表没食子儿茶素没食子酸酯对育肥猪骨骼肌纤维类型的影响

王丽娜，王　珍，彭建龙，王建兵，杨柯林，束　刚，王松波，朱晓彤，高　萍，江青艳

(华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广州 510642)



表没食子儿茶素没食子酸酯对育肥猪骨骼肌纤维类型的影响

王丽娜，王珍，彭建龙，王建兵，杨柯林，束刚，王松波，朱晓彤，高萍，江青艳*

(华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心，广州 510642)

本试验主要研究在饲粮中添加表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)对育肥猪肌纤维类型的影响。试验选用156日龄“杜×长×大”三元杂交育肥猪180头，平均体重为(85.02±1.15) kg，按组间体重、性别比例一致的原则，将育肥猪随机分成3组，每组6个重复，每个重复10头猪(5公5母)。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂在基础饲粮上分别添加0.025%、0.05% EGCG的试验饲粮。研究结果表明：1)育肥猪饲粮中添加0.025%的EGCG，能显著下调背最长肌乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)的活性(P<0.05)，减少MyHCⅠ、PGC-1α和mtTFA蛋白水平和MyHCⅠ、Tnnt1、Cytc和COXⅣmRNA的表达(P<0.05)；显著下调腰大肌LDH和琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase，SDH)的活性(P<0.05)，显著上调Ⅰ型肌纤维比例(P<0.05)，显著下调MyHCⅠmRNA的表达(P<0.05)，而MyHCⅡa、MyHCⅡx、MyHCⅡb 的mRNA显著上调(P<0.05)。2)育肥猪饲粮中添加0.050%的EGCG，能显著下调背最长肌LDH和SDH的活性(P<0.05)，降低活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平(P<0.05)，抑制AMPK的磷酸化、下调MyHC Ⅰ、PGC-1α、mtTFA和NRF-1的蛋白和mRNA表达(P<0.05)；显著下调腰大肌LDH和SDH的活性(P<0.05)，降低ROS水平(P<0.05)，下调MyHC Ⅰ蛋白和mRNA的表达、抑制AMPK的磷酸化和NRF-1的蛋白表达(P<0.05)，显著上调Ⅰ型肌纤维比例(P<0.05)。综上，育肥猪饲粮中添加EGCG后，可能通过EGCG清除ROS后引起AMPK活性减弱，降低PGC-1α表达，最终导致线粒体生物合成下降和慢肌纤维形成减少。

EGCG；育肥猪；肌纤维类型；线粒体生物合成

随着生活水平的不断提高，人们对肉品质的要求也越来越高。肌纤维类型与肉品质密切相关，直接影响肌肉色泽、嫩度和肌内脂肪含量。根据不同肌纤维中表达的特有肌球蛋白重链亚型可以将哺乳动物骨骼肌纤维类型分为Ⅰ型、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型，前者为慢肌纤维，后三者为快肌纤维。而骨骼肌具有高度可塑性，机体的自然生长发育或当机体受到某些生理变化、病理刺激和应激等时，细胞内相关信号通路就会发生改变，调节肌纤维特异基因的表达从而诱发肌纤维类型的转化[1]。已有研究表明，运动可以促进慢肌纤维的形成，且运动可以产生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，这揭示着ROS的增多可能促进慢肌纤维的形成[2-3]。并有报道ROS主要是通过激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)从而促进过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α(Peroxisome-proliferators-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)的表达[4-5]，而PGC-1α可以促进线粒体生物合成和慢肌形成[6-7]。表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)，是茶多酚生物活性的主要成份，具有抗氧化清除自由基的功能，在抗癌和心血管疾病中担当了重要角色，那么EGCG在清除自由基后对肉品质会不会有影响呢。

本试验采用饲粮中添加EGCG饲喂“杜×长×大”三元杂交育肥猪来研究EGCG对肌纤维类型的影响，为EGCG改变肉品质提供重要的理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验所用EGCG纯度99%，购自美国Sigma公司；Trizol、M-MLV Reverse Transcriptase、SYBR Green Realtime PCR Master Mix均购自美国Promega公司；RIPA细胞裂解液购自北京百泰克生物技术有限公司；BCA法总蛋白测定试剂盒购自美国Thermo scientific公司；试验中所用一抗MyHC Ⅰ购自英国Abcam，MyHC Ⅱ购自美国Millipore，AMPKα、p-AMPK、PGC-1α、NRF-1均购自美国Cell signaling technology，mtTFA购自美国Santa Cruz Biotechnology；二抗有羊抗兔、兔抗羊、羊抗鼠抗体，均购自北京博奥森生物技术有限公司；引物合成由美国life technology公司合成。ROS、己糖激酶(Hexokinase，HK)、乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)、琥珀酸脱氢酶(Succinatedehydrogenase，SDH)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2试验设计

试验采用单因素完全随机设计，选用156日龄三元杂交育肥猪180头，平均体重为(85.02±1.15) kg，按组间体重、性别比例一致的原则，将育肥猪分成3组，每组6个重复，每个重复10头猪(5公5母)。其中第1组为对照组，饲喂基础饲粮；第2组为0.025% EGCG组，饲喂每千克基础饲粮中添加了0.25 g EGCG的试验饲粮；第3组为0.05% EGCG组，饲喂每千克基础饲粮中添加了0.5 g EGCG的试验饲粮。饲喂基础饲粮3 d后开始试验，正式试验期为35 d。基础饲粮组成和营养水平见表1。

1.3试验管理

试验猪全期按猪场生产管理规程进行，保持各试验组管理与环境条件一致。按照猪场要求进行常规防疫，饲养栏舍为封闭、漏缝地板式猪舍。试验期间记录投料量，观察猪只健康。每个重复10头育肥猪饲养于同一栏中，每天定时喂料，自由采食及饮水。

表1基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

Table 1Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis)

%

1).每千克预混料含有：VA 5 300 IU，VD 1 500 IU，VE 24 mg，VK 1.16 mg，VB11.16 mg，泛酸5.6 mg，烟酸11.6 mg，VB61.68 mg，叶酸0.56 mg，生物素0.15 mg，VC 200 mg，胆碱600 mg，Mn 20 mg，Zn 52 mg，Fe 56 mg，Cu 36 mg，I 0.36 mg，Se 0.2 mg。2).消化能为计算值，其余均为实测值

1).Contained the following per kg of premix：VA 5 300 IU，VD 1 500 IU，VE 24 mg，VK 1.16 mg，VB11.16 mg，pantothenic acid 5.6 mg，nicotinic acid 11.6 mg，VB61.68 mg，folic acid 0.56 mg，biotin 0.15 mg，VC 200 mg，choline 600 mg，Mn 20 mg，Zn 52 mg，Fe 56 mg，Cu 36 mg，I 0.36 mg，Se 0.2 mg.2).DE was a calculated value，while the others were measured values

1.4检测指标

1.4.1样品采集试验结束，在每个重复中挑选1或者2个接近每组平均体重的个体颈静脉放血处死。固定部位采集背最长肌和腰大肌的肌肉样品，-80 ℃保存，用于组织切片ATPase染色、基因mRNA和蛋白表达水平检测、活性氧(ROS)水平和酶活性测定。

1.4.2ROS水平及糖代谢相关酶活性的测定背最长肌和腰大肌中ROS水平及己糖激酶、乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活性检测按南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书，在多功能酶标仪上进行测定。

1.4.3肌纤维分型(ATPase染色)将在-80 ℃保存的肌肉样品先置于冰冻切片的恒温箱内(-20 ℃)平衡，待样品温度平衡至-20 ℃时，垂直于肌纤维走向将组织块修成1 cm × 1 cm × 0.5 cm的整齐样品块。用包埋剂将组织块粘贴于组织样品冷冻头(切面与纤维走向垂直)，按照10 μm的厚度切片。制备好的切片分别经过酸性和碱性预孵后，依次进行SDH和ATP孵育，最后经CoCl2置换后用硫化铵显色，苏木精复染后脱水封片。

分型后的切片在40倍镜下拍照，每张切片4个视野。采用Motic Images Advanced 3.2软件分别计算MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa和MyHC Ⅱb型肌纤维数量的相对百分比。

1.4.4qPCR检测采用Trizol法提取背最长肌和腰大肌的总RNA，采用M-MLV及随机引物反转录成cDNA，用于后续的实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)检测并计算各基因mRNA表达丰度。具体反转录和Real-time qPCR的步骤：

反转录：2 μg消化后总RNA、3.0 μL 5 μmol·L-1的Oligo d(T)-18，加入DEPC水至15.0 μL，70 ℃预变性5 min，迅速取出并立即冰浴5 min。分别加入5.0 μL 5×Buffer、1.0 μL 200 U·mL-1M-MLV反转录酶、0.625 μL 40 U·μL-1Ribonuclease inhibitor、1.25 μL 10 mmol·L-1dNTP，加入DEPC水至25.0 μL；42 ℃反应60 min，70 ℃ 10 min。

Real-time qPCR：根据NCBI中GenBank发表的基因序列，采用Primer Primier 5.0软件设计各基因的上、下游引物(表2)。反应体系：1.0 μL 反转录产物、0.8 μL 5 μmol·L-1引物、10.0 μL 2×SYBR Green I Mix，加入去离子水至20.0 μL。反应条件：94 ℃ 预变性1 min；94 ℃ 15 s，53～62 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，40个循环。获得各基因Ct值，以GAPDH为内参，采用2-△Ct法计算样品中各基因mRNA表达丰度。

表2基因引物序列

Table 2Primer sequences of the target genes

序列号GenBankNo.基因Gene引物序列(5'-3')Primersequence产物大小/bpProductsize退火温度/℃AnnealingtemperatureNM_213855MyHCⅠSense:AAGGGCTTGAACGAGGAGTAGAAntisens:TTATTCTGCTTCCTCCAAAGGG11458NM_214136MyHCⅡaSense:GCTGAGCGAGCTGAAATCCAntisense:ACTGAGACACCAGAGCTTCT13758NM_001104951MyHCⅡxSense:AGAAGATCAACTGAGTGAACTAntisense:AGAGCTGAGAAACTAACGTG14955NM_001123141MyHCⅡbSense:ATGAAGAGGAACCACATTAAntisense:TTATTGCCTCAGTAGCTTG16652NM_213963PGC-1αSense:GTCCTTCCTCCATGCCTGACAntisense:TGGTTTGCATGGTTCTGGGT14560AY923074mtTFASense:GGTCCATCACAGGTAAAGCTGAAAntisense:ATAAGATCGTTTCGCCCAACTTC16754AY496013NRF-1Sense:TCCCTGGTGGTTCAGTAAGTAntisense:CAGAACAAGTAAGGGAGGACA26858BC049623COXⅣSense:CCAAGTGGGACTACGACAAGAACAntisense:CCTGCTCGTTTATTAGCACTGG13155NM_001129970CytcSense:CGACTCGTCCAAACCTCCAAntisense:CTTCGCTTTCTCCCTTCTTCTTA19858NM_213748Tnnt1Sense:ACAGGGCGTGAGATGAAACAntisense:GTGGCTGATGCGGTTGTA20458NM_001001863Tnnt3Sense:CCCAAACTCACTGCTCCTAAGAntisense:AACTCTGCTGCTCGGCTCT20558AF043486GAPDHSense:ATTCCACGGCACAGTCAAntisense:GGACTCCACGACATACTCAG13058

1.4.5Western Blot检测根据RIPA裂解组织样品的说明书裂解背最长肌和腰大肌肌肉样品，提取出总蛋白，并按BCA试剂盒说明书进行蛋白浓度测定，按20 μg单管分装样品，用于Western Blot的检测。使用5%浓缩胶和10%分离胶90 V电压电泳分离上述制备好的蛋白样品100 min，随后110 V电压将蛋白转移至PVDF膜上，目的条带用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，之后按照如下稀释比例用TBST稀释一抗，将膜在相应的一抗稀释液中4 ℃过夜孵育：MyHC Ⅰ(1∶2 000)、MyHC Ⅱ(1∶2 000)、PGC-1α(1∶2 000)、NRF-1(1∶2 000)、mtTFA(1∶500)、AMPKα(1∶2 000)、p-AMPK(1∶2 000)，接着用TBST洗5次，一次3～5 min，使用对应的二抗孵育1～2 h，并在多色荧光成像系统扫描拍照，最后使用蛋白灰度分析软件扫描灰度，统计各目的蛋白的表达结果。

1.4.6数据统计与分析采用 SPSS 17.0统计软件，应用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行差异显著性分析，采用LSD法进行多重比较，结果以“平均值±标准误(Mean±S.E.)”表示。

2　结　果

2.1饲粮中添加EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌ROS水平的影响

由图1可知，与对照组相比，0.05% EGCG组的背最长肌和腰大肌中的ROS水平均显著降低(P<0.05)，而0.025% EGCG组的背最长肌和腰大肌中的ROS水平均无显著变化(P>0.05)。

2.2饲粮中添加EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌糖代谢相关酶活的影响

由图2A、2B、2C可知，与对照组相比，0.05% EGCG组的背最长肌琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的活性显著降低(P<0.05)。0.025% EGCG组中，乳酸脱氢酶活性也显著降低(P<0.05)，而己糖激酶活性无显著变化(P>0.05)。从图2D、2E、2F可知，0.025% EGCG组和0.05% EGCG组的腰大肌琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶的活性显著降低(P<0.05)，而己糖激酶活性无显著变化(P>0.05)。

2.3饲粮中添加EGCG对背最长肌和腰大肌肌纤维类型的影响

由图3可知，与对照组相比，0.025% EGCG组和0.05% EGCG组背最长肌中肌纤维分型均无显著变化(P>0.05)。而在0.025% EGCG组和0.05% EGCG组腰大肌中Ⅰ型肌纤维比例均显著高于对照组(P<0.05)，而腰大肌中Ⅱa和Ⅱb型肌纤维的比例在3组中均无显著差异(P>0.05)。

A和B分别为背最长肌和腰大肌的ROS水平，无相同字母代表组间差异显著(P<0.05)A and B are the level of ROS in longissimus dorsi and psoas major，respectively，columns not sharing common letter are significantly different (P<0.05)图1　EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌ROS水平的影响(n=8)Fig.1　Effect of EGCG on the level of ROS in longissimus dorsi and psoas major in pigs (n=8)

A、B、C.背最长肌中HK、LDH和SDH的酶活性；D、E、F.腰大肌中HK、LDH和SDH的酶活性。无相同字母代表组间差异显著(P<0.05)A,B,C.The activity of HK，LDH and SDH in longissimus dorsi；D,E,F.The activity of HK，LDH and SDH in psoas major.Columns not sharing common letter are significantly different (P<0.05)图2　EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌糖代谢相关酶活的影响(n=8)Fig.2　Effect of EGCG on glycometabolism related enzyme activity in longissimus dorsi and psoas major in pigs (n=8)

A.背最长肌和腰大肌的ATP酶染色图(400×)；B.背最长肌和腰大肌的肌纤维类型切片染色统计图。无相同字母代表组间差异显著(P<0.05)A.The ATPase staining of longissimus dorsi and psoas major(400×)；B.The statistics of muscle fiber types in longissimus dorsi and psoas major.Columns not sharing common letter are significantly different (P<0.05)图3　EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌肌纤维类型分布的影响(n=4)Fig.3　Effect of EGCG on muscle fiber types distribution of longissimus dorsi and psoas major in pigs (n=4)

由图4A可知，与对照组相比，0.025% EGCG组和0.050% EGCG组的背最长肌MyHC Ⅰ的蛋白表达均显著降低(P<0.05)，而MyHC Ⅱ的蛋白表达无显著差异(P>0.05)。由图4B可知，与对照组相比，0.05% EGCG组背最长肌中MyHCⅠ、MyHCⅡb和Tnnt1的mRNA表达均显著降低(P<0.05)，且MyHCⅠ和Tnnt1在0.025% EGCG组mRNA表达也显著降低(P<0.05)。而饲粮中添加EGCG对背最长肌中MyHCⅡa、MyHCⅡx和Tnnt3的表达均无显著影响(P>0.05)。 由图4C可知，与对照组相比，0.050% EGCG组腰大肌中MyHC Ⅰ的蛋白表达显著降低(P<0.05)，而0.025% EGCG组MyHC Ⅰ的蛋白表达无显著变化(P>0.05)，各组MyHC Ⅱ的蛋白水平无显著差异(P>0.05)。

由图4D可知，与对照组相比，0.025% EGCG组和0.050% EGCG组腰大肌中MyHCⅠ的mRNA表达显著降低(P<0.05)，0.025% EGCG组腰大肌中MyHCⅡa、MyHCⅡx和MyHCⅡb 的mRNA表达均显著升高(P<0.05)；而饲粮中添加EGCG对腰大肌中Tnnt1和Tnnt3的表达均无显著影响(P>0.05)。

2.4饲粮中添加EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌线粒体合成相关基因的影响

由图5A可知，0.05% EGCG组背最长肌中pAMPK/AMPK、mtTFA、PGC-1α和NRF-1的蛋白表达均显著降低(P<0.05)，而0.025% EGCG组背最长肌中只有PGC-1α和mtTFA的蛋白表达显著降低(P<0.05)。 由图5B可知，与对照组相比，只有0.050% EGCG组腰大肌中pAMPK/AMPK和NRF-1的蛋白表达显著降低(P<0.05)。而饲粮中添加EGCG对腰大肌中PGC-1α和mtTFA的蛋白表达均无显著影响(P>0.05)。由图5C可知，与对照组相比，0.050% EGCG组背最长肌中PGC-1α、mtTFA、NRF-1、Cytc和COXⅣ的mRNA表达均显著降低(P<0.05)，且Cytc和COXⅣ在0.025% EGCG组背最长肌中mRNA表达也显著降低(P<0.05)。由图5D可知，与对照组相比，0.050% EGCG组腰大肌中Cytc和COXⅣ的mRNA表达显著降低(P<0.05)，0.025% EGCG组腰大肌中Cytc和COXⅣ的mRNA表达无显著差异(P>0.05)。而饲粮中添加 EGCG对腰大肌中PGC-1α、mtTFA和NRF-1的表达均无显著影响(P>0.05)。

A.背最长肌中MyHC Ⅰ和MyHC Ⅱ的蛋白条带图和蛋白统计图；B.背最长肌中MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa、MyHC Ⅱx、MyHC Ⅱb、Tnnt 1、Tnnt 3的mRNA表达统计图；C.腰大肌中MyHC Ⅰ和MyHC Ⅱ的蛋白条带图和蛋白统计图；D.腰大肌MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa、MyHC Ⅱx、MyHC Ⅱb、Tnnt1、Tnnt3的mRNA表达统计图。无相同字母代表组间差异显著(P<0.05)A.The protein expression of MyHC Ⅰ and MyHC Ⅱ in longissimus dorsi；B.The mRNA expression of MyHC Ⅰ，MyHC Ⅱa，MyHC Ⅱx，MyHC Ⅱb，Tnnt 1 and Tnnt 3 in longissimus dorsi；C.The protein expression of MyHC Ⅰ and MyHC Ⅱ in psoas major；D.The mRNA expression of MyHC Ⅰ，MyHC Ⅱa，MyHC Ⅱx，MyHC Ⅱb，Tnnt 1 and Tnnt 3 in psoas major.Columns not sharing common letter are significantly different (P<0.05)图4　EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌肌纤维分型的影响(n=4)Fig.4　Effect of EGCG on muscle fiber types of longissimus dorsi and psoas major in pigs (n=4)

A.背最长肌中p-AMPK、AMPK、PGC-1α、mtTFA和NRF-1的蛋白条带图和蛋白表达统计图；B.腰大肌中p-AMPK、AMPK、PGC-1α、mtTFA和NRF-1的蛋白条带图和蛋白表达统计图；C.背最长肌中PGC-1α、mtTFA、NRF-1、Cytc和COXⅣ的mRNA表达统计图；D.腰大肌中PGC-1α、mtTFA、NRF-1、Cytc和COXⅣ的mRNA表达统计图。无相同字母代表组间差异显著(P<0.05)A.The protein expression of p-AMPK，AMPK，PGC-1α，mtTFA and NRF-1 in longissimus dorsi；B.The protein expression of p-AMPK，AMPK，PGC-1α，mtTFA and NRF-1 in psoas major；C.The mRNA expression of PGC-1α，mtTFA，NRF-1，Cytc and COXⅣ in longissimus dorsi；D.The mRNA expression of PGC-1α，mtTFA， NRF-1，Cytc and COXⅣ in psoas major.Columns not sharing common letter are significantly different (P<0.05)图5　EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌线粒体生物合成相关基因表达的影响(n=4)Fig.5　Effect of EGCG on the mitochondrial biosynthesis related gene expression in longissimus dorsi and psoas major in pigs (n=4)

3　讨　论

3.1饲粮中添加EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌中ROS水平的影响

活性氧(ROS)是生物体有氧代谢过程中的一种副产物，包括氧离子、过氧化物和含氧自由基等。过高的ROS水平会对细胞和基因结构造成损坏[8-9]。然而最近的研究发现了生理浓度下的ROS在正常细胞的功能中起着一个重要的作用。事实上，ROS能通过细胞信号传导来调节细胞的生长、分化、增殖和凋亡[9-12]。已有研究表明，运动可以促进慢肌纤维的形成，且运动可以产生活性氧(ROS)，这揭示着ROS的增多可能促进慢肌纤维的形成[2-3]。而EGCG是一种抗氧化物，能够清除ROS。本试验中饲粮添加0.05% EGCG后，能显著降低育肥猪背最长肌和腰大肌的ROS水平，这与EGCG清除ROS的功能是一致的，也为EGCG逆转ROS的功能提供了可能。

3.2饲粮中添加EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌糖代谢相关酶活的影响

根据肌纤维所含的酶系、肌纤维的代谢特性及其活性特点，可将其分为酵解型、中间型、氧化型肌纤维。其中Ⅱb型纤维几乎完全以糖酵解为主，而Ⅱa型纤维既可以由糖酵解供能，也可以通过糖的有氧氧化供能，Ⅱx型纤维是介于Ⅱb和Ⅱa之间的一种纤维类型，其收缩能力和ATP酶活性也介于Ⅱb和Ⅱa之间。Ⅰ型纤维则是氧化型肌纤维，通过有氧氧化供能。因此，不同类型的肌纤维所含的酶及活力是不同的。己糖激酶(HK)是糖酵解的第一个步骤中重要的酶。乳酸脱氢酶(LDH)是一种糖酵解酶，催化丙酮酸生成乳酸的酶，它的活力能够反映无氧酵解的程度。琥珀酸脱氢酶(SDH)是线粒体的一种标志酶，由黄素蛋白、铁硫蛋白和2种膜蛋白亚单位组成，是唯一的同时参与三羧酸循环和电子传递链的有氧氧化酶[13]。有研究表明，EGCG能够减少琥珀酸脱氢酶黄素蛋白亚单位的表达[14]。此外众多的研究表明抗氧化剂能够抑制LDH的活性：给大鼠灌服抗氧化剂茶多酚，能够显著下调力竭运动后大鼠血清LDH活性[15]；给大鼠饲喂有抗氧化作用的黄芪总苷也能够降低运动后骨骼肌中的乳酸水平[16]。也有文献证明，用H2O2处理山羊骨骼肌细胞，能够上调细胞内的LDH活性[17]。这与本试验中添加不同浓度的ROS清除剂EGCG在不同程度上抑制背最长肌和腰大肌LDH和SDH的活性(P<0.05)的结果一致。综合以上结果，饲粮中添加EGCG能够降低糖酵解酶酶活，同时也降低有氧氧化酶酶活。

3.3饲粮中添加EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌肌纤维类型的影响

以往有报道证明，ROS可以调控心肌细胞中β-MyHC的表达[18]，但对骨骼肌细胞中各种类型的MyHC的表达是否有调控作用并未见报道。本研究采用ATP酶染色、qPCR和Western Blot的方法从代谢和MyHC基因表达的角度探讨了EGCG对骨骼肌肌纤维类型的影响。ATPase染色结果表明，饲粮中添加0.025%、0.050%的EGCG仅能显著提高腰大肌Ⅰ型肌纤维的比例(P<0.05)。然而，从背最长肌肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MyHC)蛋白及mRNA表达结果表明，饲粮中添加0.025%、0.05%的EGCG能显著降低背最长肌MyHC Ⅰ的表达(P<0.05)，同时慢骨骼肌肌钙蛋白(Troponin T type 1，Tnnt1)mRNA表达也显著降低(P<0.05)。饲粮中添加0.050%的EGCG能显著降低MyHC Ⅰ蛋白及mRNA表达(P<0.05)，但对MyHC Ⅱ蛋白表达无显著影响(P>0.05)。以上ATP酶染色结果与MyHC基因表达不一致，可能与检测的方法有关。ATP酶染色的方法得出的是单位面积各种类型肌纤维所占的比例，其结果受到肌纤维数目和肌纤维直径的影响，处理组Ⅰ型纤维比例的上调也可能是肌纤维直径较大，导致单位面积Ⅰ型纤维比例上调。而MyHC蛋白表达的结果与mRNA定量结果一致。综合以上结果，我们认为饲粮中添加EGCG主要减少Ⅰ型肌纤维的含量，而对Ⅱ型肌纤维的影响较小，同时，饲粮添加EGCG对背最长肌肌纤维类型的影响大于腰大肌。

3.4饲粮中添加EGCG对育肥猪背最长肌和腰大肌肌纤维类型影响的机制

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，是肌肉能量代谢的主要调节物，被称为“细胞能量调节器”[19]。过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ辅激活物1α(PGC-1α)是一种转录辅激活物，调节线粒体基因表达的关键因子。PGC-1α的过表达可以提高MyHC Ⅰ的表达[5]，PGC-1α的基因敲除可以促使Ⅱa型纤维向Ⅱx和Ⅱb转化[20]。AMPK的激活或抑制，可以影响PGC-1α的表达[21]，也可以影响MyHC基因表达和肌纤维类型特性[22]。AMPK被激活，PGC-1α的表达升高，MyHC的表达也升高。反之AMPK被抑制时，PGC-1α和MyHC的表达降低。已有研究报道，ROS能促进AMPK活性增强和PGC-1α表达升高[4]。而本研究已证明在育肥猪饲粮中添加0.05%EGCG能够显著下调肌肉中ROS水平。同时，蛋白定量结果表明背最长肌和腰大肌中AMPKα的活性也被显著抑制(P<0.05)，背最长肌中PGC-1α的表达显著下调(P<0.05)。综上，饲粮中添加EGCG可能通过清除ROS从而降低AMPKα的活性，并降低PGC-1α的表达，进而调控MyHC的表达，影响肌纤维类型。

此外，PGC-1α也可以通过诱导核呼吸因子1(Nuclear respiratory factor 1，NRF-1)的表达，从而促进线粒体的生物合成和氧化代谢[7]。而NRF-1能够提高线粒体转录因子A(Mitochondrial transcription factor a，mtTFA)的表达，mtTFA是调控线粒体DNA合成的一种蛋白[23]。细胞色素c(Cytochrome c，Cytc)是有氧氧化过程中的电子传递体，线粒体细胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase，COXⅣ)是与线粒体电子传递相关的一种酶。在人的骨骼肌细胞中，过表达PGC-1α增加了COXⅣ和mtTFA的mRNA及蛋白表达[24]。也有一些研究报道，ROS可能通过升高NRF-1、mtTFA和PGC-1α的表达来影响线粒体生物合成[25-27]。本试验也得到类似的结果，饲粮中添加EGCG能在不同程度上抑制背最长肌和腰大肌mtTFA、NRF-1和COXⅣ的表达(P<0.05)。综上，饲粮添加EGCG时，与线粒体的生物合成有关的蛋白mtTFA、 NRF-1和COXⅣ表达都减少了，这与前面糖代谢酶活结果一致。

4　结　论

育肥猪饲粮中添加EGCG后，能够在不同程度上降低肌肉中乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性，降低慢肌相关基因的表达，可能是通过清除肌细胞内ROS，抑制AMPK活性，从而抑制PGC-1α表达，导致线粒体生物合成下降和慢肌纤维形成减少。

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(编辑郭云雁)

Effects of EGCG on Muscle Fiber Types of Finishing Pigs

WANG Li-na，WANG Zhen，PENG Jian-long，WANG Jian-bing，YANG Ke-lin，SHU Gang，WANG Song-bo，ZHU Xiao-tong，GAO Ping，JIANG Qing-yan*

(NationalEngineeringResearchCenterForBreedingSwineIndustry，CollegeofAnimalScience，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

The aim of this study was to investigate the effects of Epigallocatechin Gallate (EGCG) on muscle fiber types of finishing pigs.One-hundred eighty crossbred finishing pigs (Duroc × Yorkshire × Landrace，156-day-old) with an average body weight of (85.02 ± 1.15) kg were selected for this study.According to the consistent principle of weight and sex ratio between groups，pigs were randomly divided into 3 groups，and each group with 6 repeats (10 pigs/repeat(5 male，5 female)).Control group was fed with basal diet，treatment groups were fed with basal diet supplemented with 0.025% and 0.05% EGCG，respectively.The results showed that：1) 0.025% EGCG could significantly decrease the activity of LDH，the protein level of MyHCⅠ，PGC-1α，mtTFA and mRNA expression ofMyHCⅠ，Tnnt1，CytcandCOXⅣ in pigslongissimusdorsi(P<0.05)；inpsoasmajormuscle，the activity of LDH and SDH and mRNA expression ofMyHCⅠwas reduced，the proportion of typeⅠmuscle fiber and mRNA expression ofMyHCⅡa，MyHCⅡx，MyHCⅡb were upregulated (P<0.05).2) Inlongissimusdorsi，0.05% EGCG treatment could significantly decrease the activity of LDH and SDH (P<0.05)，the level of ROS (P<0.05)，and activity of AMPK，the level of protein and mRNA expression of MyHCⅠ，PGC-1α，mtTFA and NRF-1 (P<0.05).While，inpsoasmajormuscle，0.050% EGCG treatment reduced the activity of LDH and SDH (P<0.05)，the level of ROS (P<0.05)，and the protein level and mRNA expression of MyHCⅠ，inhibited the phosphorylation of AMPK and protein expression of NRF-1 (P<0.05)，but the proportion of typeⅠmuscle fiber was upregulated.In conclusion，the effect of EGCG onlongissimusdorsiandpsoasmajorof pigs might be completed by reducing ROS level，thus decreasing the AMPK activity and the expression of PGC-1α，eventually reducing the formation of slow-twitch muscle fibers and mitochondria biosynthesis.

EGCG；finishing pigs；muscle fiber types；mitochondria biosynthesis

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.008

2015-09-06

国家重点基础研究发展计划(2012CB124701)；国家自然科学基金青年基金(31101780)；博士点基金新教师类(20114404120001)

王丽娜(1982)，女，山西太谷人，讲师，硕士生导师，主要从事动物营养生理研究，E-mail：wanglina@scau.edu.cn

江青艳，教授，博士生导师，E-mail：qyjiang@scau.edu.cn

S828；S821.2

A

0366-6964(2016)08-1581-11