一起兔球虫病和大肠杆菌病混合感染的诊断及大肠杆菌药敏试验分析

张 沛，阚 威，张总超，马艳萍，王谢忠，孙生祯，刘蓉婧，游萧倩，拉 华，张茂华，魏梦君，黄 龙，俞慧民，王云平*

（1.青海省动物疫病预防控制中心，青海西宁810000；2.青海省乐都区动物疫病预防控制中心，青海互助810700）

近年来兔球虫病和大肠杆菌病的混合感染病频频爆发,两病的混合感染使病情复杂化,病死率增高，给养兔业造成严重的经济损失。兔球虫病是由艾美耳属的多种球虫寄生于兔的肠上皮细胞和肝胆管上皮细胞内的一种寄生虫病,是家兔养殖中最常见的寄生虫病之一。按球虫的种类和寄生部位不同可将兔球虫病分为肝型、肠型和混合型，临床常已混合型为主，表现为顽固性下痢、腹泻带血、腹围增大、下垂，其主要侵害6月龄以内兔，感染率可达100%，其中对1～3月龄的兔侵害最严重，死亡率可高达80%[1]。而兔大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的兔败血型感染和腹泻传染病，表现为黏液性肠炎、肠毒血症或组织器官炎症等。临床主要以下痢和流涎为特征，主要发生于1～4月龄仔兔。当饲养管理不当、气候环境突变或患某些传染病、寄生虫病引起抵抗力低下时发病，该病可经消化道传播引起大批死亡[2]。

2018年9月底至10月初，青海省乐都区某兔专业养殖合作社兔发生了以拉稀、腹部臌胀、消瘦、呼吸困难等症状为主的疫情,并陆续出现死亡，病程多在1～2 天。通过了解发病情况，送检濒死期兔临床症状观察，死亡兔剖检变化和实验室诊断，为尽快确诊并及时控制疫情，对病死兔进行了细菌分离鉴定和粪便虫卵检查，并通过动物试验确定其毒力，最终确诊为球虫病与大肠杆菌病混合感染。同时对分离株细菌进行了药敏试验，以便对乐都区兔大肠杆菌的临床诊断和抗菌药物治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检材料

送检已死亡和濒死期兔各1 只。剖检检测已死亡兔，并无菌采集心、肝、脾、肺等脏器和粪便作为试验检测病料；对濒死期兔进行临床观察。

1.1.2 主要试剂和设备

试剂：营养琼脂培养基、血琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、HE 琼脂培养基、K-B 法药敏纸片（26 种）；细菌微量生化鉴定管，0.5 麦氏比浊管，均购自于杭州微生物试剂有限公司；DNA 提取试剂盒、2000DNA Marker、PCR 反应预混酶、50×TAE、琼脂糖，购自于北京全式金公司。

设备：显微镜、恒温培养箱、PCR 扩增仪(Bio-RAD，Mexico)，凝胶成像系统（Bio-RAD，USA），水浴恒温振荡器，DYY-12 型电脑三恒多用电泳仪与DYCP-31A 型电泳槽(北京六一仪器厂)。

1.1.3 试验动物

18g～22g SPF 级小鼠，购自青海大学实验动物中心。

1.1.4 引物合成

参考已发表的文献[3]，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成细菌鉴定用通用引物16S rRNA基因引物，引物序列及大小，见下表1。

表1 16S rRNA 基因PCR 扩增引物

1.2 方法

1.2.1 病料触片镜检和粪便虫卵检查

将剖检兔采集的病料组织心、肝、肺病理变化部位触片后进行革兰氏染色镜检。

取新鲜兔粪5～10g 放入杯中，先加少量饱和盐水将兔粪捣烂混匀，再加饱和盐水至50ml。将此粪液用60 目尼龙网过滤于试管（15㎜×150㎜），在试管凸液面覆盖盖玻片，静止15～30 分钟，球虫卵即浮于凸液面，随即取下盖玻片置于载玻片上，在显微镜10X40 倍观察。

1.2.2 小动物试验

将采集的病料组织（心、肝、肺）分别接种营养肉汤增菌培养，取其24 小时培养物，分别腹腔接种18～22gSPF 级小鼠4 只，每只0.2ml；同时取4 只同级别小鼠注射等量无菌生理盐水作为对照，隔离饲养观察。

1.2.3 病原分离培养

无菌采集死亡小鼠的心脏、肝脏、肺脏等脏器触片革兰氏染色镜检，并将病料接种于营养肉汤增菌；取24h 的肺脏增菌营养肉汤培养物划线接种于营养琼脂平板进行纯化培养；纯化菌落划线接种于血琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、HE 琼脂平板，37℃24h 培养后观察菌落形态；随机挑选疑似目标单菌落接种于营养肉汤，培养24h，涂片革兰氏染色镜检。

1.2.4 生化鉴定

参考《兽医微生物》第四版4，肠杆菌科生化特性鉴定表，详见下表2。将血清肉汤24h 培养物，按照杭州微生物试剂有限公司《肠杆菌科细菌生化鉴定管说明书》，接种于生化反应管，观察反应结果。

表2 大肠杆菌生理生化指标

1.2.5 16S rRNA 基因PCR 扩增及测序

取纯化后营养肉汤培养物，按照细菌DNA提取试剂盒说明书，提取细菌基因组作为PCR 反应模板。

16 S rRNA 基因PCR 扩增：16S rRNA 条带大小为194bp，PCR 扩增体系为50μl：PCR 预混酶25μl，上下游引物各1μl，DNA 模板2μl，双蒸水21μl。PCR 扩增条件为：PCR 扩增条件为，95℃5 min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30 个 循环；72℃10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

目的条带的PCR 产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI 数据库中进行Blast 比对分析，并应用MEGA5.1 软件对16S rRNA 基因序列进行同源性分析及系统进化树的构建。

1.2.6 药敏试验

药敏试验采用Kirby—Bauer 法。挑取单个菌落接种于MH 液体培养基中，37℃培样16h，调整菌液浓度相当于0.5麦氏单位（1.0 ×108CFU/ml）。用移液器移取200μL，用涂菌棒均匀涂布于M-H 琼脂平板上，等培养基表面干燥后放置药敏纸片使其紧贴培养基表面，于37℃培养24h，游标卡尺测定抑菌圈直径，参照杭州微生物试剂有限公司提供的药敏试验纸片法的抑菌范围解释标准判定分离菌对药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 病死兔剖检和濒死期兔临床观察结果

对1 只已死亡兔进行剖检，可见胃膨大，充满多量液体和气体，肠壁血管充血和管壁透明菲薄、十二指肠扩张，肠道浆膜充血、出血、水肿，盲肠气肿和黏膜充血、出血；肝脏肿大，有小点状坏死灶，胆囊充盈；肺脏心脏、肾脏未见异常变化。对1 只濒死期兔临床观察，可见病兔精神沉郁，伏卧不动，身体消瘦、腹部胀气状；肛门周围、后肢等部位皮毛被粪便沾湿，呈黄色，体温升高到41.2℃；送检第4 天死亡。

2.2 病料镜检和粪便虫卵检查结果

病料中均可检出革兰氏阴性直杆菌，两端钝圆，散在或成对。

图1 病料心脏革兰氏染色

图2 病料肺脏革兰氏染色

图3 病料肝脏革兰氏染色

粪便经饱和盐水漂浮法检测，在显微镜1 个视野下可见10～20 个大小不等和形态不一的球虫虫卵。

2.3 动物试验结果

病料组织24h 增菌培养物，分别腹腔接种4只小鼠，于接种后24h 内死亡；对照组4 只小鼠72h 内健活。由此说明分离株细菌毒力较强。

2.4 病原分离培养及菌落形态特征

死亡小鼠心脏、肝脏、肺脏，触片革兰氏染色镜检，见下图Y。

图4 鼠心脏触片革兰氏染色

图5 鼠肝脏触片革兰氏染色

图6 鼠肺脏触片革兰氏染色

纯化细菌单菌落在营养琼脂平板菌落呈圆形隆起、光滑、湿润、边缘整齐、灰白色、半透明光泽的菌落；在伊红美蓝琼脂平板上呈带金属光泽的紫黑色菌落；HE 琼脂平板上呈橘黄色菌落；血琼脂平板上无溶血现象。详见下图X。

图7 纯化细菌营养琼脂培养特性

图8 纯化细菌伊红美蓝琼脂培养特性

图9 纯化细菌HE琼脂培养特性

图10 纯化细菌血琼脂培养特性

2.5 生化鉴定结果

表3 兔分离株大肠杆菌生化鉴定试验结果统计

2.6 16S rRNA 基因扩增结果

图11 分离株细菌16S rRNA PCR 扩增结果

2.7 16S rRNA 基因同源性及系统发育分析结果

对分离菌株细菌16S rRNA 基因进行测序，测序结果显示：分离株细菌的16S rRNA 基因序列在线Blast 分析显示，其16S rRNA 基因序列与GenBank上已登录(AccessionNo：NR114042、NR112558、NR024570) 的大肠杆菌的相应序列具有高度同源性≥99.0%)；

根据16S rRNA 基因序列与上述同源性较高的大肠杆菌相应序列建立系统进化树，由图12可见，分离株与其同源较高的3 株菌形成了2 个独立分支，且（AccessionNo：NR114042、NR112558、NR024570)3 株菌处在同一分支，而分离株单独处一个大的分支。

图12 分离株大肠杆菌16S rRNA 基因同源性及系统发育分析结果

2.8 药敏试验结果

由上表可见，分离株大肠杆菌对丁胺卡那霉素、呋喃唑酮、庆大霉素、头孢他啶、多粘菌素B高度敏感；对氧氟沙星、新霉素、头孢哌酮、红霉素中度敏感；对青霉素、诺氟沙星、万古霉素、卡那霉素、氨苄西林、克林霉素、头孢唑啉、羧苄西林、头孢氨苄、麦迪霉素、氯霉素、多西环素、四环素、苯唑西林、环丙沙星、头孢拉定、哌拉西林具有耐药性。结果详见下表

3 讨论

通过送检单信息和电话联系获知，该长毛兔养殖场存栏1250 只，发病166 只，死亡67 只，发病率为13.28%，病死率为40.36%。最初发病时间在2018年9月28日，发病兔日龄在4月龄左右。在此期间，采用头孢氨苄注射液、复方磺胺甲噁唑、甲砜霉素VB 治疗，治疗效果一般。由上述发病情况、治疗情况，以及送检临床症状和病死兔剖检情况，初步判断该养殖场兔死亡的原因为疑似兔球虫病和大肠杆菌病混合感染导致的死亡。

经试验分析，根据兔粪便虫卵检查和分离的细菌在普通培养基和鉴别培养基上的生长形态、颜色、大小等和染色显微镜观察结果，并结合细菌生化试验和16S rRNA 测序结果表明，证实该其疫情是由兔球虫和大肠杆菌混合感染引起。试验中对分离株细菌进行了药敏试验，药敏试验表明：该分离株细菌对丁胺卡那霉素、呋喃唑酮、庆大霉素、头孢他啶、多粘菌素B 高度敏感；对氧氟沙星、新霉素、头孢哌酮、红霉素中度敏感；对青霉素、诺氟沙星、复方新诺明、卡那霉素、氨苄西林、克林霉素、头孢唑啉、羧苄西林、头孢氨苄、麦迪霉素、氯霉素、多西环素、四环素、苯唑西林、环丙沙星、头孢拉定、哌拉西林具有耐药性。由此可鉴，养殖户治疗期间，所使用的抗生素头孢氨苄注射液、复方磺胺甲噁唑都对此菌具有很强的耐药性，所以导致治疗效果一般。因此，在临床应用上，防治兔球虫病和大肠杆菌病混合感染的病例，应将抗球虫药物配和药敏试验敏感性药物，交替轮换使用，避免产生耐药性。

后期经反馈该兔专业养殖，社针对抗球虫，配合抗生素治疗，其治疗效果极佳，暂无发病死亡兔。因此，对于兔球虫和大肠杆菌病，应遵从预防为主，防治结合的原则，根据药物敏感试验确定治疗方案，避免滥用抗生素导致生产耐药性并影响食品安全。防控方面[6]：必须加强饲养管理,避免拥挤、受寒、受热，提高抵抗力；严把饲草料和饮用水质量关；搞好兔舍及周围环境卫生，及时清理粪便及其他污染物，保持兔舍的清洁、通风、干燥，并严格执行定期消毒制度，对兔舍、用具等进行全面消毒，并注意交替使用消毒药。

表4 分离株兔大肠杆菌药敏试验结果统计表