非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

刘桃雪,苏冰倩,齐艳丽,郭江涛,刘忠虎,褚贝贝,王 江*,曾 磊*

(1.河南农业大学动物医学院,郑州 450046;2.河南农业大学,农业农村部动物生化与营养重点实验室,郑州 450046;3.河南农业大学,河南省动物生长发育调控重点实验室,郑州 450046)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。其特征是发病过程短,最急性和急性感染死亡率高达100%。非洲猪瘟的爆发,给全球养殖业造成了严重经济损失。虽然对非洲猪瘟已进行了广泛的研究,但是仍然缺乏有效的疫苗或抗病毒策略[1],目前主要是采取早期检测、严守卫生程序、大规模扑杀带毒家畜和野猪等措施将ASF控制在一定区域[2]。

ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员,是具有双层膜结构,直径为200 nm的大型双链DNA病毒,呈复杂的二十面体结构,其结构由内到外依次是内核、内核心壳、内膜、衣壳、囊膜,基因组全长为170～193 kb,中央为保守区,两侧为可变区。ASFV基因组庞大且复杂,并具有双层囊膜,所以病毒耐受力强变异度高导致难以形成中和抗体[3]。ASFV基因组有150～167个开放阅读框,编码150～200种蛋白质,其中至少有54个结构蛋白[4],主要的结构蛋白有p30、p54、p72、pp220、pp62和 CD2v蛋白等[5]。其中,ASFV的p72、p54和 p30等结构蛋白均具有良好的抗原性和免疫原性[6-9],具备血清学诊断价值[10-11]。

p30蛋白是由CP204L基因编码的重要的内囊膜蛋白,是ASFV的主要结构蛋白之一,也是最具免疫原性的蛋白之一。它能够介导ASFV对巨噬细胞的吸附和内化,干扰宿主细胞的转录与翻译,在感染后4 h,能在细胞质中检测到[12],然后在整个感染周期中持续高水平表达,含量丰富且抗原性较高,是重要的病毒早期诊断靶标[13-14]。p30的表达表明病毒已经进入细胞并脱壳,病毒基因的早期表达已经开始[15]。p30蛋白在非洲猪瘟病毒粒子进入宿主细胞中发挥重要作用,抗p30蛋白的抗体对病毒内化有一定的抑制作用[6],这提示p30蛋白参与ASFV的内化过程,但具体作用机制尚不清楚[7,16]。

鉴于p30是早期检测的优良靶标,本研究通过对ASFV p30蛋白氨基酸序列进行原核密码子优化,利用大肠杆菌表达系统获得可溶性重组p30蛋白,将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备了2株针对p30蛋白的单克隆抗体,均具有良好的特异性,对其抗原表位进行鉴定,并在预测的三级结构中进行标注。为ASFV p30 蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 质粒、菌株 NCBI(MK128 995.1)中China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株CP204L基因序列由上海金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化并合成。表达菌株BL21(DE3)感受态细胞购自北京擎科生物科技有限公司、克隆菌株Top10由本实验室制备及保存。

1.1.2 细胞及毒株 骨髓瘤细胞(SP2/0)购自美国ATCC;猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪圆环病毒(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)为本实验室保存。ASFV标准阳性血清购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 动物 雌性6～8周龄的BALB/c小鼠购自郑州大学实验动物中心。

1.1.4 试剂 考马斯亮蓝R-250购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;弗氏佐剂、HAT、HT贮存液、融合剂PEG1450购自Sigma公司;Ni-NTA Agarose购自QIAGEN公司;AEC酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Sino Biological公司;Millipore超滤管购自密理博中国有限公司;透析袋购自VAKE公司(USA)。

1.2 方 法

1.2.1 重组质粒构建及鉴定 参考NCBI(MK128 995.1)中China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株CP204L基因序列,运用在线密码子优化工具GenSmartTMCodon Optimization根据大肠杆菌的密码子偏好性调整p30基因的同义密码子进行密码子优化CP204L全基因。表达序列两端引入酶切位点NdeⅠ和HindⅢ及6×His标签,便于基因克隆和蛋白纯化,提交金斯瑞生物科技有限公司合成。将重组质粒命名为pET30a-His-p30。使用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ对合成的重组质粒pET30a-His-p30进行双酶切鉴定,酶切鉴定正确后将重组质粒送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.2.2 重组p30蛋白诱导表达及可溶性分析 将重组质粒转化至BL21感受态细胞,于37 ℃恒温振荡摇床中振荡培养4 h,至OD600 nm=0.6左右,取1 mL菌液作为未诱导对照,然后分别加入0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol·L-1IPTG,于37 ℃及16 ℃,180 r·min-1条件下诱导表达10 h,以确定诱导p30重组蛋白表达的最佳条件。富集菌体,超声波破碎后,4 ℃、10 000 r·min-1离心10 min分离上清和沉淀。SDS-PAGE凝胶电泳后经考马斯亮蓝染色检测蛋白可溶性。

1.2.3 表达蛋白的纯化及Western blot鉴定 以最佳诱导条件大量诱导表达p30重组蛋白,参照Ni-NTA Agarose操作技术手册对破碎后的上清进行纯化,通过SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色鉴定蛋白纯度。然后经BCA法测定p30蛋白浓度,将其定量为1 mg·mL-1后分装保存于-80 ℃备用。对纯化后的p30蛋白进行Western blot鉴定,使用按1∶1 000比例稀释的his标签抗体作为一抗,1∶5 000比例稀释的HRP标记的兔抗鼠的IgG抗体作为二抗,显色后,进行免疫印迹结果分析。

1.2.4 动物免疫 取5只6～8周龄雌性BALB/c小鼠(分别记为鼠1～5),将纯化的重组p30蛋白与弗氏完全佐剂1∶1混匀乳化,通过皮下多点注射方式免疫小鼠,免疫剂量为每只50 μg。二次免疫、三次免疫用弗氏不完全佐剂乳化p30蛋白,每次免疫间隔2周,第3次免疫后1周自小鼠尾部采血,分离血清,用间接ELISA方法测定血清抗体效价;融合前3 d选择抗体效价最高的小鼠进行再次免疫,每只腹腔注射100 μg重组蛋白。

1.2.5 杂交瘤细胞融合及筛选 再次免疫3 d后将小鼠安乐死,分离脾细胞,在PEG1450作用下将脾细胞与对数生长期的SP2/0细胞按照7∶1的比例进行细胞融合。融合后将细胞铺至含有HAT选择培养基的96孔细胞板中培养。细胞融合7 d后,取100 μL培养上清用间接 ELISA 方法进行检测。阳性杂交瘤细胞需进行2～3次亚克隆,直至抗体阳性率达100%。将稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株扩大培养并冻存于液氮中长期保存。

间接 ELISA方法:将重组p30蛋白用1×PBS稀释至2 μg·mL-1包被酶标板,4 ℃包被过夜,弃去包被液,100 μL·孔-1PBST,洗涤3次;用5%脱脂奶于37 ℃封闭2 h,PBST洗涤3次;将杂交瘤细胞培养上清作为一抗,加入酶标板,同时设立阴、阳性对照,于37 ℃反应1 h,PBST洗涤3次;加入100 μL HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶2 500稀释)于37 ℃反应1 h,PBST洗涤3次;每孔加入100 μL TMB显色液于37 ℃避光显色15 min;加入100 μL 2 mol·L-1H2SO4终止反应。用酶标仪测定每孔OD450 nm值,待检样品OD450 nm/阴性样品OD450 nm(S/N)>2.1判定为阳性。

1.2.6 腹水制备及纯化 选取12周龄雌性BALB/c小鼠,向小鼠腹腔内注射300 μL弗氏不完全佐剂。7 d后,向小鼠腹腔中注射3×106～4×106个杂交瘤细胞。5～7 d后,小鼠的腹部变大,待触之有波动感、行动不敏捷、被毛粗糙时收集腹水,于4 000 r·min-1离心5 min,取中间层液体。用饱和硫酸铵沉淀法对所获得腹水进行纯化,收集纯化后的目标抗体,标记清楚名称等信息并分装后于-80 ℃保存。

1.2.7 单克隆抗体效价测定 利用间接ELISA以纯化的p30蛋白为抗原,用PBS稀释至100 ng·mL-1后加入96孔的ELISA板内,用5%的BSA连续2倍倍比稀释的待检抗体作为一抗,用HRP标记的山羊抗小鼠IgG按照1∶5 000的比例进行稀释作为二抗,TMB显色15 min后终止,使用酶标仪,读取各样品孔OD450 nm值。

1.2.8 单克隆抗体亚型鉴定 包被亚型抗体:用PBS按比例稀释同型特异性抗体:IgG1(1∶1 000)、IgG2a(1∶2 000)、IgG2b(1∶200)、IgG3(1∶500)、IgM(1∶4 000),之后分别加入96孔微孔板内,每个亚型重复3孔;以单克隆细胞培养上清作为一抗,同时设置阳性对照和阴性对照,用HRP标记的山羊抗小鼠IgG按照1∶5 000的比例进行稀释作为二抗,TMB显色15 min后终止,读取各样品的OD450 nm值,并判定抗体亚型。

1.2.9 Western blot 反应性鉴定 将pcDNA3-HA及pcDNA3-p30-HA质粒转染HEK293 T细胞,收取细胞内蛋白进行 Western blot验证,用HA标签抗体按1∶1 000比例稀释作为一抗,用HRP标记的山羊抗小鼠IgG按照1∶5 000的比例进行稀释作为二抗,加入显色试剂,显色后,进行免疫印迹结果分析。

1.2.10 间接免疫荧光试验(IFA)反应性鉴定 取转染pcDNA3-p30-HA质粒24 h的HeLa细胞及其玻片(4 mL·L-1多聚甲醛固定),以单克隆细胞培养上清作为一抗,用HRP标记的山羊抗小鼠IgG按照1∶200的比例进行稀释作为二抗,并对细胞核进行染色,固定玻片后,将玻片置于在荧光显微镜下观察,使用EVOS FL细胞成像系统拍摄照片并保存。

1.2.11 单克隆抗体抗原表位鉴定 利用NetSurfP Ver.1.1 (http:∥gps.biocuckoo.cn/online_full.php)预测p30二级结构,对CP204L基因进行逐步截短(避开α螺旋和β折叠),连接至pGEX4T-3载体,将构建成功的截短质粒转化至BL21感受态,用IPTG诱导表达后,取1 mL菌液,99 ℃变性10 min,制作蛋白样品。以纯化抗体作为一抗,进行Western blot反应性鉴定,以确定其抗原表位区域。然后使用I-TASSER(https:∥zhanggroup.org/I-TASSER/)在线预测ASFV p30蛋白三级结构,在PyMOL软件中标注出p30单克隆抗体所识别抗原表位区域。

2 结 果

2.1 密码子优化

密码子优化后,与原始序列比对发现碱基序列发生改变(以浅色字体表示,图1A),编码的氨基酸类型并未发生改变(图1B),所表达的p30蛋白的类型也未发生变化。

2.2 重组p30蛋白诱导表达及可溶性分析

为了诱导重组p30蛋白表达及摸索其最适表达条件,将合成的原核表达质粒pET30a-His-p30转入原核表达菌株BL21(DE3)中,分别采用不同浓度的IPTG和温度诱导蛋白表达,发现在30 ku处出现目的蛋白,且IPTG浓度为0.4～0.6 mmol·L-1,温度为16 ℃,10 h诱导效果最佳(图2A、2B)。SDS-PAGE电泳分析其表达产物有少量以可溶性形式存在于上清中(图2C)。

A.37 ℃诱导10 h重组蛋白表达情况;B.16 ℃诱导10 h重组蛋白表达情况;C.重组p30蛋白可溶性分析。M.蛋白质相对分子质量;1.pET30a-CP204L未诱导全菌液;2.pET30a-CP204L诱导全菌液;3.pET30a-CP204L诱导上清;4.pET28a-CP204L诱导沉淀

2.3 原核表达蛋白的纯化及Western blot鉴定

为了进一步从上清中纯化重组蛋白p30,将未诱导全菌液、诱导全菌液、破碎后上清、破碎后沉淀、收集的流穿液、不同咪唑浓度的洗杂缓冲液及洗脱液进行蛋白制样,SDS-PAGE 检测样品中蛋白纯化效果,结果发现,在100和250 mmol·L-1咪唑洗脱液样品中存在洗脱的目的蛋白p30,大小为30 ku,且条带单一(图3A)。为了验证纯化后的目的蛋白,对表达产物进行Western blot验证,一抗为鼠源的His标签抗体,二抗为HRP标记的山羊抗鼠的IgG抗体,结果显示目的蛋白可与His标签一抗结合良好,条带与预期大小30 ku一致(图3B),说明蛋白成功表达。

2.4 单克隆抗体 Western blot 及IFA反应性鉴定

为了鉴定获得的2株ASFV p30蛋白的单抗与真核表达p30蛋白是否具有良好的结合活性,将pcDNA3-HA及pcDNA3-p30-HA质粒转染HEK293 T细胞,收取细胞内蛋白进行 Western blot验证,一抗为anti-HA和2G10-2、6D2-1,二抗为HRP标记的山羊抗鼠的IgG抗体,结果显示目的蛋白pcDNA3-p30-HA成功表达,获得的2株p30单克隆抗体均能与p30蛋白发生特异性反应,蛋白质大小约为30 ku(图4A)。其次,IFA结果显示,2株单克隆抗体均与细胞内ASFV p30瞬时表达产物结合良好,在显微镜下可见绿色荧光,定位于细胞质中,空载体转染孔对照无荧光呈现(图4B)。

A.Western blot鉴定p30单克隆抗体的特异性;B.IFA鉴定p30单克隆抗体的特异性

表明获得的2株ASFV p30蛋白的单抗与真核表达p30蛋白均具有良好的特异性。

2.5 单克隆抗体抗原表位鉴定

ASFV p30蛋白二级结构由无规卷曲、α螺旋、β折叠构成(图5A),对p30肽段进行截短,保证每段α螺旋、β折叠的完整,进一步Western blot分析,结果表明ASFV-P30识别的氨基酸序列范围是C端170～194 aa共25个氨基酸,氨基酸序列为:IYGTPLKEEEKEVVRLMVIKLLKKK(图5B)。在p30蛋白三级结构可视化的基础上,标注出p30单克隆抗体识别抗原表位区域170～194 aa(图5C,以红色区域表示)。

A.ASFV p30蛋白二级结构预测结果;B.ASFV p30蛋白截短示意图及抗原表位鉴定(M.蛋白分子量 Marker;1.pGEX4T-p30;2.pGEX4T-p30-Δ1;3.pGEX4T-p30-Δ2;4.pGEX4T-p30-Δ3;5.pGEX4T-p30-Δ4;6.pGEX4T-p30-Δ5;7.pGEX4T-p30-Δ6);C.ASFV p30蛋白的三级结构

3 讨 论

非洲猪瘟病毒作为非洲猪瘟病毒科唯一成员,碱基数多达17万～19万个,基因组庞大,能够编码多种蛋白质,包括结构蛋白和免疫调节蛋白,其结构和免疫逃逸机制复杂,能够逃避宿主免疫细胞的清除,但其与宿主细胞的互作机制尚不清晰。针对非洲猪瘟的各种疫苗策略已经进行了研究,早期侧重于以抗原为基础的方法,旨在诱导中和血清学反应,以CD2v为抗原不能引起机体足够的免疫保护,此后,许多亚单位疫苗的方法都集中在p54和p30,数据结果显示p54和p30同时免疫机体可延缓ASFV临床症状,因此深入对ASFV蛋白质组和单个蛋白质功能的研究,对合理设计靶向疫苗方法具有重要意义[17-19]。

现阶段对非洲猪瘟的控制主要依靠传统的措施:动物一旦确诊感染,立刻采取全扑杀以防范ASFV的进一步扩散和蔓延。因此,快速准确的诊断识别ASF是该病流行病学管理的关键。目前主要将p72、p54、p30蛋白作为诊断抗原用于ASFV感染时的血清学诊断。有研究表明,与p54蛋白相比,可能由于p30拥有构象表位,在ELISA上的灵敏度更高[20]。且p30蛋白在ASFV感染后2～4 h即可表达,能诱导中和抗体的产生,在整个感染期都能检测到,更适用于早期诊断。因此本研究通过原核表达系统,获得了纯度较高的可溶性p30蛋白,建立了获得可溶性p30蛋白的体系,且蛋白纯度高,经鉴定具有良好的反应原性,可用于间接ELISA来检测ASFV的感染。进一步利用p30蛋白免疫小鼠,制备了高特异性的p30单克隆抗体,可应用于阻断ELISA方法的建立,这为血清学检测方法的进一步发展提供了材料。

研究病毒蛋白的特性及评估p30蛋白的抗原表位特征,尤其是保守表位特征,有助于研究人员更好理解病毒的生物特性和宿主的免疫反应机制,还能为发展和改进ASF诊断和监测的血清学检测方法以及疫苗的研发提供重要信息[21-22]。Petrovan等[23]的研究初步鉴定了p30的61～93位氨基酸之间的表位,该区域也被ASFV感染猪的血清识别,提示该区域是具有重要免疫功能的表位[24]。同时也鉴定了p30蛋白C端部分中的一个大多肽片段(120～204 aa)与高度柔性和潜在无序倾向区域(91～143 aa)部分重叠可能是 p30 蛋白的抗原表位区域,该结果与本研究的试验结果相似。本研究进一步缩小了p30蛋白的抗原表位分布范围。目前已有研究报道ASFV病毒颗粒[25]、p54蛋白[26]和p72[8]蛋白的结构解析,但是没有关于p30蛋白结构解析的报道,故本研究通过I-TASSER软件在线预测ASFV p30蛋白三级结构,并标注出p30单克隆抗体识别的抗原表位区域,为ASFV p30蛋白结构的研究奠定了基础。

4 结 论

本研究制备了2株非洲猪瘟病毒China/2018/AnhuiXCGQ-ASFV毒株p30蛋白的单克隆抗体,同时利用蛋白截短表达的方式鉴定了170I～K194是其识别的抗原表位区域,进一步通过I-TASSER软件在线预测ASFV p30蛋白三级结构,并标注出p30单克隆抗体识别的抗原表位区域,丰富了p30蛋白的抗原表位信息,为ASFV p30蛋白结构的研究及血清学检测方法的进一步发展奠定了基础。