贵州省鸭源新城疫病毒强毒株的遗传变异分析及致病性研究

段志强，许厚强，嵇辛勤，陈　强，胡　炎，胡顺林，刘秀梵*

(1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵阳 550025；3.扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，扬州 225009)



贵州省鸭源新城疫病毒强毒株的遗传变异分析及致病性研究

段志强1，2，许厚强1，2，嵇辛勤1，2，陈强1，胡炎1，胡顺林3，刘秀梵3*

(1.贵州大学动物科学学院，贵阳 550025；2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵阳 550025；3.扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，扬州 225009)

为了科学理解家鸭在新城疫病毒(NDV)流行和传播中的作用，对贵州不同地区分离的5株鸭源NDV强毒株进行遗传变异分析以及对鸭和SPF鸡的致病性研究。结果显示：5株NDV分离株均属于基因Ⅶd亚型，其F蛋白裂解位点基序均为112RRQKRF117，符合强毒株序列特征，与病毒致病性指数测定结果相符；F和HN蛋白中功能性氨基酸位点均高度保守，但在HN蛋白线性表位区有3株发生E347K突变。交叉血凝抑制试验发现分离株与传统疫苗株LaSota的抗原同源性较低(为83.3%～87.0%)，而与新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性较高(为93.5%～100%)。将5株NDV分离株以0.5 mL病毒尿囊液原液通过肌肉注射感染鸭后未见明显发病死亡和病理变化，并且除脾外在其他多个组织脏器未能检测到病毒复制；而以106.0ELD50·0.1 mL-1剂量通过滴鼻点眼感染SPF鸡后6 d内100%发病死亡，病死鸡表现出新城疫典型的临床症状和病理变化，病毒在多个组织脏器中均能复制且对脾、胸腺和法氏囊等免疫器官损伤严重。另外，SPF鸡攻毒后喉头和泄殖腔棉拭病毒分离率明显高于试验鸭。本研究结果表明，贵州省鸭群中流行的基因Ⅶd亚型NDV强毒株HN蛋白发生E347K突变的变异株呈上升趋势，并与传统疫苗株产生抗原差异；5株鸭源NDV强毒株对鸭和鸡致病性差异显著，虽然对鸭无明显致病性，但鸭感染后可在较长时间内通过喉头或泄殖腔向体外排毒，因此必须采取有效措施防止NDV强毒由鸭群向鸡群的传播。

新城疫病毒；基因Ⅶd亚型；遗传变异；致病性

新城疫(Newcastle disease，ND)是由禽副黏病毒Ⅰ型新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染禽类所引起的一种急性、高度传染性疾病，是目前危害世界养禽业的重要疫病之一，给多国养禽业造成了巨大的经济损失[1]。ND自1926年被确认以来，经过世界范围内的四次大流行，其宿主范围明显扩大，迄今能自然或人工感染的禽类已超过250余种。水禽被认为是NDV的天然储存宿主，ClassⅠ中的基因1型和ClassⅡ中的基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅶ型和Ⅸ型NDV均可从水禽中分离到[2]。过去一般认为水禽对NDV强毒株抵抗力强，即使感染也不会引起发病和暴发或流行。然而自1997年以来，国内多个省份均有水禽(主要是鹅)感染NDV发病死亡的报道，并呈扩大流行趋势[3]。对我国NDV分子流行病学研究结果显示，感染并导致水禽发病死亡的主要是基因Ⅶ型和Ⅸ型NDV，其中又以基因Ⅶ型NDV强毒株占绝对优势[4-6]。值得注意的是，虽然有些基因Ⅶ型NDV毒株对家鸭的致病力不强，但是人工感染鹅或鸡后却能造成严重的发病和死亡[7-8]。因此，要高度警惕家鸭携带的NDV强毒向鸡群或鹅群传播而对养殖业造成的严重威胁和损失，有必要加强对家鸭NDV的监测力度。

三穗麻鸭是我国四大蛋系麻鸭之一，同时也是贵州省地方优良畜禽品种。近年来，三穗麻鸭产业已成为贵州省特色优势产业，但随着其规模化养殖的快速发展同样导致了多种传染病的发生。为了解当前NDV强毒株在三穗麻鸭中的流行和遗传变异情况及其致病性，作者实验室从2014年6月至2015年12月对贵州省不同地区的三穗麻鸭进行NDV监测，分离得到5株NDV强毒株。作者进行了病毒的遗传变异分析和针对鸭和SPF鸡的致病性研究，以期对更好地理解家鸭在NDV流行和传播中的作用，以及为ND的科学防控提供理论依据。

1　材料与方法

1.1病毒

鸭源NDV分离株Duck/China/Guizhou/SS1/2014(SS1)、Duck/China/Guizhou/ZY/2014(ZY)、Duck/China/Guizhou/SS2/2015(SS2)、Duck/China/Guizhou/TZ/2015(TZ)、Duck/China/Guizhou/JH/2015(JH)系从贵州不同地区病死三穗麻鸭脏器或健康鸭泄殖腔棉拭子中分离，用NDV、禽流感H5和H9亚型标准阳性血清进行病毒鉴定。NDV分离株经蚀斑纯化3次后用9～11日龄SPF鸡胚进行病毒扩增，收集阳性鸡胚尿囊液用于病毒的序列测定、生物学特性鉴定以及动物试验。

1.2试验鸭、SPF鸡胚和SPF鸡

7日龄三穗麻鸭购自贵州三穗县兴绿洲农业发展有限公司，饲养至15日龄(经ND抗体检测阴性)进行攻毒。SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF鸡由SPF鸡胚自行孵化并于洁净动物房中饲养至30日龄用于攻毒试验。

1.3主要试剂

RNA提取试剂TRIzol Reagent、AMV反转录酶、高保真TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶和pCR2.1克隆载体购自Invitrogen公司；DNA Gel Extraction Kit和质粒小提试剂盒购自AxyGEN公司；6 nt随机引物、琼脂糖、DNA Marker购自上海生物工程有限公司。

1.4病毒的生物学特性测定

根据文献方法[9]，测定分离株的最小致死鸡胚量致死鸡胚平均时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)、6周龄鸡翅静脉接种致病指数(IVPI)和鸡胚半数致死量(ELD50)。

1.5引物合成、病毒RNA抽提及RT-PCR扩增

病毒F和HN基因扩增引物序列见参考文献[10]，由上海生物工程有限公司合成。按照TRIzol试剂说明书提取病毒RNA，用6 nt随机引物进行反转录，然后用F和HN基因特异性引物进行PCR扩增。胶回收PCR产物，经过T-A克隆后，将鉴定的阳性质粒送上海Invitrogen公司测序。每个样品送3份阳性质粒。

1.6病毒F和HN序列分析

运用Lasergen 7.1软件对测序基因片段进行拼接，应用Clustal X1.83和MEGA 6.0对F和HN基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与从GenBank下载的NDV代表性毒株序列进行比对分析，并根据F基因高变区47-420 nt序列构建系统进化发生树。

1.7病毒与疫苗株LaSota株和A-Ⅶ株的抗原性差异

将5株病毒分离株制备的疫苗以及LaSota和A-Ⅶ灭活疫苗(青岛易邦生物工程有限公司)分别免疫4周龄SPF鸡，制备单因子血清。参照文献方法[11]将上述7种NDV抗原和阳性血清进行交叉血凝抑制(HI)试验，试验重复3次，取3次平均值。毒株间的抗原相似系数用R来评价，公式：R=(r1×r2)1/2×100%，其中r1=异源血清效价1/同源血清效价1，r2=异源血清效价2/同源血清效价2。

1.8病毒对鸭和SPF鸡的致病性试验

1.8.1试验动物分组与设计将60只15日龄试验鸭随机分成6组(A1～A6)，每组10只；60只30日龄SPF鸡随机分成6组(B1～B6)，每组10只。A1～A5组用0.5 mL病毒尿囊液原液(SS1、ZY、SS2、TZ和JH株)以腿部肌肉注射途径进行攻毒，B1～B5组用106.0ELD50·0.1 mL-1病毒尿囊液稀释液以滴鼻点眼方式进行攻毒。A6和B6组为对照组，分别用0.5 mL和0.1 mL无菌PBS进行肌注和滴鼻点眼。试验动物分组情况见表1。

表1试验动物分组设计

Table 1Grouping design of experimental animals

组别Group毒株Strain试验动物Experimentalanimal日龄Age/day数量/只Number攻毒方式Inoculationroute攻毒剂量DoseA1SS1鸭1510肌肉注射5×108.38ELD50·0.5mL-1A2ZY鸭1510肌肉注射5×108.63ELD50·0.5mL-1A3SS2鸭1510肌肉注射5×108.34ELD50·0.5mL-1A4TZ鸭1510肌肉注射5×108.79ELD50·0.5mL-1A5JH鸭1510肌肉注射5×108.17ELD50·0.5mL-1A6*鸭1510肌肉注射0.5mLB1SS1SPF鸡3010滴鼻点眼106.0ELD50·0.1mL-1B2ZYSPF鸡3010滴鼻点眼106.0ELD50·0.1mL-1B3SS2SPF鸡3010滴鼻点眼106.0ELD50·0.1mL-1B4TZSPF鸡3010滴鼻点眼106.0ELD50·0.1mL-1B5JHSPF鸡3010滴鼻点眼106.0ELD50·0.1mL-1B6*SPF鸡3010滴鼻点眼0.1mL

* 表示试验所用溶液为无菌PBS

* indidicate sterile PBS was used in the experiment to replace virus

1.8.2试验鸭、鸡攻毒后临床症状和病理变化观察攻毒后每天观察并记录各组试验鸭和鸡的精神状态、采食变化、粪便颜色和发病死亡等情况。对病死鸭和鸡进行解剖，观察其组织脏器的病理变化情况。

1.8.3试验鸭和鸡喉头、泄殖腔排毒及抗体检测攻毒后第3、5、7和14天分别采集各组试验鸭和鸡的喉头及泄殖腔棉拭，经过处理后接种10日龄SPF鸡胚分离病毒，检测喉头和泄殖腔的排毒情况。另外，对攻毒后第7和14天存活的试验鸭和鸡于翅静脉采血，分离血清，用于NDV抗体滴度检测。

1.8.4试验鸭和鸡组织器官中病毒分布检测攻毒后第3天分别剖杀A1～A5和B1～B5组试验鸭或鸡，每组2只，无菌采取脑、心、肝、脾、肺、气管、肾、胸腺、胰腺、法氏囊、腺胃和十二指肠等12种组织，于-80 ℃保存。通过接种鸡胚分离病毒检测试验鸭和鸡组织器官中的病毒分布情况。

1.8.5试验鸭和鸡免疫器官病理组织学观察攻毒后第3天对剖杀的各组试验鸭和鸡采集脾、胸腺和法氏囊，用10%中性福尔马林溶液固定，将固定的组织样品进行脱水、石蜡包埋后制备病理切片，经过常规HE染色后观察其病理组织学变化。

2　结　果

2.15株病毒分离株的生物学特性测定

收集24 h以后死亡鸡胚尿囊液进行HA测定，分离的病毒均有血凝性；血凝抑制试验结果显示5株病毒与NDV标准阳性血清反应均为阳性，而与禽流感H5和H9亚型阳性血清反应均为阴性，说明5株分离株均为NDV。生物学特性测定结果显示，5株NDV分离株的MDT均小于60 h，ICPI均大于1.6，IVPI均大于1(表2)。根据国际兽疫局(OIE)的NDV毒力判定标准，5株病毒分离株均为强毒株。

[3] 吴拥政,何 杰,司林坡,等.义马矿区深部矿井地应力分布规律研究[J].煤炭科学技术,2018,46(10):16-21.

表2本研究中5株NDV试验毒株信息和生物学特性

Table 2Background information of 5 NDV isolates used in this study

毒株Strain来源Source地点Place时间Year生物学特性BiologicalcharacteristicsMDTICPIIVPIELD50·mL-1HASS1病死鸭脾三穗县201452h1.892.80108.388log2ZY健康鸭泄殖腔镇远县201446h1.922.62108.636log2SS2健康鸭泄殖腔三穗县201548.8h1.882.74108.347log2TZ健康鸭泄殖腔天柱县201550h1.782.55108.798log2JH健康鸭泄殖腔剑河县201552h1.722.74108.177log2

2.2F基因序列同源性及遗传进化分析

对5株NDV分离株F基因编码的氨基酸序列分析发现，F蛋白裂解位点氨基酸序列均为112RRQKRF117(表3)，符合NDV强毒株特征，与测定的病毒生物学特征相符。5株分离株F蛋白氨基酸序列相似性为97.8%～99.5%，其中SS1株与ZY株、SS2株与JH株相似性最高，均为99.5%，说明分离株之间亲缘关系较近。将分离株与国内外NDV参考株F蛋白氨基酸序列进行相似性比较分析发现：分离株与疫苗株LaSota及国内经典强毒株F48E8的相似性较低，分别为87.7%～88.4%和90.6%～91.9%；而与国内基因Ⅶ型NDV流行株的相似性较高，为96.7%～99.3%。对F蛋白功能区氨基酸位点分析发现，5株分离株F蛋白中的6个潜在糖基化位点和12个半胱氨酸残基均高度保守[12]；7个中和抗原位点均与当前流行的基因Ⅶ型NDV参考株以及疫苗株LaSota相同，未出现变异。根据F基因高变区(47—420 nt)核苷酸序列进一步绘制遗传进化树，结果显示5株NDV分离株与基因Ⅶd亚型NDV参考株GM、SD09、NA-1、ZJ1等处于同一分支(图1)，表明目前在三穗麻鸭中流行的NDV强毒为基因Ⅶd亚型NDV。

2.3HN基因编码的氨基酸序列分析

5株NDV分离株HN基因开放阅读框长度为1 716 bp，编码571个氨基酸，其HN蛋白氨基酸序列相似性为97.2%～99.3%，与疫苗株LaSota的相似性较低(为87.4%～88.5%)，而与基因Ⅶd亚型NDV参考株的相似性较高(为96.0%～99.1%)。对分离株HN蛋白氨基酸序列分析发现，HN蛋白中的13个半胱氨酸残基和13个唾液酸受体结合位点完全保守；4个糖基化位点(119、341、433和481位)也完全保守；HN蛋白上5个受体结合相关区域(193—201、345—353、494、513—521和569位)，仅在线性表位区345—353位氨基酸区域发生变化，其中5株NDV分离株中有3株在347位氨基酸发生了E347K的突变(表3)。

表35株NDV分离株及部分参考株F和HN基因的具体信息

Table 3TheFandHNgenes of NDV strains used in this study

毒株Strain基因型Genotype分离时间YearofisolationF基因登录号AccessionnumberofFgeneHN基因登录号AccessionnumberofHNgeneF蛋白裂解位点CleavagesiteofFproteinHN蛋白线性表位(345-353)Linearepitope(residues345-353)ofHNproteinSS1Ⅶd2014KP742770KP742770RRQKRFPDEQDYQIRZYⅦd2014KU933948KU933952RRQKRFPDKQDYQIRSS2Ⅶd2015KU933949KU933953RRQKRFPDKQDYQIRTZⅦd2015KU933950KU933954RRQKRFPDKQDYQIRJHⅦd2015KU933951KU933955RRQKRFPDEQDYQIRLaSotaⅡ1946DQ195265AY510092GRQGRLPDEQDYQIRF48E8Ⅸ1948GQ168924AY636144RRQRRFPDEQDYQIRNA-1Ⅶd1999DQ659677DQ659677RRQKRFPDEQDYQIRZJ1Ⅶd2000AF431744AF431744RRQKRFPDEQDYQIRGMⅦd2001FJ608343FJ608361RRQKRFPDKQDYQIRGuangxi11Ⅶd2003DQ485231DQ485231RRQKRFPDEQDYQIRJS-5-05-GoⅦd2005JN631747JN631747RRQKRFPDEQDYQIRSF02Ⅶd2006DQ363535DQ234582RRQKRFPDEQDYQIRXZ-9-08-ChⅦd2008GQ245812GQ245867RRQKRFPDKQDYQIRSD09Ⅶd2011HQ317395HQ317395RRQKRFPDEQDYQIR

图1　根据NDV F基因47-420位核苷酸绘制的系统进化发生树Fig.1　Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of the NDV F gene fragments (47-420 nt)

2.4病毒与疫苗株抗原差异检测

交叉HI试验结果显示，LaSota株抗血清与分离株的交叉HI效价比LaSota HI效价低1.3～2.7个滴度，A-Ⅶ株抗血清与分离株的交叉HI效价比A-Ⅶ HI效价低0.5～1.0个滴度，而分离株之间的交叉HI效价比分离株HI效价低0.3～1.5个滴度(表4)。抗原相似性计算结果表明，分离株之间的抗原同源性为91.2%～96.8%，分离株与疫苗株LaSota的抗原同源性较低(为83.3%～87.0%)，而与新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性较高(为93.5%～100%)；疫苗株LaSota与A-Ⅶ之间的抗原同源性为84.9%(表5)。以上结果表明目前流行的基因Ⅶd亚型NDV毒株与传统疫苗株LaSota在抗原性上存在较大差异。

表4不同NDV毒株交叉血凝抑制结果

Table 4The cross hemagglutination inhibition test among different NDV strains

毒株Strain抗血清HI效价(log2)Antibodytiter(log2)SS1ZYSS2TZJHLaSotaA-ⅦSS19.08.07.08.38.07.510.0ZY7.58.08.08.36.58.59.5SS28.77.58.07.37.58.310.0TZ8.07.07.78.06.78.79.3JH8.07.06.57.07.07.310.0LaSota8.57.08.08.07.010.09.0A-Ⅶ9.08.07.08.07.08.010.0

表5不同NDV毒株间的抗原同源性Table 5The antigen homology among different NDV strains

%

2.5试验鸭和鸡攻毒后临床症状和病理变化

试验鸭各攻毒组(A1～A5)和对照组(A6组)鸭的食欲、精神状况、粪便颜色等均正常，在攻毒后的14 d内未发现明显的发病和死亡，剖检后也没有明显的病理变化。

SPF鸡各攻毒组(B1～B5)大多数鸡于第2天开始表现出食欲减退、精神沉郁、排绿色稀粪、两脚麻痹，口角有水样黏液流出；第3天开始发生死亡；第5—6天攻毒组所有的鸡全部死亡，死亡率为100%。剖检发现病死鸡的喉头气管、腺胃乳头和十二指肠出血，肾肿大，脾淤血肿大并伴有坏死灶(图略)。对照组(B6组)SPF鸡食欲和精神等均正常。

2.6试验鸭和鸡喉头、泄殖腔排毒及抗体检测

A1～A5组试验鸭以肌肉注射攻毒后喉头、泄殖腔棉拭检测结果显示：A2和A4组试验鸭在第3、5、7和14天喉头和泄殖腔棉拭病毒检出率均明显高于A1、A3和A5组，其中仅A4组试验鸭在第14天喉头棉拭病毒检测为阳性，A1、A3和A5组试验鸭在14 d内泄殖腔棉拭病毒检测均为阴性。对照组(A6组)试验鸭喉头和泄殖腔病毒检测均为阴性(表6)。

B1～B5组SPF鸡以滴鼻点眼方式攻毒后，各攻毒组鸡在6 d内100%死亡。从第3天开始B1～B5组鸡喉头、泄殖腔棉拭病毒检测均为阳性，且B1和B4组第5天存活鸡的喉头、泄殖腔病毒分离仍为阳性。对照组(B6组)SPF鸡喉头、泄殖腔病毒检测为阴性(表6)。

5组试验鸭攻毒后的第7和14天，每组随机取5只采血进行NDV抗体检测，结果表明：5组试验鸭在攻毒后的第7和14天均可检测到NDV抗体，其中以A2组鸭在第7天的抗体滴度最高，为7.5 log2；各组试验鸭NDV抗体在第14天比第7天均有所下降(表6)，这与以往的报道结果相一致[8，13-14]。

2.7试验鸭和鸡组织器官中病毒分布检测

攻毒后第3天分别剖杀A1～A6和B1～B6组试验鸭和SPF鸡，采集脑、心、肝、脾、肺、肾、气管、腺胃、胸腺、胰腺、法氏囊和十二指肠等12种组织进行病毒检测，结果显示：A1～A5组试验鸭在脾中均可检测到病毒，仅A2组鸭在气管中检测到病毒，而其他各组鸭的多个组织器官中病毒检测均为阴性；B1～B5组攻毒后的SPF鸡组织器官病毒检测发现，在各组鸡的多个组织器官均能检测到病毒，仅B1和B4组鸡的肝组织中未检测到病毒(表7)。A6和B6正常对照组试验鸭和SPF鸡各组织器官病毒检测均为阴性。

2.8试验鸭和鸡免疫器官病理组织切片观察

攻毒后第3天剖杀A2和A6组试验鸭，对采集的脾、胸腺和法氏囊组织制备病理切片，观察结果显示：攻毒组鸭的脾有轻微出血，胸腺和法氏囊无病理组织学变化；正常对照组(A6组)鸭的脾、胸腺、法氏囊病理组织学观察均表现正常(图2)。

攻毒后第3天 B2组SPF鸡免疫器官组织病理学观察结果显示：鸡脾有多个坏死灶和显著的淋巴细胞减少；胸腺中有明显的坏死、组织增生以及淋巴细胞减少，胸腺小体结构被破坏；法氏囊中有大面积的坏死、滤泡髓质区淋巴细胞明显减少。正常对照组(B6组)SPF鸡的免疫器官病理组织学观察正常(图3)。

3　讨　论

自20世纪90年代以来，亚洲和非洲的许多国家和地区一直处于由基因Ⅶ型NDV毒株所引起的第4次大流行之中，给养禽业造成了巨大的经济损失[15]。对我国不同省份的NDV分子流行病学调查研究表明，基因Ⅶd亚型NDV是造成我国家禽ND暴发与流行的主要因素和主要优势流行毒株[4-6]。本研究从贵州省不同地区病死或健康三穗麻鸭中分离得到5株基因Ⅶd亚型NDV强毒株，对病毒囊膜表面糖蛋白F和HN序列分析发现，分离株F和HN蛋白中重要的功能性氨基酸位点均高度保守，未发生变异。有研究表明，HN蛋白上的线性表位区(345—353位氨基酸)是一个重要的受体结合区域，其中347位氨基酸多数为E[16]，但是2005年以后的研究发现NDV由E→K的变异株在逐年增加。2007年S.H.Cho等[17]首先报道了这种基因Ⅶd亚型NDV变异株的存在，并且这类变异株已成为韩国当前的主要流行毒株。2008年姚春峰等[18]对国内分离的15株基因Ⅶd亚型NDV进行了遗传变异分析，发现15株NDV中有3株发生了E347K的突变；而2009年吴双等[19]从16株NDV中发现了5株E347K突变的毒株。我们对贵州省近两年分离的5株NDV分析发现其中有3株NDV发生了E347K的突变，说明此类变异株在我国呈增多的趋势。这可能与当前ND疫苗大规模、高剂量的频繁使用有关，应该引起相关研究者的关注和深入研究。

目前普遍认为ND疫苗株与当前流行株之间的基因型和抗原性差异是引起禽群免疫失败的主要原因。国内外研究结果显示：传统疫苗株LaSota虽然对不同基因型的NDV强毒流行株能产生完全的临床保护，但是并不能防止流行株在免疫禽群中的感染复制和排毒[20-21]；只有当疫苗株与流行株的基因型一致时，不仅能提供理想的临床保护，还能显著降低免疫禽群的强毒感染率和排毒量[22]。本研究分离的5株NDV强毒株与传统疫苗株LaSota的F和HN蛋白相似性均较低，分别为87.7%～88.4%和87.4%～88.5%。同时，交叉HI试验也显示5株分离株与疫苗株LaSota之间的抗原同源性仅为83.3%～87.0%，而与新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性达93.5%～100%，表明目前贵州省NDV流行株与传统疫苗株在抗原性上存在较大差异，而与新型疫苗株的抗原性差异小。因此，使用新型ND疫苗对控制我国当前ND的发生和流行具有较大的优势[23]。

a.A2组脾出血；b.A2组胸腺无明显病变；c.A2组法氏囊无明显病变；d.A6组脾正常；e.A6组胸腺正常；f.A6组法氏囊正常a.Hemorrhage in the spleen of A2 group；b.No obvious thymus lesions in the A2 group；c.No obvious bursa lesions in the A2 group；d.Normal spleen in the A6 group；e.Normal thymus in the A6 group；f.Normal bursa in the A6 group图2　试验鸭免疫器官组织病理学观察(200×)Fig.2　Histopathology on immune organs from infected ducks (200×)

a.B2组脾坏死、淋巴细胞减少；b.B2组胸腺坏死、组织增生、淋巴细胞减少以及胸腺小体被破坏；c.B2组法氏囊坏死、滤泡髓质区淋巴细胞减少；d.B6组脾正常；e.B6组胸腺正常；f.B6组法氏囊正常a.Necrosis and decrease of lymphocytes in the spleen of B2 group；b.Necrosis，hyperblastosis，decrease of lymphocytes and destruction of thymic corpuscle in the thymus of B2 group；c.Necrosis and decrease of follicular medulla area lymphocytes in the bursa of B2 group；d.Normal spleen in the B6 group；e.Normal thymus in the B6 group；f.Normal bursa in the B6 group图3　试验鸡免疫器官组织病理学观察(200×) Fig.3　Histopathology on immune organs from infected chickens (200×)

有研究表明，相比鸭群而言，基因Ⅶd亚型NDV在鸡群和鹅群中具有更强的生存优势[23]，表现为对鸡和鹅具有高度致病性，而对鸭的致病性较低。本研究将NDV分离株分别以0.5 mL病毒尿囊液原液通过肌肉注射途径感染试验鸭，在攻毒后的14 d内鸭均无明显的临床症状，组织脏器病理学变化也不明显，并且除脾外其他多个组织未能检测到病毒复制，表明鸭对这5株基因Ⅶd亚型NDV强毒株抵抗力较强，这与国内外相关研究结果一致[8，13-14]。然而刘梅等[24]和Y.Dai等[25]同样用基因Ⅶd亚型NDV强毒株通过腿部肌肉注射0.2 mL病毒尿囊液原液感染15日龄麻鸭后4～6 d试验鸭100%发病死亡，这可能与试验所用的毒株和试验鸭品种有关。此外，SPF鸡的攻毒试验结果表明，以106.0ELD50·0.1mL-1剂量经滴鼻点眼感染SPF鸡后6 d内100%发病死亡，病死鸡表现出ND典型的临床症状和病理变化，病毒在多个组织脏器中均能复制且对脾、胸腺和法氏囊等免疫器官损伤严重。这与“基因Ⅶd亚型NDV可引起家禽免疫器官更为严重的组织病理损伤”报道结果一致[26]。排毒试验检测结果发现，攻毒后第3天试验鸡100%通过喉头和泄殖腔同时排毒，而试验鸭中仅个别鸭可在较长时间内通过喉头或泄殖腔排毒，说明NDV强毒在鸡体内的复制与增殖效率明显高于鸭，这是NDV强毒对鸡和鸭致病性存在差异的一个重要因素。此外，研究发现鸭和鸡在先天性免疫基因方面存在差异[27-28]，鸭的先天性免疫应答在抵抗病毒早期感染中发挥重要作用[29]，这可能是两者致病性存在差异的又一重要因素。

近年来，随着水禽养殖规模的不断增长，目前我国水禽饲养量和肉产量均占世界总量的75%以上。ND疫苗免疫是我国目前控制鸡群和鹅群NDV感染的主要措施，但是对于鸭群是否有必要进行ND疫苗免疫尚存在争议。根据国内外相关研究结果和本研究结果来看，基因Ⅶd亚型NDV强毒株对麻鸭无明显的致病性，因此不必对贵州省三穗麻鸭群进行广泛的疫苗免疫接种。但值得注意的是，虽然麻鸭感染NDV强毒株后不表现临床症状，但在一定时间内感染鸭可通过喉头或泄殖腔向环境中排毒，有造成其他禽群接触感染的危险。因此，针对我国养殖地区家禽养殖密度高、不同禽群接触频率高的现状，在家禽和水禽养殖密集区域，必须制定有效合理的ND疫苗免疫接种程序以避免NDV在水禽和家禽之间的相互传播。

4　结　论

贵州省三穗麻鸭群中主要流行基因Ⅶd亚型NDV强毒株，病毒的HN蛋白发生E347K突变呈上升趋势，并与传统疫苗株产生较大的抗原差异。5株鸭源NDV分离株对SPF鸡致病性强，而对麻鸭无明显致病性，但鸭感染后可在较长时间内通过喉头或泄殖腔排毒。

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(编辑白永平)

Genetic Variation and Pathogenicity Analysis of Virulent Newcastle Disease Viruses Isolated from Ducks in Guizhou Province

DUAN Zhi-qiang1，2，XU Hou-qiang1，2，JI Xin-qin1，2，CHEN Qiang1，HU Yan1，HU Shun-lin3，LIU Xiu-fan3*

(1.CollegeofAnimalScience，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegionofMinistryofEducation，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；3.KeyLaboratoryofAnimalInfectiousDiseasesofMinistryofAgriculture，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

To better evaluate the role of domestic ducks in the epidemiology and transmission of NDV，five virulent NDV strains isolated from ducks in Guizhou Province were used to study their genetic variation and pathogenicity in ducks and SPF chickens.Sequence analysis showed that all the strains belonged to subgenotype Ⅶd NDV and had the velogenic motif112RRQKRF117in the cleavage sites of F protein，which was consistent with the results of biological tests.The functional amino acid sites in the F and HN proteins were all highly conserved，but three strains with E347K mutation were detected in the linear epitope of HN protein.Cross hemagglutination inhibition test revealed that the antigen homology of the isolates between LaSota and A-Ⅶ were 83.3%-87.0% and 93.5%-100%，respectively.In the challenge test，ducks of different groups challenged with virus allantoic fluid intramuscularly at the dose of 0.5 mL showed no obvious clinical symptoms and histopathologic changes，and viruses could not be detected in multiple tissues except for the spleen.On the contrary，SPF chickens infected with NDV strains intranasally at a dose of 106.0ELD50·0.1 mL-1died in 6 days and showed typical clinical symptoms.Viruses could replicate in multiple tissues and cause severe damages to spleen，thymus and bursa in chickens.In addition，viruses were detected more frequently in the laryngeal and cloacal swabs of chickens than ducks.These results showed that subgenotype Ⅶd NDV strains with E347K mutation on HN protein significantly increased and had the antigenic differences with traditional vaccine strain.Although all the NDV strains were virulent in chickens whereas had no obvious pathogenicity in ducks，some measures should be taken to prevent virus transmission from ducks to chickens as viruses were detected in swabs of virulent NDV infected ducks for a long time.

Newcastle disease virus；subgenotype Ⅶd；genetic variation；pathogenicity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.013

2016-03-23

国家自然科学基金项目(31502074)；教育部“促进与美大地区科研合作与高层次人才培养项目”(教外司美[2014]2029号)；贵州省省校合作计划项目(黔科合LH字[2014]7669号)；公益性行业(农业)科研专项(201303033)

段志强(1985-)，男，湖北襄阳人，讲师，博士，主要从事家禽重要疫病发病机制和免疫机制方面的研究，E-mail: zqduan@gzu.edu.cn

刘秀梵，Tel: 0514-87991416；E-mail: xfliu@yzu.edu.cn

S852.659.5；S855.3

A

0366-6964(2016)08-1623-12