玉米秸秆不同部位的蛋白质营养价值与其分子结构相关关系的研究

丁　雪，张幸怡，郝小燕，王晓帆，薛世崇，王明君，李仲玉，张永根，辛杭书

(东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030)



玉米秸秆不同部位的蛋白质营养价值与其分子结构相关关系的研究

丁雪，张幸怡，郝小燕，王晓帆，薛世崇，王明君，李仲玉，张永根*，辛杭书*

(东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030)

本试验旨在探求玉米秸秆不同部位蛋白质营养价值与其分子结构是否存在相关关系。采用常规化学分析方法并结合美国康奈尔大学净碳水化合物和净蛋白质体系(CNCPS)对玉米秸秆不同部位(苞叶、叶片、叶鞘、茎皮和茎髓)的蛋白质化学成分(粗蛋白(CP)、中性洗涤不溶蛋白(NDICP)、酸性洗涤不溶蛋白(ADICP)、非蛋白氮(NPN)、可溶性蛋白(SCP))及CNCPS中的蛋白组分(瞬时降解含氮部分(PA)、快速降解蛋白(PB1)、中速降解蛋白(PB2)、慢速降解蛋白(PB3)和不可降解蛋白(PC))进行测定，同时利用傅里叶变换红外光谱分析技术(FTIR)分析样本的蛋白质分子结构(酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、α-螺旋、β-折叠)，进而探求两者之间的相关关系。试验结果表明，玉米秸秆不同部位的蛋白质营养价值存在显著差异(P<0.05)，其中叶片的CP和NDICP最高(分别为8.78%和3.11%)，而CNCPS中的PA、PB3及PC组分在不同部位也存在明显的不同(P<0.05)。通过FTIR光谱扫描后，发现玉米秸秆5个部位的蛋白分子结构之间同样存在显著差异(P<0.05)，并且光谱参数与蛋白质营养价值存在明显的相关关系(P<0.05)，利用酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比以及α-螺旋与β-折叠峰高比、酰胺Ⅱ带峰值可以有效地预测CP含量(R2=0.804 7)、NDICP含量(R2=0.949 4)、ADICP含量(R2=0.600 9)以及蛋白组分中PC部分的含量(R2=0.647 1)。综上所述，玉米秸秆不同部位的蛋白质营养价值及分子结构都存在明显的差异，并且二者存在显著的相关关系。

玉米秸秆；蛋白质营养价值；蛋白质分子结构；FTIR；相关性

中国是农业大国，有着极其丰富的秸秆资源；据《“十二五”农作物秸秆综合利用实施方案》调查统计，2010年全国农作物秸秆理论资源量达到8.4亿吨，其中，玉米秸秆为2.73亿吨，占秸秆总量的32.5%。然而，玉米秸秆中各部位的营养成分含量不同，对玉米秸秆进行皮瓤分离[1]，并根据各部分的营养特性合理地使用，可以充分发挥秸秆资源的优势，使农业生产效益达到最大化。

傅里叶变换红外光谱分析技术(FTIR)是一种快速、直接、破坏性小的化学分析方法。与传统的化学测定方法相比，该方法能在不破坏生物样本组织内部结构的前提下检测出样本的分子结构特征[2-3]。众所周知，我们在测定蛋白质含量时往往采用传统的凯式定氮法，而这种方法却从根本上破坏了样本组织内部的分子结构。蛋白质的品质、营养价值以及动物对其利用情况不仅与总蛋白质和氨基酸的含量有关，与蛋白质内部的分子结构也是密不可分的[4]。在光谱中，酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带是蛋白质中主要的结构带，他们的峰高和峰面积强度能从数量上反映蛋白质官能团之间的差异[5]；在蛋白质二级结构的组成中，最具典型代表的是α-螺旋和β-折叠。饲料中不同的蛋白质光谱参数比(酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带的比值、α-螺旋与β-折叠的比值)在一定程度上能反映出蛋白质不同的溶解性及可消化性[6]。因此，利用FTIR分析技术，能够使我们对样本的蛋白质结构有更加全面地了解。

本试验旨在探求玉米秸秆不同部位的蛋白质分子结构参数与蛋白质化学成分、蛋白组分之间是否存在相关关系，能否通过光谱参数对其蛋白质营养价值进行预测评估，进而在分子结构层面对玉米秸秆不同部位的蛋白质效价进行更深地了解。

1　材料与方法

1.1试验样品采集与测定

于2014年10月在东北农业大学香坊实验基地采集3个不同玉米品种(郑单958，吉单27和先玉335)的秸秆部位，每个品种均采集20株，并人工将秸秆分成苞叶、叶片、叶鞘、茎皮和茎髓5个部位，以全株玉米秸秆作为对照。样品采集分离后65 ℃烘干至恒重、粉碎、混匀。部分样品用粉碎机粉碎过1 mm筛，用于常规化学成分分析；再取部分样品粉碎后过100目筛，用于光谱测定。

1.2测定指标及方法

1.2.1常规化学成分分析干物质(DM)的分析依据《饲料分析及饲料质量检测技术》[7]；粗蛋白(CP)、中性洗涤不溶蛋白(NDICP)和酸性洗涤不溶蛋白(ADICP)采用FOSS 8400全自动凯式定氮仪测定；可溶性蛋白(SCP)按照U.Krishnamoorthy等[8]的方法测定；非蛋白氮(NPN)采用三氯乙酸进行测定。并根据测定值及CNCPS[9]公式得出蛋白组分的含量。

1.2.2光谱数据的采集及分析将2 mg干燥的样品放入装有溴化钾的玛瑙研钵中，在红外烤灯照射下，研成粉末并充分混匀后，用红外专用压片机(型号：769YP-15A 粉末压片机)压成薄片。然后迅速用傅里叶变换红外光谱仪(ALPHA-T)(德国Bruker公司)对样品薄片进行光谱扫描，每个样品做5个重复。仪器程序参数设置如下：扫描波段在4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为128。

利用OMNIC 8.2软件对扫描样品后获得的红外光谱进行处理分析，着重分析位于1 710～1 532 cm-1以及1 532～1 488 cm-1波段的酰胺Ⅰ带(ca.1 604 cm-1)和酰胺Ⅱ带(ca.1 515 cm-1)，并通过软件中的二阶导数和去卷积功能找到α-螺旋(ca.1 655 cm-1)和β-折叠(ca.1 637 cm-1)所在的位置，然后记录他们的峰高和峰面积并进行后期的统计分析。

1.3统计分析

首先，试验数据需要利用Excel 2010表格进行初步处理，然后，采用SAS 9.2软件中的PROC MIXED对常规化学成分以及光谱峰值进行方差分析；再利用SAS 中的PROC CORR对两者的数据进行相关性分析，最后利用SAS中的回归分析程序在两者之间构建回归方程。

2　结　果

2.1玉米秸秆不同部位的蛋白质含量及CNCPS中蛋白组分含量

由表1可见，玉米秸秆不同部位之间的CP、NDICP、ADICP、NPN及SCP含量均差异显著(P<0.05)。叶片的CP、NDICP含量在秸秆各部分中均为最高(分别为8.78%和3.11%)；茎皮和苞叶的CP、NDICP含量均显著低于全株的CP和NDICP含量(P<0.05)。在ADICP方面，苞叶和茎髓的含量显著低于叶片和叶鞘的含量(P<0.05)。

从CNCPS中的蛋白组分来看，玉米秸秆不同部位的PA、PB3和PC值均差异显著(P<0.05)；其中，茎髓的PA值显著高于苞叶、叶片和叶鞘(P<0.05)；而苞叶、叶片和叶鞘的PB3值却显著高于茎髓(P<0.05)；茎皮的PC值显著高于叶片和茎髓(P<0.05)。

2.2玉米秸秆不同部位的蛋白质分子结构光谱参数值

由表2可见，玉米秸秆不同部位(苞叶、叶片、叶鞘、茎皮和茎髓)的蛋白质分子结构特征光谱区域的峰参数(酰胺Ⅰ带峰高、峰面积；酰胺Ⅱ带峰高、峰面积；酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰面积之和；酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比、峰面积比；α-螺旋、β-折叠峰高；α-螺旋与β-折叠峰高比)之间存在显著差异(P<0.05)。从蛋白质酰胺带概况来看，叶片的酰胺Ⅰ带峰高、峰面积，酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带总面积以及酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比、峰面积比均为最大；茎皮的酰胺Ⅱ带峰高和峰面积显著高于玉米秸秆其他部位的数值(P<0.05)。苞叶在酰胺Ⅰ带峰高、峰面积，酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带总面积上的数值中最小；叶片的酰胺Ⅱ带峰高、峰面积最小；茎皮的酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带的峰高比、峰面积比在秸秆各部分中数值最低。从蛋白质二级结构来看，叶片的α-螺旋、β-折叠峰高以及α-螺旋与β-折叠峰高比均为最大；茎髓的α-螺旋峰高、α-螺旋与β-折叠峰高比最小；苞叶的β-折叠峰高最小。

2.3蛋白质营养价值与蛋白质分子结构之间的相关关系

由表3可见，蛋白质化学成分(CP、NDICP、ADICP)与蛋白质的光谱参数(酰胺Ⅰ带峰面积、酰胺Ⅰ带与Ⅱ带的峰高比和峰面积比、α-螺旋峰高、β-折叠峰高、以及α-螺旋与β-折叠峰高比)存在显著正相关(P<0.05，r=0.580～0.944)；在蛋白组分中，PA值与蛋白质二级结构中α-螺旋与β-折叠的峰高比存在显著负相关(P=0.005，r=-0.629)，PB2、PB3与α-螺旋与β-折叠的峰高比存在显著正相关(P<0.05，r=0.525～0.614)；PC值与酰胺Ⅱ带峰高、峰面积存在显著正相关(P<0.05，r=0.502～0.574)。

2.4利用玉米秸秆不同部位的蛋白质分子结构参数预测蛋白质化学成分及蛋白组分

玉米秸秆不同部位的蛋白质分子结构参数与蛋白化学成分、蛋白组分之间建立的回归方程见表4。可以看出，在这些方程中，酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比、α-螺旋与β-折叠峰高比、以及酰胺Ⅱ带峰高、峰面积是最佳的预测因子。利用这些典型的蛋白质分子结构光谱参数能够有效的预测CP含量(R2=0.804 7)、NDICP含量(R2=0.949 4)；ADICP含量(R2=0.600 9)以及蛋白组分中PC部分的含量(R2=0.647 1)。

3　讨　论

3.1玉米秸秆不同部位的蛋白含量及蛋白组分差异

夏冬华等[10]通过体外积累产气的方法对玉米秸秆全株、叶片、茎皮和茎髓的营养成分进行评定，得出叶片的粗蛋白含量最高，茎皮的粗蛋白含量最低。闫贵龙等[11]在测定“农大108”玉米秸秆不同部位的化学成分中得出，叶片的粗蛋白含量最高，茎髓

表4玉米秸秆不同部位的蛋白质化学成分、蛋白组分与蛋白质分子结构参数之间的回归关系

Table 4Regression analysis between protein chemical profiles，protein sub-fractions and protein molecular structural parameters of different sections of corn stover

预测变量Predictedvariable(Y)自变量Variableselection(variablesleftinthemodelwithP<0.05)回归方程Predictionequation(testmodel:Y=b1x1+b2x2+a)DM/%酰胺Ⅱ带的峰面积AmideⅡarealeftinthemodelY=2.172×X1+92.322CP/(%/DM)酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比RatioofAmideⅠtoⅡheightleftinthemodelY=1.425×X3-0.300NDICP/(%/DM)酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比、α-螺旋与β-折叠峰高比RatioofAmideⅠtoⅡheight;Ratioofα-helixtoβ-sheetheightleftinthemodelY=0.262×X3+3.827×X4-2.240ADICP/(%/DM)α-螺旋与β-折叠峰高比Ratioofα-helixtoβ-sheetheightleftinthemodelY=0.877×X4-0.223PA/(%/CP)α-螺旋与β-折叠峰高比Ratioofα-helixtoβ-sheetheightleftinthemodelY=-74.669×X4+86.759PB2/(%/CP)α-螺旋与β-折叠峰高比Ratioofα-helixtoβ-sheetheightleftinthemodelY=24.861×X4+11.491PB3/(%/CP)α-螺旋与β-折叠峰高比Ratioofα-helixtoβ-sheetheightleftinthemodelY=43.565×X4-9.456PC/(%/CP)酰胺Ⅱ带峰高、酰胺Ⅱ带面积AmideⅡheightandAmideⅡarealeftinthemodelY=-937.614×X2+52.207×X1+8.789预测变量Predictedvariable(Y)R2值ModelR2value残差RSDP-值P-valueDM/%0.40101.0730.0048CP/(%/DM)0.80471.034<0.0001NDICP/(%/DM)0.94940.2120.0001ADICP/(%/DM)0.60090.1020.0002PA/(%/CP)0.395713.1560.0052PB2/(%/CP)0.27545.7500.0253PB3/(%/CP)0.37757.9760.0067PC/(%/CP)0.64712.4710.0004

X1.酰胺Ⅱ带峰面积；X2.酰胺Ⅱ带峰高；X3.酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比；X4.α-螺旋与β-折叠峰高比

X1.Amide II area；X2.Amide II height；X3.Ratio of Amide I to II peak height；X4.Ratio of α-helix to β-sheet peak height

其次，苞叶最低。周涛等[12]通过皮瓤分离玉米秸秆试验得出，在玉米秸秆各部位中，叶片的CP、NDICP、ADICP含量最高，茎皮的CP、NDICP含量最低；茎皮的ADICP占CP的比例显著高于苞叶、茎髓和茎皮部分；以上结果均与本试验得到的结果相一致。

CNCPS根据蛋白质在瘤胃中降解速度的不同将其分成PA、PB1、PB2、PB3和PC 5部分，其中，PA为非蛋白氮，它可在瘤胃中瞬时降解；PB1可在瘤胃中快速降解，为快速降解蛋白；PB2为中速降解蛋白；PB3为慢速降解蛋白；PC为不可降解蛋白，它主要是与木质素、单宁等成分结合的蛋白部分或是美拉德反应的产物，该部分在瘤胃中不能被微生物降解，因此不能被反刍动物利用。本试验中，玉米秸秆经过分离后，茎皮的PC含量最高，叶片、茎髓的PC值明显低于全株值，这说明，通过皮瓤分离技术可以将纤维性含量高、可利用养分低的茎皮部分分离出来，用于造纸、板材制作等工艺，而营养价值高的叶片和茎髓部分，可以被反刍动物利用，进而使玉米秸秆不同部位各尽其用，提高玉米秸秆在反刍动物方面的饲用价值。

3.2玉米秸秆不同部位蛋白质分子结构光谱值

酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带是蛋白质骨架的特异性拉伸和弯曲振动所产生的两种主要的蛋白质谱带[13]；与酰胺Ⅱ带相比，酰胺Ⅰ带的振动频率对蛋白质二级结构(α-螺旋和β-折叠)的变化表现的更为敏感[14-15]。本试验得出，玉米秸秆不同部位的酰胺Ⅰ带峰高、峰面积值显著不同(P<0.05)，其中，叶片的酰胺Ⅰ带峰高、峰面积值最高，苞叶的酰胺Ⅰ带峰高、峰面积值最低，这与传统化学方法测得的CP含量趋势相似(叶片CP：8.78%，苞叶CP：2.13%)。蛋白质二级结构影响胃肠道消化酶对蛋白质的消化作用。在样本组织中，即使蛋白的含量相同，但如果它们的二级结构中α-螺旋与β-折叠峰高比不同，它与肠道消化酶的作用也不会相同，进而导致营养价值也会有差异[16]。P.Yu等[17]在对羽毛蛋白质二级结构的分析中得出，羽毛中的β-折叠含量高、α-螺旋含量低是导致羽毛蛋白质利用价值低的原因。P.Yu等[18]在研究金色亚麻籽与棕色亚麻籽的蛋白质二级结构中得出，金色亚麻籽的α-螺旋与β-折叠峰高比高于棕色亚麻籽的比值，表明金色亚麻籽具有较高的蛋白质营养价值和利用率。本试验中，由于叶片的α-螺旋与β-折叠的比值显著高于叶鞘、苞叶、茎皮和茎髓部分，所以叶片在玉米秸秆各部分中蛋白质的利用率应为最高，这与在蛋白组分中，叶片的PB值最大的结果相一致(表1)。

3.3玉米秸秆蛋白质营养价值与蛋白质分子结构之间的相关关系

CP含量与酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的比值存在显著正相关。N.A.Khan等[19]在研究黄色亚麻籽和棕色亚麻籽蛋白质分子结构中得出，酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带的峰面积比与CP的含量表现为强相关性(r=0.91)；Q.Peng等[20]在研究农产品工业副产物的蛋白质分子结构中也得出相似结论(r=0.85)。NDICP含量与酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的比值存在显著正相关；这与P.Yu等[21]在研究DDGS蛋白结构光谱值与蛋白营养值之间的相关性中得出的结果一致。ADICP含量与酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的比值存在显著正相关，但H.Xin等[22]在研究中得出，酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比与ADICP存在显著负相关，出现这种差异可能是由于试验材料不同导致的。

蛋白质二级结构会影响蛋白质的营养价值[23]。本试验中，α-螺旋与β-折叠峰高比与NDICP、ADICP存在显著正相关，这与K.Doiron等[24]的研究结果一致；P.Yu[21]也在研究中得出，α-螺旋与β-折叠峰高比与ADICP存在正相关关系(P=0.09，r=0.91)。在CNCPS体系中，蛋白组分中的PA属于非蛋白氮，在反刍动物体内可以瞬时降解。X.Zhang[25]在研究复合饲料蛋白质分子结构与蛋白质瘤胃降解率的试验中得出，α-螺旋与β-折叠峰高比与蛋白组分中的PA值存在显著负相关，这与本试验得到的结果一致，然而P.Yu等[21]在研究中得出，α-螺旋与β-折叠峰高比与PA值不存在相关关系。出现这种差异的原因可能是在3组试验中采用的是不同种类的试验原料(分别为：复合饲料、玉米秸秆不同部位、不同类型的DDGS)。PB2、PB3分别为蛋白组分中的中速降解蛋白部分和慢速降解蛋白部分，吴鹏华[26]通过测定DDGS与豆粕混合饲料的蛋白质二级结构与蛋白组分相关关系时得出，α-螺旋和β-折叠的比值越高，PB2值越高。K.Doiron等[24]和Samadi等[27]在研究中得出α-螺旋与β-折叠峰高比与蛋白组分中的PB3呈正相关。本试验结果与上述例证一致。这表明我们可以通过测定蛋白质二级结构中α-螺旋与β-折叠峰高比来估测玉米秸秆不同部位蛋白组分中的PB2、PB3值。

3.4利用玉米秸秆不同部位的蛋白质分子结构参数预测蛋白质化学成分及蛋白组分

有研究表明，利用α-螺旋与β-折叠峰高比能够很好的预测蛋白质的溶解度及消化性[23]。本试验得出，能够利用蛋白质分子结构光谱参数(酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比、α-螺旋与β-折叠峰高比以及酰胺Ⅱ带峰高、峰面积)对蛋白质化学成分(CP、NDICP、ADICP)和蛋白组分(PA、PB2、PB3、PC)进行估测。其中，利用酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比、α-螺旋与β-折叠峰高比估测NDICP含量的回归方程拟合效果最好(R2=0.949 4，P<0.01)，利用酰胺Ⅰ带与酰胺Ⅱ带峰高比估测CP含量的回归方程拟合效果其次(R2=0.804 7，P<0.01)，虽然PA、PB2、PB3所在回归方程的决定系数R2偏小，拟合效果差，但PA、PB2、PB3仍与α-螺旋与β-折叠峰高比存在相关关系(P<0.05)。

4　结　论

玉米秸秆不同部位的蛋白质营养价值差异显著，而CNCPS中的PA、PB3及PC组分在不同部位也存在明显的不同。通过FTIR光谱分析发现,玉米秸秆5个部位的蛋白分子结构之间同样存在显著差异，且光谱参数与蛋白质营养价值存在明显的相关关系，并可利用玉米秸秆蛋白分子结构的光谱参数对其CP、NDICP、ADICP以及PC含量进行预测。

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(编辑郭云雁)

Protein Molecular Structure in Relation to Protein Nutritive Values at Different Sections of Corn Stover

DING Xue，ZHANG Xing-yi，HAO Xiao-yan，WANG Xiao-fan，XUE Shi-chong，WANG Ming-jun，LI Zhong-yu，ZHANG Yong-gen*，XIN Hang-shu*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

The objective of this study was to determine whether there was a relationship between protein nutritive values and protein molecular structures at different sections of corn stover.The protein chemical profiles (CP，NDICP，ADICP，NPN，SCP) and CNCPS protein sub-fractions (PA，PB1，PB2，PB3，PC) at different sections of corn stover (ear husk，leaf blade，leaf sheath，stem rind and stem pith) were determined by conventional chemical analysis method and the Cornell Net Carbohydrate and Protein System (CNCPS)；and the spectral parameters of protein molecular structures (including Amide I，Amide II，α-helix，β-sheet) were also analyzed by using the Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR).Then the relationship between them was evaluated in this study.The results showed that there were significant differences in the protein nutritive values at different sections of corn stover (P<0.05).The leaf blade had the highest level in CP and NDICP (8.78% and 3.11%，respectively).The sub-fractions such as PA，PB3and PC were also significantly altered at different sections of corn stover(P<0.05).By FTIR scanning，the protein molecular structures significantly differed among all corn stover sections(P<0.05).Subsequently，obvious correlations were found between protein chemical profiles，protein sub-fractions and protein molecular structures(P<0.05).The content of CP (R2=0.804 7)，NDICP (R2=0.949 4)，ADICP (R2=0.600 9) and PC (R2=0.647 1) might be predicted by using the peak height ratio of Amide I to Amide II and the peak height ratio of α-helix to β-sheet and peak value of Amide II.It could be concluded that both protein nutritive values and the protein molecular structures were significantly different at different sections of corn stover；and strong relationships between nutritive values and spectral parameters were also observed in this study.

corn stover；protein nutritive value；protein molecular structure；FTIR；correlation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.009

2015-10-15

国家科技部(2012BAD12B05-1)；东北农业大学青年才俊项目(14QC14)；黑龙江省教育厅科学项目(12511036)

丁雪(1990-)，女，黑龙江伊春人，硕士生，主要从事反刍动物营养与饲料科学研究，E-mail：dingxue1990w@163.com

张永根，教授，博士生导师，Tel：0451-55190840，E-mail：zhangyonggen@sina.com；辛杭书，副教授，E-mail：hangshu.xin@neau.edu.cn

S513；S501

A

0366-6964(2016)08-1592-09