV初筛后阳性者的分流方法还无统一的方案，而我国子宫颈癌疾病的负担主要来自于农村经济欠发达地区［14］，所以本研究针对江西农村地区同一人群的病毒载量和亚型进行分析，比较hrHPV载量和hrHPV亚型检测对预测高级别病变的发生，并以期发现真正的风险人群，为hrHPV初筛阳性患者的管理提供参考，特别是为缺少资金以早期干预监测hrHPV持续感染的落后地区的妇女提供科学依据。本研究发现，将hrHPV检测阈值设定为病毒载量≥10.0 RLU/CO和HPV16/ 18分型检测均对hrHPV初筛有良好的分流作用，并对CIN2+发病有一定的预测价值，hrHPV载量和hrH⁃PV亚型预测效果差异无统计学意义。

本研究所选取的江西省农村筛查现场是我国经济落后地区，大量的农村妇女因在外务工而导致26%的失访率，这是本研究的一个不足之处。

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（2016-01-06收稿）

（2016-04-18修回）

（编辑：张亻抿校对：武斌）

Prospective cohort study on the value of high-risk human papillomavirus viral load and subtype tests in predicting cervical intraepithelial neoplasia

Ling LI1，Longyu LI1，Qinan YANG2，Xiaoling XU3，Xizhong TONG4，Limin WANG5
Correspondence to: Longyu LI；E-mail: lilongyu1103@sina.com
1Department of Oncology，Jiangxi Maternity and Child Hygiene Hospital，Nanchang 330006，China；2Medical College of Nanchang University，Nanchang 330000，China；3Cervical Cancer Prevention Institute of Jing'an County，Jing'an 330600，China；4Yushan County Maternity and Child Hygiene Hospital，Tonggu 334700，China；5Xingguo County Maternity and Child Hygiene Hospital，Xingguo 342400，China This work was supported by the Ministry of Civil Affairs and Chinese Anti-Cancer Association Cervical Cancer Prevention Research Project in Jiangxi Province

AbstractObjective: To evaluate high-risk human papillomavirus（hrHPV）genotyping and viral load in predicting CIN（cervical intraepithelial neoplasia（CIN）grade 2 or worse in a Chinese rural area population with limited health resources.Methods: We performed a population-based prospective study and enrolled 2，257 women aged 35 to 64 years from three rural screening sites of Jiangxi province.We conducted a hybrid capture（HC-2）assay to predict viral load.A HC-2 relative light unit（RLU）threshold of 10 was set to differentiate samples between low（<10）and high（≥10）viral loads.We also carried out a HybriMax test to detect different hrHPV genotypes in the samples.Women exhibiting positive HC-2 or HybriMax results underwent colposcopy and colposcopically directed biopsy.Women with negative or positive hrHPV test results but with normal biopsy or CIN1 were followed-up for 24 months without intervention（n=2，211）.We used histopathological findings as outcome.Results: Of the 2，211 women，1，636 provided complete follow-up data.Of the 132 women with a high viral load，4（3.03%）developed CIN2+ in the same period.The relative risk（RR）of CIN2+ for HC-2 positivity at baseline was 42.24（95%CI=4.76-375.2）.Of the 159 women who were positive for HPV16 or HPV18 upon screening，4（2.52%）progressed to CIN2+（RR=33.06，95%CI=3.72-293.9）.The 2-year cumulative incidence rates of CIN2+ did not significantly differ between the high viral load group and the HPV16/18 group.Conclusion: The risks of CIN2+ progression were higher among women with a high viral load or HPV16/18 positivity than among women with negative hrHPV.Increasing the HC-2 cut-off value to 10 RLU or using HPV16/18 positivity may be similarly used to triage hrHPV-positive women for immediate colposcopy and comprehensive follow-up.Both approaches were equally predictive of the CIN2+ risk in rural area.Increasing the HC-2 cut-off value to 10 RLU may also help allocate health resources effectively.

Keywords:virus load，subtypes，hrHPV，precancerous cervical lesions，rural area

doi:10.3969/j.issn.1000-8179.2016.09.018

通信作者：李隆玉lilongyu1103@sina.com

作者简介

李凌专业方向为妇科肿瘤与宫颈癌及癌前病变的人群防治等。

E-mail：lilingjxnc@hotmail.com

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