基于RPA-CRISPR/Cas12a技术快速检测犬猫皮肤癣菌方法的建立

郜平平,付金玉,王丽仰,史硕博*,张跃平*,张 迪*

(1.中国农业大学动物医学院,北京 100193;2.北京化工大学北京软物质科学与工程高精尖创新中心,北京 100029)

皮肤癣菌病是由致病性真菌引起的浅表皮肤病[1]。犬小孢子菌(Microsporumcanis, Mc)、石膏样小孢子菌(Nanniziagypsea, Ng)和须毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes, Tm)是导致犬猫皮肤癣菌病的最常见的病原微生物[2]。患病动物的临床表现不一,典型症状是圆形或不规则的脱毛灶、伴有不同程度的皮屑[3]。皮肤癣菌病是一种自限性的疾病,大多数动物经过有效的治疗后在数周至数月内即可痊愈[4]。但该病会影响动物的生活质量,且具有传染性,对公共安全造成一定的影响[5-6]。因此,快速、准确的诊断对及时治疗和防止皮肤癣菌病的传播具有重要意义[7]。目前,皮肤癣菌病的诊断方法有伍德氏灯检查、直接镜检、真菌培养及PCR检测[2]。伍德氏灯检查和直接镜检的假阳性和假阴性均较高[5];真菌培养的准确率较高,但培养所需时间约2周,耗时较长[8]。通过PCR技术扩增皮肤癣菌内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)区域的特异性序列,可以在2～3 h内得到结果,且敏感性和特异性均较高[9],但这种方法所需仪器较为昂贵、操作繁琐、对人员要求高,在宠物临床上使用具有局限性[10]。从上述对临床常用检测方法的分析可知,目前宠物临床缺少一种敏感性和特异性均较高的现场快速检测方法。

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)技术是近年来热门的高特异性基因编辑技术及检测技术[11]。CRISPR-Cas12a系统是由RNA引导的DNA靶向的CRISPR系统[12]。Cas12a-crRNA复合物可特异性识别靶标双链DNA,并激活Cas12a的反式核酸酶切割活性,不加区分地切割任意单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)[13]。利用其反式切割后的信号放大特性,通过筛选适宜的靶标核酸并设计高效信号报告分子,即可实现特定病原菌的高灵敏度、高特异性和低成本检测[14]。目前,研究人员已经开发了多种用于病原菌检测的CRISPR-Cas12生物传感新平台,包括DETECER[15]、HOLMES[16]及HUDSON[17]等。通过结合等温扩增技术,如重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)[18]或环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[19-21],实现了病原菌的灵敏、特异性检测[22]。本研究建立了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a技术检测犬猫三种常见皮肤癣菌的方法(图1),以期快速诊断犬猫皮肤癣菌病。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

须毛癣菌的标准菌株(ATCC28185)及石膏样小孢子菌标准菌株(ATCC14683)由中国农业大学动物医学院外科实验室提供,作为须毛癣菌和石膏样小孢子菌的前期试验菌株。选取一株经真菌培养及测序确定为犬小孢子菌的临床分离菌株作为犬小孢子菌的前期试验菌株。

1.2 临床样本的采集、处理及鉴定

检测步骤如下:(1)从犬猫病灶样本中提取DNA;(2)用RPA扩增靶基因;(3)Cas12a反应;(4)在蓝光下肉眼观察荧光信号。扫描文章首页OSID码可查看彩图 The detection steps are as follows: (1) Extraction of DNA from focus samples of dogs and cats; (2) Amplification the target gene by RPA method; (3) Cas12a reaction; (4) Observation of fluorescence signal under blue light by the naked eyes.The color picture can be found by scanning the OSID code on the front page of the article图1 利用RPA-CRISPR/Cas12a技术检测犬猫皮肤癣菌的示意图Fig.1 Schematic of detection of dermatophytes in dogs and cats by RPA-CRISPR/Cas12a

使用无菌棉拭子、拔毛或胶带粘贴法采集23例皮肤癣菌患病动物病灶处或病灶边缘的毛发及皮屑,皮肤癣菌患病动物均通过伍德氏灯检查、直接镜检和真菌培养进行确诊,另外采集1份未患有皮肤癣菌病的猫的毛发作为阴性对照。每份临床样本均分为2份,一份用于提取DNA,提取方法为向临床样本中加入50 μL提取缓冲液(50 mmol·L-1NaOH,1 mol·L-1Tris-HCl,pH 8.0),95 ℃加热10 min,12 000 r·min-1离心5 min,上清即为提取的DNA;另一份接种于沙氏琼脂培养基(Sabouraud’s agar, SDA),30 ℃培养10～14 d,取少量菌丝用乳酸酚棉蓝染色后,通过镜检观察大分生孢子形态进行初步鉴定。使用ITS1/ITS4引物(表1)对真菌菌落进行PCR反应,PCR产物测序后,通过NCBI blast 比对分析,以鉴定真菌种类。

表1 引物及crRNA序列Table 1 Primers and crRNA used in this study

1.3 主要试剂及仪器

SDA培养基及乳酸酚棉蓝染色液购自北京索莱宝科技有限公司;Twist-Amp Basic试剂盒购自英国TwistDX公司;T7高产率转录试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司;RNA Clean &Concentrator TM-5购自美国Zymo Research生物科技公司;Q5高保真聚合酶、RNA酶抑制剂及NEB缓冲液购自美国纽英伦生物科技公司;Cas12a(FrancisellatularensisCas12a)按照本实验室前期的表达纯化方法,使用大肠杆菌表达并通过镍柱进行纯化[23];引物、ssDNA的合成及基因测序均交由生工(中国上海)生物工程有限公司完成;Nano Drop 2000C购自美国赛默飞世尔科技公司;Azure C300凝胶成像系统购自美国Azure Biosystems公司。

1.4 PCR、RPA引物及crRNA的设计及合成

根据犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌ITS的基因序列(GenBank数据库登录号分别如下:犬小孢子菌AF168127.1,石膏样小孢子菌NR_131271.1,须毛癣菌MH858319.1),设计可同时识别犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌的crRNA(crRNA-DM),以及可分别特异性识别犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌的crRNA(crRNA-Mc、crRNA-Ng及crRNA-Tm)。根据crRNA所在的区域,设计可同时扩增上述三种皮肤癣菌的PCR引物及RPA引物(表1)。

使用crRNA引物,通过DNA退火方案形成crRNA转录模板。使用T7高产率转录试剂盒37 ℃过夜进行转录,使用RNA Clean&ConcentratorTM-5纯化转录产物。用Nano Drop 2000C进行检测并定量,分装保存至-80 ℃。

1.5 CRISPR/Cas12a检测方法的建立

使用PCR-F/PCR-R引物对(表1),利用PCR技术扩增靶基因。采用25 μL PCR反应体系:5 μL 5 ×Q5反应缓冲液、0.5 μL dNTPs、各1.25 μL的上、下游引物、0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶、5 μL 5 ×Q5 High GC Enchaner、9.75 μL ddH2O和2 μL DNA模板。扩增条件:98 ℃预变性30 s;98 ℃变性10 s,58 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,共35个循环;最后72 ℃延伸2 min。

分别使用crRNA-DM、crRNA-Mc、crRNA-Ng及crRNA-Tm进行CRISPR/Cas12a反应以检测犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌前期试验菌株。Cas12a反应体系20 μL:其中包含500 nmol·L-1Cas12a,500 nmol·L-1crRNA,2 μL扩增后的DNA产物,500 nmol·L-1ssDNA(FAM-GATCAAGAGCTA-BHQ1),0.5 μL RNA酶抑制剂,1.5 μL NEB r3.1缓冲液。该反应在37 ℃孵育15 min,并使用多标记微孔板检测仪检测荧光信号量。将Cas12a反应产物置于Azure C300凝胶成像系统中进行目测,观察颜色变化。

1.6 CRISPR/Cas12a检测灵敏度评价

使用PCR-F/PCR-R引物对扩增犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌试验菌株,通过PCR纯化试剂盒(OMEGA)纯化扩增产物,用Nano Drop 2000C进行定量。将PCR产物梯度稀释(0.1、1、10和100 nmol·L-1),参与Cas12a反应。

1.7 RPA-CRISPR/Cas12a检测灵敏度评价

使用不同拷贝数(100、101、102、103、104、105、106和107)的上述纯化后的PCR产物作为RPA反应的模板,使用Twist-Amp Basic试剂盒进行RPA扩增,39 ℃反应15 min。取2 μL RPA反应产物参与Cas12a反应。

1.8 RPA-CRISPR/Cas12a检测临床样本的敏感性与特异性评价

用RPA-CRISPR/Cas12a技术检测从24份临床样本中直接提取的DNA,并与标准检测结果进行比较,以评价Cas12a检测方法的敏感性和特异性。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 CRISPR/Cas12a检测方法的建立

分别使用crRNA-DM、crRNA-Mc、crRNA-Ng及crRNA-Tm检测犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌前期试验菌株的PCR扩增产物。crRNA-DM可以在DNA模板为犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌时均出现荧光量的明显升高,而crRNA-Mc、crRNA-Ng及crRNA-Tm仅在DNA模板分别为犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌时才会出现荧光量的明显升高,且荧光量与阴性对照相比差异极显著(P<0.001)(图2A～D),肉眼观察可见靶标基因参与的反应荧光明显,非靶标基因和阴性对照参与的反应几乎不可见荧光(图2E～H)。因此,将荧光量与阴性对照相比差异极显著(P<0.001)的检测结果判定为阳性。

2.2 CRISPR/Cas12a的检测灵敏度

使用不同浓度的靶基因扩增产物进行Cas12a反应。对于crRNA-Tm和crRNA-Mc,当靶基因浓度≥10 nmol·L-1时,试验组与对照组的荧光信号差异极显著(P<0.001)(图3A、B)。对于crRNA-DM和crRNA-Ng,当靶基因浓度≥100 nmol·L-1时,试验组与对照组的荧光信号差异极显著(P<0.001)(图3C、D)。结果显示,CRISPR/Cas12a的检测灵敏度可低至10～100 nmol·L-1。

A.D. 分别为使用crRNA-Tm、crRNA-Mc、crRNA-Ng及crRNA-DM的荧光检测结果。Ct为不含目的基因的阴性对照。***.P<0.001 A-D. Fluorescence detection results of crRNA-Tm, crRNA-Mc, crRNA-Ng and crRNA-DM respectively. Ct, negative control without the target DNA.***.P<0.001图3 CRISPR/Cas12a荧光报告系统的检测灵敏度Fig.3 Detection sensitivity of the CRISPR/Cas12a fluorescence reporting system

A.C. RPA-CRISPR/Cas12a的荧光检测结果;D～F. A～C所对应的目视检查结果。Ct为不含目的基因的阴性对照。***.P<0.001 A-C. Fluorescence detection of RPA-CRISPR/Cas12a; D-F. Visual detection to figures A-C. Ct, negative control without the target DNA. ***.P<0.001图4 RPA-CRISPR/Cas12a荧光报告系统的检测灵敏度Fig.4 Detection sensitivity of the RPA-CRISPR/Cas12a fluorescence reporting system

2.3 RPA-CRISPR/Cas12a的检测灵敏度

将靶基因进行10倍梯度稀释后,进行RPA-CRISPR/Cas12a检测。当使用100～107个拷贝的靶基因参与反应时,试验组和无模板对照组的荧光值均存在显著性差异(P<0.001)(图4A～C)。肉眼观察可见试验组的每个反应均有非常明显的荧光信号,且与无模板对照组差别明显(图4D～F)。结果表明,RPA-CRISPR/Cas12a的检测灵敏度可低至单个拷贝。

2.4 临床样本RPA-CRISPR/Cas12a检测效果评价

共采集了24份临床样本用于评价RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的敏感性和特异性。1～23号样本伍德氏灯检查结果均为阳性(4号和6号样本未进行伍德氏灯检查),直接镜检均可见小分生孢子或菌丝,经真菌培养、使用ITS1/ITS4引物对扩增真菌ITS区域及测序后均鉴定为犬小孢子菌(图5)。24号样本上述检查均为阴性。对24份临床样本直接提取基因组DNA后,进行RPA-CRISPR/Cas12a检测。使用crRNA-DM参与反应时,除24号样本外,其余23个样本的试验组和对照组的荧光值差异显著(P<0.001),肉眼观察可见试验组荧光信号均非常明显,且与阴性对照差别明显。使用crRNA-Mc参与反应时可得到与crRNA-DM相同的结果。使用crRNA-Tm和crRNA-Ng参与反应时,24个样本的试验组和对照组均未见明显的荧光信号。RPA-CRISPR/Cas12a成功检测到了临床样本中的23例犬小孢子菌阳性样本和1例皮肤癣菌阴性样本。结果表明,对于crRNA-DM和crRNA-Mc,RPA-CRISPR/Cas12a检测方法具有100%的敏感性和100%特异性(表2)。

M. DL2000 DNA相对分子质量标准;1～23. 对23例临床样本培养菌落的ITS区域进行扩增的目的片段;Ct. 空白对照 M. DL2000 DNA marker; 1-23. PCR products of the ITS region of colony culture from 1 to 23 clinical samples; Ct. blank control without any DNA target图5 23例皮肤癣菌菌落ITS区域的PCR扩增结果Fig.5 PCR products of ITS region of dermatophyte colonies in 23 cases

表2 RPA-CRISPR/Cas12a检测的敏感性与特异性评价Table 2 Evaluation of the sensitivity and specificity of RPA-CRISPR/Cas12a detection

3 讨 论

皮肤癣菌病是一种由亲动物性、亲土性或亲人性的致病性真菌引起的浅表皮肤病。在猫中,超过90%的皮肤癣菌病是由犬小孢子菌引起的[5,24],而石膏样小孢子菌和须毛癣菌则不太常见[25],英国的一项研究表明,在35年里,由石膏样小孢子菌导致的犬皮肤癣菌病的占比不到1%[26]。本研究共从宠物临床采集到23例犬猫皮肤癣菌临床样本,经真菌培养和测序均鉴定为犬小孢子菌。在本研究的样本采集范围内,犬小孢子菌感染更为常见,而石膏样小孢子菌和须毛癣菌感染相较而言不太常见。

犬小孢子菌等皮肤癣菌不属于健康犬猫正常菌群的一部分,一旦兽医从健康动物的被毛中分离得到皮肤癣菌,则提示该动物正处于亚临床感染状态或者该动物是病原真菌的携带者[1]。目前临床传统的诊断方法主要包括伍德氏灯检查、直接镜检和真菌培养,临床上对皮肤癣菌病的诊断主要通过一系列互补的诊断方式联合应用,尚无明确的“金标准”[1]。伍德氏灯检查非常方便,但其假阳性和假阴性率均较高。30%～100%犬小孢子菌感染的毛发在伍德氏灯下能发出苹果绿色的荧光[2,27],这些荧光来自犬小孢子菌产生的水溶性代谢物——蝶啶,而石膏样小孢子菌和须毛癣菌感染的毛发缺乏荧光[1]。此外,一些外用药物、碎屑等可能会产生假阳性结果[5]。研究表明伍德氏灯检测皮肤癣菌的敏感性和特异性分别为37.5%和96.1%[28]。直接镜检是一种相对简单、快速的诊断方法,但其容易受到采样技术、判读技术等的影响,导致误诊或漏诊的可能。据评价,该检测方法的敏感性为59%[5],假阴性率为5%～15%[27]。过去认为真菌培养是皮肤癣菌诊断的金标准,但真菌培养耗时较长,难以及时获得诊断结果,可能会延误治疗。操作人员的采样技术不熟练、接种技术不正确以及缺乏有经验的专业人员对培养结果进行评价都可能造成假阳性和假阴性结果[29]。基于PCR技术的分子学诊断方法较为快速准确,敏感性和特异性均较高[10,30-31]。有研究使用实时荧光定量PCR技术诊断132只猫是否患有犬小孢子菌导致的皮肤癣菌病,结果表明这种检测方法的敏感性为100%,特异性为88.5%[32]。因样本类型、样品制备和实验室条件都与PCR的诊断结果直接相关,且这种方法所需仪器较为昂贵、操作繁琐、对人员要求较高[33],在宠物临床使用具有局限性。实验室前期曾利用RPA-CRISPR/Cas12a技术检测犬猫皮肤癣菌病,其敏感性和特异性均为100%[23]。但其只针对犬小孢子菌和须毛癣菌,并不能特异性诊断出石膏样小孢子菌。虽然石膏样小孢子菌导致的皮肤癣菌病相对占比较低,但其仍然是导致犬猫皮肤癣菌病最常见的病原微生物之一,不容忽视。在本文中,作者首次建立了能够同时检测三种皮肤癣菌及特异性检测石膏样小孢子菌的RPA-CRISPR/Cas12a的检测方法。

针对犬猫皮肤癣菌的RPA-CRISPR/Cas12a方法,通过使用不同的crRNA,可以同时或分别检测到犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌。本方法的检测灵敏度可低至单拷贝,且Cas12a-crRNA复合物只有在识别到特异性靶标时,才能激活其切割活性,这使得本检测方法具有很高的特异性。使用crRNA-DM和crRNA-Mc对犬猫临床样本进行检测时,敏感性和特异性均为100%。因在试验周期内暂未收集到石膏样小孢子菌和须毛癣菌的临床样本,不能准确地对crRNA-Ng和crRNA-Tm的敏感性和特异性进行评价,但使用其对菌落PCR产物进行检测时,crRNA-Ng或crRNA-Tm能够特异性检测到石膏样小孢子菌或须毛癣菌PCR扩增产物,而不能检测到非靶标扩增产物,说明crRNA-Ng和crRNA-Tm在检测皮肤癣菌时效果较好。后续需要收集更多的临床样本来验证本检测方法的敏感性和特异性。RPA-CRISPR/Cas12a检测方法仅需30 min、在37 ℃下即可完成反应,所需仪器简单,在兽医快速检测疑似皮肤癣菌感染的病例上极具应用潜力。

4 结 论

RPA-CRISPR/Cas12a荧光法可快速检测犬猫皮肤癣菌病,可同时或分别检测犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须毛癣菌。本检测方法所需时间短,敏感性和特异性高,且无需昂贵仪器,适用于临床犬猫皮肤癣菌病的快速诊断。