KLF15和GSTM5在宫颈癌中的表达及其作用机制*

李 君，李 洁，李 鸥,，张瑾瑾，蒋丽利，石琳然，马 冬

(1.唐山中心医院妇科，唐山 063000；2.唐山市工人医院妇产科，唐山 063000；3.华北理工大学公共卫生学院，唐山 063210;4.教育部神经与血管重点实验室，河北医科大学基础医学院，石家庄 050017)

宫颈癌(carcinoma of the cervix,CC)是女性常见恶性肿瘤，中晚期预后较差，发病机制及有效治疗靶点的发现仍然十分重要[1]。Krüppel样因子(KLFs)家族是一类DNA结合转录调控因子，通过转录激活或抑制基因表达发挥细胞增殖、分化、炎症和凋亡等功能[2]。与CC相关研究较多的亚型是KLF4、KLF5和KLF6[3]，如KLF4在CC的发生发展中起抑癌功能[4-5]。同课题组前期研究发现，KLF5表达升高促进CC的发生、发展[6]。近年来KLF15在肿瘤研究中备受关注，如甲状腺肿瘤[7]、神经胶质瘤[8]、肉瘤[9]、肺癌[10]、卵巢癌[11]等。谷胱甘肽代谢作为重要的氧化还原过程参与氧化损伤修复和肿瘤的发生发展。谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是抗氧化反应和促进药物代谢的关键酶，包括5个亚型GSTM1-5，通过与GSH结合发挥解毒作用(包括致癌物、治疗药物、环境毒素和氧化应激产物)。最新研究发现，KLF15调节脂质和全身代谢稳态[12]，且GSTM5作为肿瘤抑制基因在膀胱癌中表达降低[13]。目前仍无KLF15和GSTM5表达在CC中的相关研究报道。因此，推测转录因子KLF15调控GSTM5表达影响细胞谷胱甘肽代谢可能与CC相关。通过检测不同病理宫颈组织中KLF15和GSTM5基因的表达以及谷胱甘肽的含量，生信分析KLF15、GSTM5基因等表达与CC的预后关系，染色质免疫沉淀实验证实KLF15与GSTM5的调控关系，为发现新的宫颈癌分子治疗靶点提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源 2015年9月至2018年9月唐山市工人医院收集CC组织标本40例，患者平均年龄(50.77±3.09)岁。选取门诊刮宫或住院手术治疗的子宫上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasias，CIN)患者40例，其中CINI 14例，CIN II/III型26例，患者年龄(50.8±3.22)岁。选取同期因良性子宫疾病行子宫全切除术患者的45例宫颈组织为对照组(Control)，平均年龄(50.55±3.01)岁。3组患者的平均年龄比较，差异无统计学意义(P=0.585)。标本采集后均经病理专家阅片而确定，主要分成两份，一份于中心实验室-80℃冰箱留存，另外一份经中性福尔马林固定、石蜡包埋用于免疫荧光染色实验。标本取材患者知情同意，唐山市工人医院伦理委员会已准许本研究。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA和总RNA提取 采用基因组DNA抽提试剂盒提取宫颈组织DNA，Trizol法提取总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA和总RNA完整性。

1.2.2 免疫荧光染色检测宫颈组织中KLF15表达 采用免疫组化试剂盒SP法分析。4%多聚甲醛固定宫颈组织标本，组织蜡块4μm连续切片，脱蜡、浸水、高压抗原修复，山羊血清封闭，一抗4℃孵育过夜，暗室室温孵育荧光标记二抗，DAPI胞核染色。Image-Pro Plus 6.0软件(美国MEDIA CYBERNETIC)分析红色荧光在整个视野内所占百分比。

1.2.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测KLF15和GSTM5 mRNA表达 Trizol法提取宫颈组织中总RNA，试剂盒逆转录合成cDNA，行实时定量PCR反应检测。PCR反应条件：95℃ 2min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸45s，共36个循环。所有反应重复3次，用公式2-△△Ct循环阈值法将NRG1 mRNA相对表达水平归一化为内参GADPH相对表达水平。qRT-PCR引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4 谷胱甘肽含量测定 按还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测试剂盒(上海沪峥)操作。液氮研磨宫颈组织至粉末，每50mg宫颈组织加M溶液500μL含10μL蛋白酶抑制剂进行涡旋，冰上操作。匀浆液在4℃冰箱中放置10min，4℃条件下10000r/min离心10min，取上清用于测量总GSH含量。

1.2.5 生信分析DPEP1、GSTM5和GSTM3基因表达与CC生存分析 利用在线GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)数据库获得KLF15、DPEP1、GSTM5和GSTM3三种基因mRNA表达在CC中的5年总生存曲线。根据GSTM5检测结果，对40例CC患者随访并进行总生存率分析。

1.2.6 染色质免疫共沉淀实验(ChIP)[14]依据Genbank中基因序列(Gene ID:2949)，设计PCR引物并扩增GSTM5启动子包含3个位点(site1-3)的不同序列，ChIP方法参考试剂盒说明书(Upstate公司)。50mg宫颈组织眼科剪剪碎，加1%甲醛室温固定，4℃超声波破碎并纯水稀释，取20μL稀释液作为对照。其余稀释液加蛋白A琼脂糖磁珠进行沉淀，分为加抗KLF15抗体和加非特异性IgG抗体2组，洗脱沉淀物后用PCR纯化试剂盒纯化DNA片段，进行PCR检测。引物序列：Site 1(-280bp)：F-5'-TTGTGAGTCTGAAGAAAC-3'，R-5'-TGCATTCATCTAAAGACATA-3'；Site 2(-1230bp)：F-5'-CTCAAGCGCACAGCCAAGTC-3'，R-5'-TCCGGGAGCGAGGTCAGGGC-3'；Site 3(-1400bp)：F-5'-CCTGACCTCGCTCCCGGAAC-3'，R-5'-GGTGCTGGTTGGTGCGGATT-3'。

2 结 果

2.1 转录因子KLF5在宫颈鳞癌组织中表达降低 对照组(Control)及宫颈癌(CC)组患者的年龄、初潮年龄、月经周期、经期、流产次数、吸烟以及饮酒各方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。通过对3例Control和3例CC组织进行RNA-测序分析，聚类分析差异表达的mRNAs。与control组比较，KLF15表达在CC组织中显著减少(图1)；qRT-PCR进一步验证KLF15表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

2.2 不同病理程度宫颈鳞癌组织中KLF15蛋白表达 与control组比较，KLF15蛋白阳性染色在CC组织中减少；并且随着宫颈病变进程的加剧，KLF15阳性染色程度逐步下降(P<0.05)(图3、4)。表明转录因子KLF15表达下降参与宫颈癌的病理进程。

2.3 正常宫颈组织与宫颈鳞癌组织的RNA测序结果分析 基因本论(GO)分析发现，基因富集主要集中于细胞代谢过程(占28%，图5A)。进一步分析发现，蛋白多肽代谢过程种类较多，其中谷胱甘肽代谢过程最显著，见图5B，提示该代谢通路可能参与宫颈癌的发病进程。

2.4 不同病理程度宫颈组织中总GSH含量 在宫颈癌变过程中GSH含量逐渐减少，且不同组间差异有统计学意义[Control组：(108.2±24.5)nmol/mg，CIN I组：(93.6±17.9)nmol/mg，CINII～III组：(71.7±18.6)nmol/mg，CC组：(63.4±19.2)nmol/mg，P<0.05]。

2.5 GSTM5表达降低与宫颈癌相关 依据宫颈癌组织的RNA-seq筛查结果，采用差异表达基因的聚类法分析谷胱甘肽代谢过程中的相关基因，结果显示DPEP1、GSTT1、GSTM5和GSTM3 mRNA表达降低显著，而GSTP1表达升高，见图6A。qRT-PCR检测结果示，宫颈组织中GSTM5表达下降(图6B)。利用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)数据库对上述基因和KLF15表达在CC中进行5年生存曲线分析，结果显示GSTM5与CC患者的5年总生存率相关，低表达GSTM5的CC患者表现出更低的总生存率(图6C)。本实验中40例CC患者预后总生存率统计分析结果显示，GSTM5低表达与宫颈癌患者预后生存率相关性没有统计学差异，但仍有一定趋势(图7)。表明GSTM5表达影响CC的预后生存率，在宫颈癌进展中具有重要作用。

2.6 KLF15调控GSH相关基因GSTM5的转录表达 为了探究参与宫颈癌变过程中GSH代谢紊乱的GSTM5表达降低是否与转录因子KLF15表达下调相关，采用GTRD(Gene Transcription Regulation Database)网站分析转录因子KLF15在GSTM5基因启动子上的可能结合位点情况。结果表明GSTM5基因启动子存在3个重要的KLF15结合位点，并依据这些位点设计3对PCR引物进行免疫染色质沉淀(ChIP)检测(图8)。抗KLF15抗体能够从正常宫颈组织中成功地免疫沉淀GSTM5基因启动子DNA片段(-280位点)，其他位点未检测出特异性片段；而在宫颈癌组织中均未检出。采用非特异性IgG抗体在两组中同样均未检测出信号。综上所述，GSTM5表达降低可能与KLF15表达抑制相关，进而影响谷胱甘肽代谢过程并促进宫颈肿瘤的发生、发展。

3 讨 论

尽管癌前筛查及手术治疗在SCC早期阶段得到了广泛应用，但SCC的局部复发或远处转移亦严重影响了治疗效果及预后，阐明其发病分子机制，寻求有效的治疗分子靶点，对于提高其治愈率，降低死亡率具有重要的意义。本研究结果表明，与正常组比较，CC组中转录因子KLF15表达降低，生信分析和宫颈组织中GSH检测结果证实GSH代谢异常降低，进一步实验证实KLF15靶向调控GSTM5的转录表达参与GSH代谢，这些结果为宫颈癌的诊治提供新的分子靶点参考。

KLFs家族通过与富含GC序列元件的基因启动子区结合激活或抑制基因转录机制参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡和代谢等细胞过程。其主要家族成员KLF4、KLF5、KLF9、KLF11与子宫内膜癌相关[15-16]，KLF6对卵巢癌细胞有抑制作用[17]。KLF15作为基因转录的激活子或抑制子、促进或抑制细胞生长、致癌基因或抑癌基因从而发挥不同作用主要依赖于细胞和遗传背景的不同[18]。大量研究表明，KLF15能参与心脏脂质代谢,影响乳腺癌、人肺腺癌等癌症形成[19-22]。本研究对正常和CC组织进行RNA测序，并通过免疫荧光染色实验证实KLF15含量降低(P<0.01)，且与control组比较，从CINI至CC过程中，KLF15的染色程度逐渐降低。提示KLF15表达下调可能参与了CC癌变过程，是肿瘤增殖的负向调节转录因子。

GSH作为细胞内重要的调节代谢物质，激活多种酶并参与三羧酸循环和糖代谢等过程，从而促进脂肪、蛋白质和糖类的代谢。GSH分子通过活性巯基(-SH)基团保护体内蛋白中巯基不被氧化、灭活，进而活化氧化还原系统、激活酶类、发挥解毒作用、维持胞膜结构稳定和能量代谢等作用[23]。尽管较高的GSH水平与肿瘤的耐药性和侵袭性相关[24]，但是新近报道显示，GSH代谢的增加能抑制小鼠肝细胞癌的发生[25]。本研究通过RNA测序等一系列实验证实，在宫颈病变过程中，KLF15和GSH含量均减少，推测两者之间可能存在直接或间接的关系，这为研究GSH代谢与CC的发生发展是否存在直接或间接的联系提供新思路。

很多转移酶参与了GSH代谢过程，如GSTM亚型、GSTT亚型等。本研究通过对GSH代谢过程相关差异基因的聚类分层分析发现，CC组织中GSTM5的mRNA表达含量下降最为明显，说明在宫颈癌变过程中谷胱甘肽代谢减少与GSTM5表达可能相关。据此，通过GEPIA数据库对DPEP1、GSTM5和GSTM3的mRNA表达在SCC中的5年生存率分析发现，GSTM5低表达时CC的总生存率低(P<0.05)。尽管在本实验40例宫颈癌患者预后总生存率统计分析结果显示，GSTM5低表达与宫颈癌患者更低的预后生存率相关性没有统计学差异，但是仍有一定趋势呈现正相关，提示更大样本量随访验证是必要的。进一步通过JASPAR数据库和ChIP实验验证在正常宫颈组织中KLF15与GSTM5基因启动子结合，而在CC组织中消失，提示KLF15可能参与对GSTM5基因的转录表达，通过调节谷胱甘肽代谢阻止宫颈肿瘤的发生、发展。本研究通过部分实验和生物信息学预测证实了这个理论假设，但是本研究的限制是没有通过细胞实验验证GSTM5启动子和KLF15的结合位点及其对下游GSH代谢的影响，也未采用动物模型实验进一步证实KLF15及其下游靶基因GSTM5与宫颈癌的关系，因此这也提出了我们课题组下一步研究工作的方向。

综上所述，在宫颈组织癌变过程中KLF15表达下调导致GSTM5的表达减少，从而引起谷胱甘肽代谢障碍，促进宫颈上皮细胞的失稳态和恶性增殖，并最终导致SCC的发生、发展。