马立克病病毒单克隆抗体库构建及gB蛋白特异性单抗的筛选与鉴定

李林燕,滕 蔓,刘金玲,郑鹿平,柴书军,丁 轲,余祖华*,罗 俊*

(1.河南科技大学动物科技学院,功能微生物与畜禽健康实验室,洛阳 471003;2.河南省农业科学院动物 免疫学重点实验室,农业农村部动物免疫学重点实验室,河南省动物免疫学重点实验室,郑州 450002; 3.河南省农业科学院,中英禽病国际研究中心,郑州 450002)

马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)早期感染雏鸡引起的一种重要的家禽免疫抑制病和淋巴细胞增生性肿瘤病,通常以外周神经、虹膜、皮肤以及多种内脏器官组织的单核细胞浸润为特征。1907年,Marek首次报道该病,并对主要的临床症状和剖检病变进行了描述[1]。1961年,为了纪念Jozef Marek的贡献,Biggs建议使用Marek’s disease来命名该病[2]。MDV感染不仅可引起严重的免疫抑制、增加其它疫病继发感染的风险,而且诱发肿瘤导致大批鸡死亡,更是给全球养禽业造成了巨大的经济损失。MDV的体内感染可分为4个阶段:第一阶段为早期溶细胞性复制阶段,此时病毒主要杀伤淋巴细胞并引起暂时性或持续性的免疫抑制,该过程主要取决于病毒株的毒力;第二阶段为潜伏感染阶段,在感染6～7 d之后,病毒感染进入潜伏期,此时不再检测到溶细胞性复制,且肿瘤尚未发生;第三阶段为晚期溶细胞性复制阶段,此阶段并不一定都发生,其发展及程度取决于宿主的抗病力和MDV毒株的毒力;第四阶段最终形成淋巴瘤或不形成淋巴瘤[3-4]。

MDV属于α疱疹病毒亚科,马立克病病毒属。与MD相关的家禽疱疹病毒主要包括3种:禽疱疹病毒2型(血清1型,MDV-1)、禽疱疹病毒3型(血清2型,MDV-2)和火鸡疱疹病毒1型(血清3型,MDV-3/HVT)[5]。除减毒疫苗株之外,只有MDV-1野毒株对宿主具有致病性和致瘤性。按照毒力差异,MDV-1分离株又可分为不同的致病型,包括温和毒型(mild MDV,mMDV)、强毒型(virulent MDV,vMDV)、超强毒型(very virulent MDV,vvMDV)和特超强毒型(very virulent plus MDV,vv+MDV)[6-7]。如CVI988和CU2毒株属于mMDV[8-9],JM、GA和HPRS-16毒株属于vMDV[10-12],Md5、RB-1B和GX0101属于vvMDV[13-15],648A和625毒株属于vv+MDV[6]。MD是人类历史上利用病毒疫苗免疫预防肿瘤疾病发生的首个成功案例。但是,随着MD疫苗在全球长期广泛的使用,MDV流行毒株的毒力持续增强,目前vv+MDV和变异株的出现已导致MD疫苗免疫保护失败,近些年国内外MD疫情频繁暴发,给世界养禽业健康发展带来新的挑战[16-19]。

MD的早期诊断对于该病的有效防控和及时止损至关重要。MD诊断的经典方法包括病毒分离培养、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等。最近10年,聚合酶链式反应、实时荧光定量PCR、重组酶聚合酶扩增等分子生物学技术手段相继建立[20]。其中,ELISA因操作简单、检测快速、敏感性高、特异性强,在动物疫病诊断中的应用最为成熟。抗体制备是建立ELISA方法和开发试剂盒的重要基础。1982年,Ikuta等[21]首次利用亲和色谱法纯化了MDV-1和HVT感染CEF培养物作为免疫原,结合细胞融合技术制备了MDV和HVT的单克隆抗体杂交瘤细胞库,并利用不同方法进行了系统的鉴定和分析。1983年,Lee等[22]用自己研制的单克隆抗体,进行了MDV分离株的血清型分类和鉴定。我国在MDV单抗研制方面起步较晚,直到20世纪80年代末才开始有学者进行相关研究,如利用MDV全病毒制备免疫原免疫小鼠制备了一些单克隆抗体等,但并未对其进行深入鉴定和应用[23-24]。随着分子生物学技术的发展,有学者相继用杆状病毒表达系统表达MDV编码的gB、gI和pp38蛋白[25],Meq蛋白[26-27]以及gE蛋白[28]等作为免疫原制备相应的单克隆抗体。由于MDV基因组比较庞大,编码上百种病毒蛋白和非编码RNA[29-30],但目前国内外已报道且可有效利用的单克隆抗体还非常少,难以满足MDV基因功能、致病与致瘤机制等相关基础研究和MD诊断技术开发的需求。因此,本研究利用MDV严格的细胞结合增殖特性,分别制备MDV感染CEF细胞核和细胞质蛋白免疫原,建立了特异性针对MDV编码的全病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞库,并从中筛选和鉴定特定病毒蛋白的特异性单克隆抗体,以期为后续相关研究提供关键试剂。

1 材料与方法

1.1 毒株、细胞和实验动物

MDV疫苗株CVI988、SB-1和HVT,均由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存。vvMDV标准毒株Md5和GX0101,由山东农业大学崔治中教授惠赠。293 T细胞和SP2/0骨髓瘤细胞,均由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存。用于制备CEF的SPF 种蛋,购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。6～8周龄纯系雌性BALB/c小鼠,购自郑州大学医学院实验动物中心。

1.2 培养基、抗体和试剂

M199培养基和胎牛血清(FBS),购自Gibco公司。1640培养基、蛋白预制胶、DAPI溶液(即用型),均购自Solarbio公司。NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents、LipofectamineTM2000均购自Thermo Scientific公司。胰蛋白酶-EDTA、蛋白酶抑制剂(100×)和ECL显色液,购自新赛美公司。鸡MDV阳性血清和阴性血清,由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室制备并保存。HRP标记羊抗鼠IgG、FITC标记羊抗鼠IgG、DyLight 488标记羊抗鼠IgG、DyLight 594标记羊抗鼠IgG以及DyLight 594标记羊抗鸡IgG,均购自Abbkine公司。羊抗鼠β-actin内参抗体,购自安诺伦(北京)生物科技有限公司。Western blot膜再生液,购自Solarbio公司。小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒,购自Proteintech公司。切向流超滤离心管,购自 Millipore公司。MDV-1 gB蛋白的真核表达质粒pEGFP-gB-N1,根据vvMDV标准毒株Md5(NCBI参考序列:NC_002 229.3)的gB基因全长序列(2 598 bp)进行密码子优化,由上海尚亚生物科技有限公司设计、合成并构建。

1.3 病毒增殖

取8～10 日龄SPF鸡胚制备CEF,细胞计数后用含5% FBS的M199细胞培养液稀释,按每瓶15 mL (含8×106个细胞)接种至T75细胞瓶中,置于38.5 ℃、5% CO2细胞培养箱内静置,过夜培养。待CEF长至汇合单层后,更换含1% FBS的M199细胞维持液,并接种vvMDV毒株Md5,感染96 h待出现大量病毒噬斑后,胰蛋白酶-EDTA消化,1 500 r·min-1离心10 min,收集病毒感染的CEF沉淀备用。

1.4 蛋白制备

用PBS重悬细胞团,转移至15 mL离心管,离心后弃净PBS。用NE-PERTMNuclear and Cytoplasmic Extracton Reagents提取病毒感染CEF的细胞核和细胞质蛋白,简述如下:首先加入10 mL冰浴的CER Ⅰ(加100 μL 100 ×蛋白酶抑制剂),大力涡旋15 s充分混悬细胞,冰上孵育10 min;然后加入500 μL冰浴的CER Ⅱ,高速涡旋5 s,冰上孵育1 min;再次高速涡旋5 s,16 000 r·min-1、4 ℃离心5 min。吸取上清,转至预冷的新离心管中,即为胞质提取物。剩余沉淀再次离心,16 000 r·min-1、4 ℃离心5 min,弃净上清。加入50 mL冰浴的NER(加50 μL 100×蛋白酶抑制剂),涡旋混匀15 s,冰浴10 min,再涡旋15 s,重复4次。16 000 r·min-1、4 ℃离心10 min,立即转移上清至冰浴的新离心管中,即为胞核提取物。最后,用切向流超滤离心管分别浓缩胞质提取物和胞核提取物,分离制备免疫原蛋白。

1.5 动物免疫

将浓缩后的胞质提取物和胞核提取物作为免疫原,分别免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠。初次免疫,将免疫原蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化,按50 μg·只-1的蛋白剂量颈背部皮下多点注射BALB/c小鼠。此后每隔3周,将免疫原蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂乳化后进行二免和三免,免疫方法和剂量与初免相同。三免后3周,采集免疫鼠尾静脉全血,进行间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测多克隆抗体血清效价。

1.6 细胞融合

选取效价较高的免疫鼠,用总量为100 μg的细胞核或细胞质蛋白腹腔注射进行超免。3～5 d后,无痛处死超免小鼠,取脾细胞与生长状态良好的SP2/0细胞,按常规方法进行融合。细胞融合培养7 d后,可在显微镜下观察杂交瘤细胞团是否产生,待细胞团长至细胞孔底面积2/3大小时,取50 μL杂交瘤细胞上清进行IFA检测。

1.7 间接免疫荧光试验

CEF细胞计数,用含5% FBS的M199培养基稀释后,将细胞悬液按100 μL·孔-1(含4.5×104个细胞)铺至96孔板中,置于38.5 ℃、5% CO2培养箱中静置培养过夜,待CEF长至致密单层后弃上清,换含1% FBS的M199细胞维持液,接种Md5病毒种。38.5 ℃、5% CO2培养箱静置培养3 d。显微镜下观察细胞状态,待出现较小病毒噬斑时,弃去培养基,每孔加入50 μL预冷的甲醇/丙酮(1∶1)固定液,室温固定10 min后弃净固定液,用含0.05% Tween-20的PBS溶液(PBST)洗3次,甩净PBST。每孔加入50 μL含5%脱脂奶的PBST,37 ℃温箱封闭30 min,甩净,PBST洗3次,甩净。每孔加入50 μL杂交瘤细胞上清,37 ℃温箱孵育30 min,甩净,PBST洗3次,甩净。每孔加入50 μL用5%脱脂奶PBS稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶500),37 ℃温箱孵育30 min,甩净,PBST洗3～5次,甩净。每孔加100 μL PBST,剔除气泡,置荧光显微镜下观察结果。凡是细胞上清与CEF阴性对照发生染色反应的杂交瘤一律丢弃,仅保留与MDV噬斑发生特异性阳性反应的杂交瘤细胞,用于进一步的筛选和鉴定。

1.8 单克隆抗体血清型特异性鉴定

取仅与MDV噬斑发生特异性阳性反应的的杂交瘤细胞株,按照有限稀释法进行2～3轮的单细胞亚克隆,纯化并建立单克隆抗体细胞系。再次利用IFA方法,同“1.7”所述对杂交瘤细胞上清进行检测,结果仍仅与MDV噬斑发生特异性阳性反应且与CEF阴性对照无反应的单克隆杂交瘤细胞株,冻存后置液氮中长期保存。留取的单克隆抗体杂交瘤细胞上清,分别用Md5、SB-1和HVT感染CEF,按“1.7”方法进行IFA检测,鉴定其对不同血清型毒株的交叉反应性和特异性。

1.9 gB蛋白真核表达及IFA筛选鉴定

将293 T细胞铺至24孔板,37.5 ℃、5% CO2培养箱静置培养,待细胞长至50%左右汇合度时。按照LipofectamineTM2000说明书,将pEGFP-gB-N1质粒转染至293 T 细胞,置于37.5 ℃、5% CO2培养箱中静置培养24 h,置荧光显微镜下观察出现EGFP绿色荧光后,分别用鸡MDV阳性血清、阴性血清和阳性杂交瘤细胞上清为待检一抗,Dylight 594标记的羊抗鸡IgG或Dylight 594标记的羊抗鼠IgG为二抗,按照“1.7”方法进行IFA检测,筛选gB蛋白特异性的阳性单克隆抗体。

1.10 单克隆抗体腹水制备及亚型鉴定

取无菌的液体石蜡,腹腔注射于经产BALB/c母鼠,0.5 mL·只-1。1～2周后,腹腔接种单克隆抗体杂交瘤细胞(3×106～6×106·只-1)。1周左右观察小鼠腹部及精神状态,待小鼠腹部明显膨大后,采集腹水,3 500 r·min-1离心10 min,吸取上清,-80 ℃保存备用。腹水效价按“1.7”方法进行IFA测定,同时按照小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书,对所筛选到的阳性单克隆抗体进行亚型鉴定。

1.11 共聚焦分析

CEF细胞计数后,用含5% FBS的M199培养基稀释混匀,以2 mL·孔-1(含1.3×106个细胞)铺至6孔板中,38.5 ℃、5% CO2培养箱中静置培养过夜,待CEF长至致密单层后弃上清,更换含1% FBS的M199细胞维持液并接种Md5病毒种。38.5 ℃、5% CO2培养箱静置培养3 d。待显微镜下观察出现典型病毒噬斑时弃去培养基,加胰蛋白酶-EDTA消化、收集、离心后,用含5% FBS的M199培养基重悬,以2 mL·孔-1(含3×105个细胞)铺至Φ15 mm共聚焦培养皿中,放入细胞培养箱培养1 d,待细胞贴壁以后,弃去培养基并向每孔中加入500 μL甲醇/丙酮(1∶1)固定液,室温固定10 min。弃净固定液,PBST洗3次,弃净PBST。每孔加入1 mL含5%脱脂奶的PBST,37 ℃温箱封闭30 min。弃净封闭液,PBST洗3次,弃净。每孔加入500 μL 含5%脱脂奶的PBST稀释的阳性单克隆抗体腹水(1∶10 000),37 ℃温箱孵育30 min,弃净,PBST洗3次,弃净;每孔加入500 μL Dylight 488标记的羊抗鼠IgG(1∶1 000),37 ℃温箱孵育30 min,弃净,PBST洗3次,弃净。每孔加入500 μL 含5%脱脂奶的PBST稀释的鸡MDV阳性血清或阴性血清(1∶1 600),37 ℃温箱孵育30 min,弃净,PBST洗3次,弃净;每孔加入200 μL 含5%脱脂奶的PBST稀释的Dylight 594标记的羊抗鸡IgG(1∶400),37 ℃温箱孵育30 min,弃净,PBST洗3～5次,弃净。最后,每孔加入500 μL PBST稀释的DAPI溶液(1∶1 000),室温孵育10 min,弃净,PBST洗3～5次,弃净。每孔滴加1 mL PBST,剔除气泡,置共聚焦荧光显微镜(LSM 800、Zeiss、德国)下观察并记录结果。

1.12 Western blot分析

收集Md5、SB-1和HVT感染的CEF和阴性对照细胞,分别加上样缓冲液煮沸后离心,取上清点样进行SDS-PAGE,快速转膜法转印至PVDF膜上,用含5%脱脂奶的PBST室温封闭2 h,用待检单克隆抗体腹水(1∶10 000)孵育,4 ℃冰箱过夜,PBST振摇洗涤3次,每次5 min。室温孵育5%脱脂奶稀释的HRP 标记的羊抗鼠 IgG(1∶1 000),PBST 振摇洗涤3次,每次5 min。按照ECL显色液使用手册操作说明进行显色,凝胶自动成像仪(FUSION FX5、VILBER LOURMAT、法国)上扫描分析结果。取出显色后的PVDF膜,加PBST振摇洗涤5 min取出,然后用5 mL Western blot膜再生液振摇洗涤10 min,弃去膜再生液后再用PBST振摇洗涤5 min。最后将PVDF膜再次按序孵育5%脱脂奶稀释的羊抗鼠β-actin内参抗体(1∶1 000)和HRP 标记的羊抗鼠 IgG(1∶1 000),ECL再次显色后,置凝胶自动成像仪上扫描分析结果。

2 结 果

2.1 免疫鼠血清多克隆抗体IFA效价测定

用Md5感染CEF,分别提取病毒/细胞培养物的细胞核蛋白和细胞质蛋白,各免疫BALB/c小鼠3只。三免后3周采集小鼠尾静脉全血,IFA测定多克隆抗体效价。结果显示,两种蛋白制备免疫原免疫小鼠均可产生特异性识别MDV噬斑的抗体,胞质蛋白和胞核蛋白免疫鼠大部分的IFA效价都很高、均可达到1∶3 200,并且前者较后者免疫效果更好(图1)。

2.2 MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库的构建及IFA筛选鉴定

各取胞质蛋白和胞核蛋白免疫的1号小鼠,分别超免后取脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞,按照常规方法进行细胞融合、铺板及培养。经过对杂交瘤细胞上清进行多轮的IFA染色筛选及单细胞亚克隆纯化鉴定,共获得 31 株稳定分泌特异性识别MDV噬斑的单克隆杂交瘤细胞(表1),从而建立了一个MDV特异性的单克隆抗体杂交瘤细胞库。统计显示,由MDV感染CEF的胞质蛋白免疫产生的阳性杂交瘤(编号1～26)占比达到83.9%,而由胞核蛋白免疫产生的阳性杂交瘤(编号27～31)仅占16.1%。分别用不同血清型MDV代表性毒株Md5、SB-1和HVT感染CEF,对表1列示的杂交瘤细胞上清进行IFA检测。结果显示,31株单克隆抗体杂交瘤细胞中,有4株(J-1F3-C6、J-5C3-F4、J-8B10-G11和J-4D9-C5)为MDV-1、MDV-2和HVT保守的阳性杂交瘤细胞,其余27株(87.1%)均为MDV-1特异性的阳性杂交瘤细胞(表1)。

2.3 MDV糖蛋白gB特异性单克隆抗体的筛选鉴定

用pEGFP-gB-N1质粒转染293T细胞,真核表达MDV编码的糖蛋白gB,然后分别以表1中列示的全部31株MDV阳性杂交瘤细胞上清、鸡MDV阳性血清或阴性血清为一抗,以Dylight 594标记的羊抗鼠IgG或羊抗鸡IgG为二抗,进行IFA染色。结果显示,pEGFP-gB-N1质粒转染的各组293T细胞中均可观察到EGFP的绿色荧光(图2),说明质粒转染成功并且均正常表达。31株待检MDV阳性杂交瘤细胞上清中,命名为J-1F3-C6的细胞上清和鸡MDV阳性血清一样,可与质粒转染表达的MDV糖蛋白gB产生特异性的红色荧光染色、且与pEGFP-gB-N1转染表达的EGFP绿色荧光完全重合,而在MDV阴性血清染色细胞中未见gB蛋白的特异性红色染色(图2)。上述结果表明,J-1F3-C6为特异性识别gB蛋白的单克隆抗体。

2.4 gB蛋白特异性单克隆抗体的制备及亚型鉴定

将 J-1F3-C6单克隆抗体杂交瘤细胞扩大培养,腹腔注射经产小鼠制备单克隆抗体腹水,然后用 MDV感染的CEF病毒噬斑和IFA染色测定单克隆抗体腹水的抗体效价。结果显示,J-1F3-C6单克隆抗体腹水的IFA效价为 1∶25 600。同时用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒进行检测,结果显示J-1F3-C6单克隆抗体的轻链型为Kappa、IgG亚型为IgG2a。

2.5 gB蛋白特异性单抗J-1F3-C6的应用分析

分别用不同血清型的MDV毒株(包括MDV-1超强毒株Md5、GX0101、疫苗株CVI988和MDV-2疫苗株SB-1)以及HVT分别感染CEF,利用IFA染色检测J-1F3-C6与不同来源的gB蛋白反应谱。结果显示,J-1F3-C6单克隆抗体与5种代表性毒株的病毒噬斑均呈现特异性阳性反应(图3)。共聚焦分析结果显示,J-1F3-C6对Md5感染CEF中表达的gB蛋白绿色荧光染色主要集中在细胞质内,而鸡MDV阳性血清对细胞质和细胞核内均有一定程度的红色荧光染色,并且这两种荧光具有很好的重叠性(图4)。进一步对部分毒株感染的CEF培养物进行Western blot分析,结果显示J-1F3-C6与Md5和HVT感染细胞样品均呈现三个分子量大小明显不同的特异性蛋白反应条带,而SB-1感染细胞样品和CEF阴性对照中均无对应的特异性蛋白反应条带(图5)。

3 讨 论

图2 MDV糖蛋白gB特异性单克隆抗体的IFA筛选鉴定Fig.2 Screening and identification of monoclonal antibody specific for MDV glycoprotein gB by IFA staining

MDV基因组庞大,编码上百种病毒蛋白,但目前可利用的单克隆抗体非常少,难以满足MDV基因功能、致病机制以及诊断试剂等相关研究的需求。根据MDV严格的细胞结合特性,本研究利用细胞核和细胞质提取试剂,分别制备了MDV感染CEF的细胞核和细胞质蛋白作为免疫原。该方法简单快速、可操作性强,仅需要1个T75细胞瓶培养的病毒培养物,即可制备足够多次使用的小鼠免疫原蛋白。利用该方法提取的细胞核和细胞质蛋白,虽然未经过纯化,但提取的蛋白中包含足够多的MDV全病毒蛋白。相对于原核表达或真核表达的病毒蛋白,该方法提取的免疫原蛋白不仅可能包含病毒编码的结构蛋白和非结构蛋白,而且它们的天然构象能够得以保持,避免了表达纯化过程中对原有生物学结构的破坏,比体外表达蛋白制备的免疫原更可靠。将提取的MDV感染细胞核蛋白和细胞质蛋白经超滤浓缩后分别免疫小鼠,产生的免疫抗体效价高并且特异性强,三免后小鼠血清多克隆抗体的IFA效价均可达到1∶3 200以上,说明该方法制备免疫原的可行性强。此外,利用该免疫原制备方法可以实现免疫一种抗原即可获得针对多种不同病毒蛋白、构建MDV单克隆抗体库的要求。最终,通过细胞融合并结合IFA染色的特异性筛选方法,成功构建了一个包含31个MDV特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株的抗体库,说明本研究采取的技术路线和方法非常成功。统计结果显示,上述单克隆抗体杂交瘤细胞株中,83.9%(26/31)的杂交瘤都是由细胞质提取蛋白免疫诱导产生,这可能与MDV编码表达的绝大部分结构蛋白和非结构蛋白都主要分布于细胞质中有关,也与病毒粒子的复制和包装主要位于细胞质中相一致。相反,MDV编码的蛋白主要分布于核内的较少,如致瘤蛋白Meq等。进一步的MDV血清型或HVT毒株特异性鉴定发现,该单克隆抗体库中有27株单克隆抗体是MDV-1特异性的,另外4株(J-1F3-C6、J-5C3-F4、J-8B10-G11和J-4D9-C5)是MDV-1、MDV-2和和HVT共同保守的单克隆抗体。该MDV单克隆抗体库的建立,不仅为后续MDV单克隆抗体的筛选鉴定及相关研究奠定了重要基础,而且为其它类似病毒的抗体研制提供了借鉴。

MDV基因组主要由长独特区(UL)和短独特区(US)构成,在其两侧分别是两个序列完全相同的反转重复序列区TRL/IRL和TRS/IRS。此前研究表明,独特序列区中编码的MDV基因与其它疱疹病毒具有高度的保守性[31]。在MDV-1、MDV-2和HVT编码的保守结构蛋白和非结构蛋白中,有9种糖蛋白包括gB(UL27)、gC(UL44)、gD(US6)、gE(US8)、gH(UL22)、gI(US7)、gK(UL53)、gL(UL1)和gM(UL10)在MDV的组装和复制中发挥重要作用。其中,gB蛋白是MDV复制所必需的,与其他疱疹病毒的保守性最高,在MDV感染和抗感染中起着重要的免疫保护作用[32]。gB蛋白是由三种分子量大小不同的糖蛋白(gP100、gP60和gP49)组成的蛋白复合物,是一种非分泌性抗原,主要存在于MDV感染细胞的胞质内和膜表面,可引起体液免疫和细胞免疫,具有一定的中和活性,在MDV基因工程疫苗研发中也曾被视为一个十分重要的保护性抗原[33]。本研究中,通过用真核表达质粒pEGFP-gB-N1转染293 T细胞,对MDV-1编码的gB蛋白进行表达,并结合IFA染色的方法从构建的MDV单克隆抗体库中成功筛选鉴定出一株gB蛋白的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株J-1F3-C6。该株单克隆抗体不仅在IFA染色中可识别全部3种不同类型的家禽疱疹病毒,而且在Western blot分析中也可以同时识别MDV-1毒株和HVT表达的三种分子量大小不同的gB蛋白条带。此外,用J-1F3-C6进行共聚焦分析的结果,也进一步验证了gB蛋白的非分泌性,表达后主要存在于MDV感染细胞的膜表面和胞质内[34]。

A. J-1F3-C6;B. β-actin图5 单克隆抗体J-1F3-C6与MDV感染CEF的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of the reactions between MDV-infected CEF cultures and monoclonal antibody J-1F3-C6

在此前的研究中,课题组已尝试利用切向流超滤浓缩和凝胶层析技术相结合的方法,建立一套较为温和的病毒粒子纯化方法并制备免疫原,构建了一个MDV单克隆抗体库并从中筛选特异性的病毒抗体[35]。与此相比,本研究建立的MDV单克隆抗体库从中筛选特异性的病毒蛋白单克隆抗体的效率更高。最近,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,我们还构建了MDV特定的靶蛋白如pp38和meq的基因编辑缺失毒株、并结合病毒噬斑IFA交叉筛选的策略,建立了一套高效筛选和鉴定MDV特异性单克隆抗体的新技术,大大提高了MDV单克隆抗体筛选的特异性[36-37]。由于gB基因是MDV复制的必需基因,无法通过基因编辑获得缺失毒株并用于单克隆抗体的筛选和鉴定。因此,在本研究中作者通过真核表达gB蛋白并结合IFA染色,从已建立的MDV单克隆抗体库中进行筛选和鉴定,很好地解决了这一问题。此外,本研究建立的31个MDV单克隆抗体杂交瘤细胞株中,仅将其中一株gB蛋白单克隆抗体的识别靶标得以鉴定。在后续研究中,仍有待对其它30株杂交瘤细胞株分泌抗体识别的抗原蛋白逐一进行挖掘和鉴定,虽然该项任务十分艰巨,但对其后续有效利用至关重要。本文相关数据,为后续MDV的基因功能、致病机制、诊断技术及产品研发奠定了重要基础。

4 结 论

本研究利用MDV严格的细胞结合特性,提取病毒感染细胞蛋白制备免疫原并免疫小鼠,同时结合IFA染色筛选的方法,建立了一个容量为31株单克隆抗体杂交瘤细胞的MDV单克隆抗体库,从中筛选鉴定了一株gB蛋白特异性的单克隆抗体J-1F3-C6,并且是MDV-1、MDV-2和HVT毒株保守的单克隆抗体,可用于IFA染色、共聚焦分析及Western blot试验。