天花粉蛋白对肺癌A549细胞凋亡及细胞骨架微管结构改变的研究*

庄 静 孙长岗 汪丛丛 冯福彬 吕庆亮 王华庆 吴勉华

天花粉蛋白对肺癌A549细胞凋亡及细胞骨架微管结构改变的研究*

庄 静①孙长岗②汪丛丛③冯福彬③吕庆亮③王华庆④吴勉华①

目的：探讨天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）对肺癌A549细胞株抑制增殖作用及诱导凋亡效应。方法：用不同剂量的TCS处理肺癌A549细胞，采用MTT法检测TCS对细胞增殖的抑制作用，透射电镜观察细胞骨架微管的变化，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率。结果：TCS使肺癌A549细胞呈凋亡型改变，细胞活性下降，且随着浓度的升高、时间的延长抑制率相应升高。结论：药理剂量的TCS可抑制肺癌A549细胞的增殖和分化，并通过细胞骨架的变化影响A549细胞的功能。

天花粉蛋白 肺癌 凋亡 细胞骨架

1Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210023;2Department of Oncology,Weifang Institute of Traditional

Chinese Medicine,Weifang 261041;3Weifang Medical University,Weifang 261000;4Tianjin Medical University Cancer Hospi

tal,Tianjin 300060,China

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant No.81273987)and the Youth Item of Natu

ral Science Foundation of Shandong Province(Grant No.ZR2013HQ005)

现代研究发现，肺癌是一类生物行为十分复杂的恶性疾病，其生物学行为的多样性决定了临床体征的有无、轻重以及出现的顺序。随着对肺癌病生理机制认识的逐渐深入，以及靶向治疗和个体化治疗的临床应用，肺癌的诊治水平取得了长足的进步。目前肺癌的治疗已进入规范化、个体化、综合治疗时代，综合疗法是其临床疗效有所提高的关键措施［1］。传统中医中药在肺癌的治疗中显示出优势和潜力，但对其抗癌机理尚缺乏明确的基础医学阐述和系统的总结，影响了相关中药效能机制的挖掘和临床应用的普及推广。天花粉作为我国传统中草药，TCS是其最有效提取成分，具有抗肿瘤、提高机体免疫力、抗人体免疫缺陷等多种功效［2］。本研究旨在通过观察TCS对人肺癌A549细胞的增殖、凋亡及细胞骨架微管结构改变的影响，探讨TCS可能的抗肿瘤机理，为其广泛普及提供更多的实验基础和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

人肺癌细胞株A549购自上海普林斯顿生物科技发展有限公司试剂部；天花粉蛋白注射液（1.2mg/mL）购自上海金山制药有限公司；RPMI-1640培养基购自美国Sigma公司；MTT购自Serva公司；二甲基亚砜（DMSO），购自四季青公司；Hoechst33258染色液，碘化丙啶（PI）购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 采用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，常规37℃、5%CO2，培养箱中静置培养。

1.2.2 MTT试验测细胞增殖变化 在96孔培养板中接种细胞，37℃培养24 h后实验组加入不同浓度的天花粉蛋白注射液，培养人肺癌细胞株A549 24 h；空白对照组不加培养液。加药后分别于24、48、72、96 h加入20 μL MTT，继续放入培养箱孵育4 h后吸出培养液，加入150 μL DMSO震荡溶解10 min，空白对照调零，酶联仪检测波长490 nm测定各孔的吸光值（630 nm校准），记录实验结果并计算抑制率。抑制率（%）=（阴性对照组OD值-实验组OD值）/阴性对照组OD值×100%。

1.2.3 流式细胞术测定细胞周期变化 取对数生长期细胞，在培养基中分别加入0、20、40、80 μg/mL 4种浓度的TCS，继续培养24 h，胰酶适度消化细胞，吹打、离心、漂洗后，打入（预冷）乙醇中，封口膜封口，4℃固定过夜，收集固定细胞，再次冲洗。加RNase-A 37℃水浴消化30 min，加PI（碘化丙锭），在冰浴中避光染色30 min，用300目尼龙网过滤，上机检测。流式细胞仪激发光波长488 nm，用ModiFit软件分析。

1.2.4 荧光显微镜观察细胞凋亡 计算凋亡率用Hoechst33258染色液染色，荧光显微镜激发波长350 nm，每组设3个平行样品，每个样品随机观察3～5个视野，共计数200个细胞，计算细胞凋亡率。按下列公式计算结果：细胞凋亡率（%）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。

1.3 统计学处理

所有实验数据均应用SPSS 17.0统计软件进行处理。实验数据采用±s表示，一元方差（One-way ANOVA）分析各组之间的差异；率的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 天花粉蛋白对人肺癌细胞株A549增殖抑制作用

各个浓度的天花粉蛋白注射液作用于A549肺癌细胞株不同时间段，观察细胞增殖抑制情况（表1）。随着天花粉蛋白的浓度的增加，细胞抑制率相应增加，各浓度间差异有统计学意义（P＜0.05）。细胞抑制率同样随着用药时间的延长而增加，且各时间段间差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 TCS对细胞周期的影响

经TCS注射液处理24 h后，观察A549肺癌细胞周期各时相差异有统计学意义，主要表现为S期、G2/M期细胞比例增多，而G0/G1期细胞比例逐渐减少，各组所占比例之间差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。提示TCS能使A549细胞阻滞于细胞分裂周期的前期，从而抑制细胞分裂增殖。

2.3 荧光电镜观察细胞凋亡计算凋亡率

Hoechst33258为一种非嵌入性荧光染料，活细胞能摄取该染料并与DNA结合，使细胞核着色。细胞凋亡后，细胞呈典型凋亡细胞形态：核固缩、染色质凝聚，在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。实验过程中发现，0 μg/mL的空白对照组中很少见细胞凋亡，而随着TCS注射液浓度的增高，细胞的凋亡也增多，表现为蓝色荧光增多（图1）。通过荧光电镜观察0、20、40、80 μg/mL不同浓度组中A549细胞凋亡率分别为6.5%、18.0%、27.5%、47.0%，凋亡细胞数量与含药血清浓度存在相关性。

2.4 电镜观察细胞骨架变化

如图2所示，0 μg/mL空白对照组电镜下观察发现微管蛋白聚集成微管，而80 μg/mL注药组，微管蛋白解聚，可见解聚样微管。说明天花粉蛋白能促进微管的解离，而诱导细胞凋亡。

3 讨论

TCS是从瓜蒌、恬楼等葫芦科植物根块中提取的一种高分子蛋白质，其作为一种天然的有效中药提取物广泛应用于临床治疗［3］。在过去的20年里，TCS作为一种典型的Ⅰ型核糖体失活蛋白（RIPs），其诱导凋亡活性越来越多地被体内外实验证实［4］。然而，部分研究证明［5］，TCS在多种细胞株内可以诱导凋亡，许多与TCS在A链上同源的Ⅱ型RIPs如蓖麻毒素（ricin）、志贺毒素1（shiga toxin 1）和槲寄生凝集素（mistletoe lectin）同样可诱导细胞凋亡。对B链能否存在诱导细胞凋亡功能尚存在争议，但仍需要注意的是A链上特异性靶点对抑制细胞凋亡的影响［6-7］。总体来说，A链参与一连串细胞凋亡效应越来越多的引起重视，应着重研究天花粉蛋白作为RIPs的更多机制，为其临床实践和广泛应用提供更多的理论基础。诸多因素诱导的细胞增殖失控以及凋亡受阻是恶性肿瘤发生乃至最终无限制发展的关键性因素［8］。TCS作为一种传统中药成分可有效地抑制肿瘤细胞凋亡，是目前恶性肿瘤治疗的一种全新治疗手段。TCS作为一种潜在抗癌药物，已显示出优越的抗肿瘤潜力和特点，具有良好的应用前景和使用价值。

细胞分裂是维持肿瘤细胞正常生长、侵袭、扩散和转移的关键因素，是目前肿瘤治疗的热点和主要治疗靶点之一［9］。细胞骨架是一个由蛋白纤维构成的网络结构，所组成的结构体系被称为“细胞骨架系统”，在细胞的生命周期中有着至关重要的作用，同样与宏观生命活动密切相关［10-13］。近年研究发现，细胞骨架与细胞遗传物质的传递与复制、遗传信息的表达，即与细胞的凋亡、分化和癌变等细胞病生理功能的改变有着密切的联系［14-15］。细胞骨架包括微管、微丝、中间丝，三者构成了细胞形态骨架和运动协调系统，在维持细胞形态以及细胞运动等方面起到至关重要的作用。

本研究在证实TCS诱导A549凋亡及增殖抑制的同时，进一步证实了对肺癌A549细胞分裂周期的阻滞作用。TCS对肺癌A549有明显的抑制作用，其作用的程度与TCS的药物浓度及处理时间密不可分。此外，TCS可特异性地将A549肿瘤细胞停滞于分裂的早期，通过阻滞细胞蛋白质合成以及促进肿瘤细胞凋亡而实现了抗肿瘤细胞活性。此外，经天花粉处理后电镜下可见解聚样微管结构，打破原有的解聚-聚合之间的动态平衡状态。而细胞结构的改变又是凋亡细胞形态学的基础，可以认为TCS诱导的细胞骨架改变可能原因是细胞的凋亡。因此，通过对细胞骨架微管结构的微观细胞形态动力学观察，将有助于揭示TCS抗肿瘤的内在机理，寻找其治疗肺癌的具体作用靶点及药理机制，为中医药治疗肿瘤提供科学证据。

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（2014-03-23收稿）

（2014-05-07修回）

（本文编辑：杨红欣）

Effects of trichosanthin on apoptosis and cytoskeleton microtubule structure reconfiguration in lung cancerA549 cells

Jing ZHUANG1,Changgang SUN2,Congcong WANG3,Fubin FENG3,Qingliang LV3,Huaqing WANG4,Mianhua WU1
Correspondence to:Mianhua WU;E-mail:wmh7001@163.com

Objective:This study aimed to explore the effects of trichosanthin on the proliferative inhibition and apoptosis induction in human lung carcinoma A549 cells.Methods:A549 cells were treated with various concentrations of TCS.The inhibitory effects in proliferation were detected by the MTT method.The microfilament changes were observed by transmission electron microscopy. Apoptosis rate and cell cycle were determined by flow cytometry.Results:A549 cells treated with TCS presented apoptotic changes and decreased cell activity.When the concentration increased and time was prolonged,the inhibition rate increased correspondingly.Conclusion:Pharmacological doses of TCS inhibited the proliferation and differentiation in lung carcinoma A549 cells and affected the function inA549 cells by changes in the cytoskeleton.

trichosanthin,lung cancer,apoptosis,cytoskeleton

10.3969/j.issn.1000-8179.20140473

庄静 博士研究生，主治医师。研究方向为中西医结合抗肿瘤。

①南京中医药大学（南京市210023）；②山东省潍坊市中医院；③山东省潍坊医学院；④天津医科大学肿瘤医院

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：81273987）和山东省自然科学基金青年基金项目（编号：ZR2013HQ005）资助

吴勉华 wmh7001@163.com

E-mail：zhuangjing1226@163.com