不同条件下巨大芽孢杆菌BM1259的生长特性研究

陈玉粮

（扬州大学，江苏 扬州225009）

1 巨大芽孢杆菌BM1259 的研究进展

巨大芽孢杆菌是芽孢杆菌属，属于好氧革兰氏阳性杆菌，是一种有益菌，具有对环境和人畜无害等特点而受到人们的关注与研究。1935年苏联科学家孟吉娜从土壤里分离到了一株可以解磷的巨大芽孢杆菌并开始投入生产与继续的深入研究。

农作物对化肥的利用有限，大量没有被利用的磷源在土壤中与土壤的某些成分发生反应，变成了植物难以利用的形态，我们通常称这种磷为无效态磷。为了保持农作物的产量人们依然会运用大量的化学肥料和有机肥来给予土壤充足的养分，日渐积累便使土壤污染状况加重。人们不得不开始寻找其他解决方法。实验证明，微生物对土壤中物质的循环有重要的意义，对磷素循环也是如此[1]。巨大芽孢杆菌就是其中的一种。

巨大芽孢杆菌在水产上可以起到净化水体的作用主要体现在对水体中的有机物和磷降解、改善水体的富营养化以及水产养殖的应用。菌株在24h 内氨碳降解率达到95%以上，并且还具有硝酸还愿与亚硝酸的还原能力，其中的海藻胶裂降解酶、蛋白酶、纤维素酶活性会把构成海藻大分子的物质逐渐降解为小分子和水溶性物质，保留了海藻生物活性与一个样物质，作为水产生产过程中的有益菌进行添加可以解决水体中氨碳污染的问题。在水中添加巨大芽孢杆菌不仅可以分解了池塘中残留的饲料以及排泄物等有机污染物起到净化水体的作用还避免了利用化学制剂会引起的第二次水体污染的问题，也可以通过人工的调控来优化水体环境中的微生物组成和数量，降低成本低，提高养殖产量，对水产的生产非常具有意义。

在畜牧生产上巨大芽孢杆菌不仅能减少蛋鸡肠道和排泄物中的氨气和硫化氢的排放[2]也能使蛋鸡对日粮中营养物质的吸收利用提高，使蛋鸡的采食量减少提高蛋鸡的产蛋率，增加蛋鸡血清钙磷含量[3]。有研究表明巨大芽孢杆菌会分泌一种可以降解羽毛角蛋白、酪蛋白的水解酶。可以释放羽毛中角蛋白和酪蛋白使动物蛋白质饲料的生产具有很大的意义，还可以解决畜牧场畜禽排泄物、废弃垫料的问题遏制污染气体的源头，改善我国的畜牧生产环境，使畜牧养殖成本降低，增加利润[4]。

2 材料与方法

2.1 实验设计 本试验以巨大芽孢杆菌BM1259为实验材料，探究巨大芽孢杆菌在不同环境条件下的生长情况。实验设4 种不同条件：不同碳源、不同装液量、不同接菌量、不同pH 值，每个处理重复三次，摇床培养48 小时，在12 小时、24 小时、36 小时分别用波长660nm 的分光光度计记录数据，取数据的平均值。比较巨大芽孢杆菌在各个条件下的生长情况，找到最佳的生长条件。

2.2 材料

2.2.1 供试杆菌 本试验所用的BM1259 制剂是由扬州大学动物科学与技术学院动物营养系提供，含活孢子数100 亿个/g。

2.2.2 培养基配制 称取营养肉汤培养基22g，成分（g/L）：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖4.0g 蒸馏水1000mL，PH 值7.2-7.4，分装于150mL 的三角瓶中，每瓶100mL,121℃条件下灭菌15min。用于巨大芽孢杆菌1259 生长特性原始数据的检测。

2.2.3 培养基营养物质 蒸馏水、碳源。不同的碳源有葡萄糖、蔗糖。主要的碳源是葡萄糖。

2.2.4 碳源培养基 碳源5.0g,NaCl 0.1g,磷酸氢二钾0.05g 七水硫酸美0.025g 水1000ml 蛋白胨0.5g 蒸馏水1000mL,pH 值7.0,分装于250mL 三角瓶中,每瓶100mL,121C 条件下灭菌15min。蔗糖和葡萄糖用于不同碳源对巨大芽孢杆菌BM1259 生长特性数据的测定。萄糖做为唯一的碳源对不同条件下巨大芽孢杆菌BM1259 生长特性数据的检测。

2.2.5 仪器设备 压力蒸汽灭菌器、超净工作台、摇床器、分光光度仪、实验室pH 计、电子分析天平、蒸馏装置、0.5-10ul 的移液枪、20-200ul 的移液枪、酒精灯、10ul 的枪头、100ul 的枪头、分离试管，150mL 三角瓶、250mL三角瓶、100mL烧杯、量筒。

2.3 实验方法

选取营养肉汤培养基，培养液封口，分装与100mL 的三角瓶中三组重复，做好标记分别1、2、3。高压灭菌后在超净台下分装培养液，接种巨大芽孢杆菌，摇床培养48 小时后，使用比色皿在波长660nm下测定吸光度，记录数据，作为数据对照。

选取碳源培养基，培养液封口，分装与100mL 的三角瓶中三组重复，做好标记分别4、5、6。高压灭菌后，调节培养液不同pH 值，不同装液量，不同接菌量后在超净台下接种巨大芽孢杆菌BM1259，进行摇床48 小时后，使用比色皿在波长660 nm 下测定吸光度，记录数据。

3 结果与讨论

3.1 巨大芽孢杆菌BM1259 的生长曲线

巨大芽孢杆菌BM1259 的生长特性随时间变化如图1所示，10h 内巨大芽孢杆菌BM1259 生长迟缓；10-30h 时间段内细菌处于对数生长期，活菌数呈现对数直线上升，生长快速；30-50h 内细菌处于稳定期，此期间细菌数量处于动态平衡；50h 之后进入衰亡期，死菌数超过活菌数，活菌数量呈下降趋势。

图1 巨大芽孢杆菌BM1259 的生长曲线图

3.2 添加葡萄糖和蔗糖对巨大芽孢杆菌BM1259生长特性的影响

由图2可知巨大芽孢杆菌在葡萄糖培养基中的生长特性随时间变化其中0～10 小时内巨大芽孢杆菌生长缓慢属于适应期；10～30 小时内活菌呈现对数直线上升处于对数期；30 小时后活菌的数开始呈下降趋势。

图2 葡萄糖对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

由图3可知巨大芽孢杆菌在蔗糖培养基中的生长特性随时间变化其中0～10 小时内巨大芽孢杆菌生长缓慢属于适应期；10～30 小时内活菌呈现对数直线上升处于对数期；30 小时后活菌的数开始呈下降趋势。

图3 蔗糖对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

3.2.1 装液量对巨大芽孢杆菌BM1259 的影响 巨大芽孢杆菌BM1259 按装液3ml、5ml、7ml 的不同体现出不同的生长特性分别如图4、图5、图6所示，0-12h 内巨大芽孢杆菌BM1259 生长迟缓；12-30h 内细菌处于对数生长期，活菌数呈现对数直线上升，生长快速，30h 达到细菌生长的最高峰；30-40h 内细菌呈现下降趋势，此期间活细菌有所下降；40-48h 之后进入稳定期，细菌处于动态平衡的状态。以接菌量、pH 值为定量，装液量为变量，可以看出装液量对巨大芽孢杆菌生长特性的影响大。

图4 装液量3ml 对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

图5 装液量5ml 对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

图6 装液量7ml 对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

3.2.2 接菌量对巨大芽孢杆菌BM1259 的影响巨大芽孢杆菌BM1259按接菌量液3ul、5ul、7ul 的不同体现出不同的生长特性如图7、图8、图9所示，0-12h 内巨大芽孢杆菌BM1259 生长迟缓；12-30h 内细菌处于对数生长期，活菌数呈现对数直线上升，生长快速，30h 达到细菌生长的最高峰；30-48h 此期间活细菌有所下降；48h 之后会进入稳定期，细菌将会处于动态平衡的状态。以装液量、pH 值为定量，接菌量为变量，可以看出接菌量对巨大芽孢杆菌生长特性的影响大致相同。

图7 接菌量3ul 对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

图8 接菌量5ul 对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

图9 接菌量7ul 对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

3.2.3 pH 对巨大芽孢杆菌BM1259 的影响 巨大芽孢杆菌BM1259 按酸碱度的不同体现出不同的生长特性，当pH 值是5 时，如图10所示，0-8h内巨大芽孢杆菌BM1259 生长迟缓，菌体增大，代谢活跃；8-12 h 时间段内细菌处于对数生长期，活菌数呈现对数直线上升，生长期时间比较长，生长快速；12-30h 内细菌处于稳定期，此期间细菌数量处于动态平衡。根据其酸碱度对巨大芽孢杆菌的影响比较明显。所以选取其作为研究对象进行讨论。

图10 pH5 对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

当pH 值是7 时，如图11所示，0-2h 内巨大芽孢杆菌BM1259 生长迟缓;2-5h 时间段内细菌呈现线性生长，细菌代谢非常活跃，生长飞快；5h后细菌开始衰退，细菌数降低。

图11 pH7 对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

当pH 值是9 时，如图12所示，0-2h 内巨大芽孢杆菌BM1259 生长迟缓;2-6h 时间段内细菌呈现线性生长，细菌代谢非常活跃，生长飞快；6h后细菌开始衰退，细菌数降低。

图12 pH9 对巨大芽孢杆菌BM1259 生长曲线的影响

4 结论

本次研究主要针对不同条件对巨大芽孢杆菌生长特性的影响，从图表中可以看出不同的条件对巨大芽孢杆菌的生长曲线有着不同的表现。根据实验结果：

1.葡萄糖和蔗糖对巨大芽孢杆菌的生长曲线没有明显影响。

2.相同装液量中接菌3ul 的巨大芽孢杆菌生长曲线最快达到峰值。

3.不同pH 值中pH=7 时巨大芽孢杆菌的生长曲线最快达到峰值。

由此可知，碳源相同、装液量相同，培养基的pH 值=7 的条件下接菌量少的巨大芽孢杆菌的生长状况最好，可以作为发酵生产参考的依据。