时间:2024-07-28
马圣明,滕 蔓,余祖华,党 露,李会珍,丁 轲,邓瑞广,罗 俊*
(1.河南科技大学动物科技学院,动物疫病与公共安全重点实验室,洛阳 471003;2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室,农业部动物免疫学重点实验室,河南省动物免疫学重点实验室,郑州 450002;3.河南农业大学牧医工程学院,郑州450002)
马立克病病毒超强毒株GX0101感染宿主部分病毒基因表达水平及致病阶段分析
马圣明1,2,滕蔓2,余祖华1,党露2,李会珍3,丁轲1,邓瑞广2,罗俊1,2*
(1.河南科技大学动物科技学院,动物疫病与公共安全重点实验室,洛阳 471003;2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室,农业部动物免疫学重点实验室,河南省动物免疫学重点实验室,郑州 450002;3.河南农业大学牧医工程学院,郑州450002)
旨在探讨马立克病病毒(MDV)超强毒株GX0101对宿主的感染过程及致病阶段,即“Cornell模型”,为进一步使用该毒株研究MDV的致病或致瘤机制奠定基础。用GX0101接种1日龄SPF鸡,建立了感染宿主的动物模型;然后用RT-qPCR分析10个具有代表性的MDV蛋白编码基因在感染不同时间点的动态基因转录水平。结果显示,GX0101感染发病鸡的临床症状及剖检病变与典型的马立克病一致;MDV编码的结构蛋白基因gB、gE和UL6、非结构蛋白基因UL42和UL52、立早期基因ICP4、水平传播相关基因UL13以及磷酸化蛋白基因pp38具有相似的转录水平和趋势,均在GX0101感染后7 d上升至第一个峰值,10 d降至低谷,14 d又逐渐升高并在21 d达到第二个峰值,30~60 d逐渐下降并处于较低的转录水平;MDV编码的原癌基因meq和毒力相关基因RLORF6在GX0101感染7 d即持续升高,并在14~60 d的试验周期内较长时间处于高转录水平。结合作者此前研究及本文结果分析,GX0101感染宿主的“Cornell模型”:早期增殖性-限制性感染期为1~7 d,潜伏感染期约为10 d前后,晚期溶细胞性感染及免疫抑制期发生于14~21 d,而T细胞转化及淋巴瘤形成阶段可能在14 d前后就已经开始。
马立克病病毒;超强毒株;GX0101;实时荧光定量PCR;基因表达;致病阶段
鸡马立克病(Marek’s disease,MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的一种肿瘤性免疫抑制性传染病[1]。MDV是一种严格的细胞结合性疱疹病毒,属于α疱疹病毒亚类的马立克病病毒属,该属成员又分为三个血清型,即血清1型(MDV-1)、血清2型(MDV-2)和和火鸡疱疹病毒(HVT),在最新的病毒分类中又被重新命名为禽疱疹病毒2型(GaHV-2)、禽疱疹病毒3型(GaHV-3)和火鸡疱疹病毒1型(MeHV-1)[2]。三种血清型密切相关但又各有异同,仅MDV-1具有致病性和致瘤性。根据毒力及致病性的不同,MDV-1流行毒株又分为温和MDV(mMDV)、强毒MDV(vMDV)、超强毒MDV(vvMDV)以及特超强毒MDV(vv+MDV)。目前,虽然可以用病毒疫苗较好地预防MD肿瘤发生,但伴随着疫苗免疫压力及病毒自身进化,MDV流行毒株的毒力正不断增强[3]。近年来,我国MD疫情时有暴发[4-9],MDV感染鸡群后不仅导致宿主免疫抑制,而且在后期引发肿瘤及大批鸡死亡,长期给世界养禽业造成巨大经济损失。
MDV-1早期感染雏鸡后,可在宿主体内建立持续性感染并终身带毒,发病后期导致内脏多发性肿瘤。美国康奈尔大学的学者早期研究认为,MDV-1对易感宿主的致病过程(后来亦被称为“Cornell模型”)一般包括4个阶段[10-11]:早期增殖性-限制性感染(2~7 d)、潜伏感染(7~10 d)、第二次溶细胞性感染免疫抑制期(18 d~)和淋巴瘤形成阶段(28 d~)。此后相关研究表明,MDV-1不同流行毒株感染宿主的“Cornell模型”可能存在明显差异,如vvMDV毒株RB1B在鸡胸腺组织的潜伏感染建立约在14 d左右,第二次溶细胞感染阶段则可能为21~28 d[12]。这表明MDV的感染及致病不仅过程复杂,而且不同毒株之间也可能存在较大差异。MDV基因组较为庞大,全长约180 kb、编码200个左右的潜在开放阅读框(ORF),但已知病毒蛋白及功能较为清楚的仅有数十种。进一步深入研究MDV编码的基因及功能,对于MD的有效防控具有重要意义。因此,选择具有代表性的MDV毒株并明确其感染致病的“Cornell模型”,对于后续针对关键时间节点开展MDV致病机制研究来说至关重要。
GX0101是我国学者从临床发病鸡体内分离到的第一个含有禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendothelial hyperplasia virus,REV)长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)的重组野毒株,该毒株是一个vvMDV毒株,在致病性及水平传播等方面都具有独特的生物学特征[13-14]。此前,GX0101毒株已经被成功地构建成为具有感染性的细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)病毒克隆[15],并在此基础上研究发现REV—LTR的重组插入显著增强了GX0101的水平传播能力[16],同时利用BAC克隆还对GX0101病毒全基因组的序列进行了测定分析[17-18]。这是目前国内学者完成的第一个vvMDV全基因组测序的中国分离株,同时也是少数几个国际上全基因组序列已知的vvMDV毒株之一。最近几年,以GX0101为亲本毒株,我们已对MDV编码的病毒miRNA的基因表达及功能进行了系列研究,并发现部分miRNA在MDV-1致病、致瘤过程中发挥重要的调控作用[19-23]。为了进一步应用GX0101开展MDV的转录组学、基因功能、感染致病以及致瘤机制等相关研究,有必要首先了解该毒株感染宿主的“Cornell模型”。
在MDV编码的病毒基因与蛋白中,功能较为清楚的结构蛋白如糖蛋白gB主要参与细胞的吸附和病毒侵入[24],gE主要参与病毒在细胞之间的传播[25],UL6作为次要衣壳蛋白主要参与DNA包装等过程。非结构蛋白中UL42是MDV病毒复制必须的DNA聚合酶,UL52主要发挥DNA解旋酶的功能[26]。ICP4作为转录调控子,主要参与激活其他病毒基因的功能并在MDV的潜伏感染和细胞转化中发挥重要作用[27]。MDV025编码的UL13主要与MDV的水平传播相关[28],磷酸化蛋白pp38则与MDV的溶细胞感染相关并调节双向启动子的转录[29]。meq是MDV编码的病毒原癌基因,是目前已知参与MD肿瘤形成最重要的病毒基因[30]。此外,MDV编码的RLORF6与病毒的毒力相关[31]。因此在本研究中,作者首先通过1日龄SPF来杭鸡人工攻毒试验,建立GX0101感染宿主的动物模型,然后用RT-qPCR分析上述10个MDV代表基因在病毒感染后不同时间点的相对转录水平,结合前期研究结果,探讨GX0101感染宿主后的各个病程阶段,为后续研究奠定重要的基础。
1.1毒株、鸡胚及动物
MDV超强毒株GX0101[13-14],由山东农业大学动物医学院崔治中教授馈赠。8~10日龄SPF鸡胚、1日龄SPF白来杭鸡,均购自山东济南斯帕法斯家禽有限公司。
1.2主要试剂
TRIzol Reagent,购自Invitrogen公司,PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)、RNA Loading Buffer(+EB),均购自TaKaRa公司;10 × MOPS RNA 电泳缓冲液,购自Solarbio公司。
1.3引物设计与合成
综上,通过科学校核各项检测设备、规范检测报告标准、健全工程质量检测管理体系等等,能够保证水利工程质量检测管理效果得到更好提升,降低水利工程质量检测设备出现运行故障的概率。对于工程质量检测管理人员而言,要大力学习国内外先进的水利工程质量检测管理知识,提高自身的管理能力,在保证水利工程质量检测管理工作顺利进行的基础之上,推动我国水利工程的稳定发展。
根据编码蛋白的功能,选取10个具有代表性的MDV基因(表1),参照GX0101全基因组序列(GenBank Acc.No.JX844666.1),利用Primer Premier 5.0软件设计相应基因的特异性引物对(表2)。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表110个代表性MDV蛋白编码基因的分类及功能
Table 1Classification and function of 10 representative viral protein-coding genes of MDV
分类Classification编号No.基因Gene座位(5'-3')*Position(5'-3')长度/ntLength(nt)功能Function结构蛋白MDV040gB59785-623822597与细胞吸附和病毒的进入相关MDV096gE162471-1639641493参与病毒在细胞之间的传播MDV018UL624043-262112168次要衣壳蛋白,参与DNA包装非结构蛋白MDV055UL4298158-992671109DNA聚合酶MDV066UL52113257-1164813224DNA解旋酶立早期基因MDV084ICP4142776-1497416965转录调控子,激活其他病毒基因的功能,及参与潜伏感染和转化蛋白激酶MDV025UL1335069-366101541水平传播磷酸化蛋白MDV073pp38125654-126526872与溶细胞感染相关,调节双向启动子的转录原癌蛋白MDV076meq133603-1346221019参与肿瘤的形成及免疫抑制毒力基因MDV077.5RLORF6134075-134692617与病毒毒力相关
*MDV参考毒株GX0101(GenBank Acc.No.JX844666.1)
*The reference MDV strain GX0101 (GenBank Acc.No.JX844666.1)
1.4动物试验
取8~10日龄SPF鸡胚制备原代CEF细胞,用于GX0101的增殖和病毒滴度定量。1日龄SPF来杭鸡160只,攻毒组和对照组各取80只,攻毒组每只腹腔接种0.2 mL GX0101病毒液(2 000 PFU·只-1)、对照组每只腹腔接种等量空白CEF活细胞作为阴性对照,分别饲养于带负压过滤空气的SPF隔离器中。分别于病毒接种后3、7、10、14、21、30、45和60 d各随机取鸡6只、称重后处死,分别采脾、胸腺和法氏囊组织样品,-80 ℃冻存备用。统计攻毒组和对照组试验鸡各不同时间点的体重、囊重比及胸腺指数,并进行差异显著性分析。
1.5RNA制备及cDNA合成
按照TRIzol RNA提取试剂盒说明书,分别提取各不同时间点采集的GX0101攻毒鸡脾总RNA,用Nanodrop-2000全波长紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度,然后用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量,-80 ℃保存备用。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒说明书,分别对提取的RNA样品进行逆转录合成cDNA,-20 ℃保存备用。
1.6qPCR
以鸡内源性基因GAPDH为内参基因,用SYBR GREEN Ⅱ qPCR法,分析MDV各代表基因(表1)在GX0101感染后不同时间点鸡脾中的相对转录水平。20 μL的qPCR反应体系包括:2 × SYBR®Premix ExTaqⅡ 10 μL;10 μmol·L-1的上、下游引物对(表2)各0.8 μL;50 × ROX Reference Dye Ⅱ。0.4 μL;cDNA模板2 μL;ddH2O 6 μL。反应条件:95 ℃2 min;95 ℃15 s;60 ℃40 s,共40个循环,熔解曲线程序为95 ℃15 s;60 ℃15 s,1.75 ℃·min-1升温至95 ℃,维持15 s,升温过程通过连续采集荧光信号生成熔解曲线。试验对每个时间点采集的脾样本均使用6个生物学重复,每份重复样品各设3个qPCR反应并取平均值。最后以3 d样本试验结果为对照,采用2-ΔΔCT法计算MDV目的基因在7~60 d各不同时间点的相对转录水平。
表2RT-qPCR分析MDV基因相对表达水平的引物对
Table 2Primers used for analyzing the relative expression levels of MDV genes by RT-qPCR
编号No.基因Gene引物Primer序列(5'-3')Sequence(5'-3')扩增长度/bpAmplicon/bp1gBgB-FgB-RTCTAGGGCATGGCACACGACGAATACGGAAACACAGAGCGG1252gEgE-FgE-RTACACCGAGACGTGGACATGGGACGATTTCATCCGCATACCTC1353UL6UL6-FUL6-RGAATTCGATGTCGGCAGTAAGCTACATTCCCCACGCTCACCAC1164UL42UL42-FUL42-RTTCGTCAGCCCTCATCGTGAAATGCGTTAGTATCTTCCAGTGC1155UL52UL52-FUL52-RAATGGGTTATCTCTGAAGGGTCGAGTCAGACCTCGTTTACCCCTTG1116ICP4ICP4-FICP4-RGCACTGCATTCCGAGAGTCATTTGGGAATTTGGAGGGCG1617UL13UL13-FUL13-RACCCTCGGTGACGTTAACAAAGTTCATGGATCTCGGCAAAGC1028pp38pp38-Fpp38-RCCGAAAGACAAAACCCAAATATGTAACCAGCATATAAGAACGC1299meqmeq-Fmeq-RCGCAGGAAGCAGACGGACTACCATAGGGCAAACTGGCTCAT15710RLORF6RLORF6-FRLORF6-RAATGCGGATCATCAGGGTCTCGAGAGGCTTTATGCTCGTCTTACC14011GAPDHGAPDH-FGAPDH-RAAGTCCCTGAAAATTGTCAGCAATATGGCATGGACAGTGGTCATAAG119
1日龄SPF来航鸡在GX0101感染后7 d内采食量及精神状态基本正常,此后部分感染鸡陆续出现精神萎顿、羽毛蓬松以及采食量下降等症状。14~21 d有少量鸡发病死亡,对病死鸡及采样处死鸡进行剖检,个别鸡脾在21 d左右可观察到小的肿瘤灶,至30 d病死鸡肿瘤明显,60 d时GX0101感染鸡的累计死亡达到48只,累计死亡率为60%,肿瘤发生率为23%。在整个动物试验周期内,CEF阴性对照组试验鸡生长正常,未发生病理性死亡。对不同时间点试验鸡的体重统计及差异显著性分析结果显示(表3),GX0101攻毒后3~10 d,感染组与CEF阴性对照组相比差异不显著,而攻毒后14~30 d感染鸡的体重显著低于CEF对照组(P<0.05),此后两组之间的差异分析不显著。与体重统计分析结果相似,两组试验鸡的囊重比和胸腺指数在3~10 d无显著差异,但在GX0101攻毒后14~21 d感染组的囊重比和胸腺指数均显著低于CEF对照组(P<0.01)(表4)。上述结果表明,GX0101在感染SPF鸡后2周左右,开始对宿主产生显著的免疫抑制。
2.2RNA提取鉴定
用TRIzol Reagent提取GX0101感染鸡脾总RNA,Nanodrop-1000测定总RNA OD260 nm/OD280 nm和OD260 nm/OD230 nm分别介于1.90~2.20和2.00~2.30,说明RNA的质量及纯度很好。经1%甲醛变性凝胶电泳,结果显示所提取的总RNA样品28S和18S 条带非常亮,且28S条带约为18S条带的2倍,5S条带相对较细(图1),说明所提取的总RNA质量及完整性较好,可用于后续试验分析。
图1 GX0101感染后3 d鸡脾总RNA样品电泳分析结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNAs from GX0101-infected chicken spleens collected at 3 dpi
2.3RT-qPCR条件优化结果
根据熔解曲线分析,MDV蛋白编码基因gB、gE、UL6、UL42、UL52、ICP4、UL13、pp38、meq、RLORF6和宿主内参基因GAPDHqPCR扩增产物的Tm值分别为82.1、81.5、78.8、81.3、78.4、86.0、79.3、80.1、84.7、82.9和84.8 ℃。在此条件下,各扩增产物均为单一峰、无非特异性产物及引物二聚体的存在(图2A);各个MDV基因的扩增曲线间距均一、平行性较好(图2B),说明目的基因与内参基因在扩增效率上能够保持一致。上述结果表明,各相关参数可直接进行下一步的qPCR分析。
2.4MDV基因相对转录水平分析结果
采用2-ΔΔCT法分析RT-qPCR数据,通过GraphPad Prism软件处理结果,分析10个MDV代表基因在GX0101感染鸡脾中不同时间点的相对转录水平。如图3所示,MDV结构蛋白基因gB、gE和UL6、非结构蛋白基因UL42和UL52、立早期基因ICP4、与病毒水平传播相关基因UL13以及磷酸化蛋白pp38具有相似的表达趋势,均在GX0101感染后7 d上升至第一个峰值,10 d降至低谷,14 d又逐渐升高并在21 d达到第二个峰值,此后逐渐下降至60 d并处于较低的转录水平(图3a~h)。与上述病毒基因不同,MDV编码的原癌蛋白基因meq和毒力相关基因RLORF6在GX0101感染7 d即持续升高,并在感染后14~60 d的试验周期内长时间处于较高转录水平(图3i~j)。
MD是家禽最重要的免疫抑制病与肿瘤病之一,近年来时有暴发,伴随着长期的疫苗免疫压力,MDV毒力也在不断增强[3],部分流行毒株已在一定程度上突破传统疫苗免疫保护[8-9]。此外,MDV与REV等反转录病毒亦发生基因重组并形成新的流行毒株,这也不断加大MD防控的压力[32]。因此,加强对MDV流行毒株致病机制的研究具有重要意义。MDV编码的蛋白质基因约有上百种,但目前功能较为清楚的基因仅有数十种,进一步深入研究未知基因功能、挖掘潜在致病因子的任务仍十分艰巨。GX0101是国内外首个从临床分离的整合REV-LTR的重组野毒株[13],该毒株是一个超强毒株[14],具有水平传播快[16]、毒力强等特征,可作为代表性毒株用于进一步研究MDV的转录组学、基因重组以及致病致瘤机制等。
图2 SYBR GreenⅡRT-qPCR扩增MDV及宿主基因的熔解曲线(A)和扩增曲线(B)Fig.2 Melting curves (A) and amplification plots (B) of SYBR Green Ⅱ RT-qPCR for MDV and host genes
此前研究表明,MDV感染宿主的“Cornell模型”一般包括4个阶段:早期增殖性—限制性感染(2~7 d)、潜伏感染(7~10 d)、第二次溶细胞性感染(18 d~)和淋巴瘤形成阶段(28 d~)[10-11]。但是,GX0101入侵宿主、感染及致病的过程目前尚不清楚。本文中,作者首先建立了GX0101感染SPF鸡的宿主动物模型,对感染鸡的体重及免疫器官指数(囊重比和胸腺指数)进行了统计分析,然后用RT-qPCR分析了10个具有代表性的MDV基因在感染鸡脾中的动态表达水平。作者研究发现,GX0101感染后1周左右对宿主的体重及免疫器官指数均无显著影响,但感染后14 d~21 d对宿主生长以及免疫器官产生显著影响,导致免疫器官的损伤,这与此前的相关研究结果基本一致[20-21]。而对GX0101编码的部分病毒基因表达的RT-qPCR分析结果发现,与MDV病毒复制、病毒粒子包装等相关基因(如gB、gE、UL6、UL42和UL52)以及与MDV感染及水平传播等相关基因(如ICP4、UL13和pp38)的表达水平均在GX0101感染后1~7 d持续上升,并在10 d降至低谷,14~21 d持续升高并在21 d达到峰值,30~60 d逐渐下降并处于较低的表达水平。但是,与MDV致病及致瘤相关的毒力基因(如meq和RLORF6)在GX0101感染后即持续升高,并在整个动物试验周期尤其是感染后期长时间处于较高表达水平。这表明MDV的复制相关基因与致病致瘤相关基因在感染宿主体内存在完全不同的表达模式,并与感染时间密切相关。
结合此前的相关研究[20,21]及本研究中GX0101对感染鸡的免疫器官指数的影响以及部分MDV病毒编码基因的动态表达谱,作者分析认为GX0101感染宿主的早期增殖性—限制性感染发生于1~7 d,潜伏感染约为10 d前后,晚期溶细胞性感染及免疫抑制发生于14~21 d,而T细胞转化及淋巴瘤形成可能在14 d前后就已经开始。与此前已报道的MDV感染 “Cornell模型”相比[10-11],GX0101感染宿主后的第二阶段的病毒复制与免疫抑制、以及诱导宿主肿瘤发生的时间明显提前,这很可能与GX0101较强的毒力及水平传播较快等生物学特征有关,其具体机制仍有待深入研究。
图3 MDV代表性基因在不同感染时间点的相对转录水平Fig.3 Relative transription levels of the MDV representative genes at different days post-infection (dpi)
建立了GX0101感染宿主的动物模型,并较为清晰地确立了其感染及致病的“Cornell模型”,包括:早期增殖性—限制性感染期1~7 d,潜伏感染期10 d前后,晚期溶细胞性感染及免疫抑制期14~21 d,T细胞转化及淋巴瘤形成期始于14 d前后,为今后应用GX0101研究MDV的转录组学、基因重组及致病致瘤机制等奠定了重要基础。
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(编辑白永平)
The Viral Gene Expression Profiles and Pathogenic Phases of the Disease Caused by Very Virulent MDV Strain GX0101
MA Sheng-ming1,2,TENG Man2,YU Zu-hua1,DANG Lu2,LI Hui-zhen3,DING Ke1,DENG Rui-guang2,LUO Jun1,2*
(1.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandPublicSafety,CollegeofAnimalScienceandTechnology,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471003,China;2.KeyLaboratoryofAnimalImmunologyoftheMinistryofAgriculture,HenanProvincialKeyLaboratoryofAnimalImmunology,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou450002,China;3.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China)
The present work was performed to study the infection phases of Marek’s disease (MD),namely ‘Cornell Model’,caused by the very virulent (vv) Marek’s disease virus (MDV) strain GX0101.For the first step,one-day-old specific pathogen free (SPF) chickens were challenged by GX0101 to establish the animal model of MD.Then,the kinetic transrption levels of 10 representative MDV protein-coding genes at different days post-infection (dpi) were determined by real-time quantitative PCR (RT-qPCR).The results showed that the onset of clinical symptoms and autopsy lesions of GX0101-infected birds was consistent with the typical MD cases.Some of the MDV protein-coding genes,including the structural protein-coding genes ofgB,gEandUL6,the nonstructural protein-coding genes ofUL42 andUL52,the immediate early infected cell protein 4 gene (ICP4),the horizontal transmission associated gene ofUL13 and the 38 kD phosphorylated protein gene (pp38),demonstrated a similar transcription pattern,which increased to a first peak at 7 dpi,fell to a bottom level at 10 dpi,increased again at 14 dpi and reached to a second peak at 21 dpi,and then gradually declined to low levels from 30 to 60 dpi.However,both of the unique MDV oncogenemeqand virulence related geneRLORF6 represented a persistent increasing transcription trend from 7 dpi,and then kept at a higher transcription level from 14 to 60 dpi.Our previous and present data indicates that the ‘Cornell Model’ of MD caused by GX0101 are as blow:the early cytolytic phase occurs at 1-7 dpi,the latent phase establishes at about 10 dpi and the late cytolytic and immunosuppressive phase appears at 14-21 dpi,while the T cell transformation and lymphomagenesis possibly starts at about 14 dpi.
Marek’s disease virus;vvMDV;GX0101;RT-qPCR;gene expression;pathogenic phase
10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.014
2016-03-21
国家自然科学基金(31372445);国家重点研发计划(2016YFD0500802)
马圣明(1991-),男,河南罗山人,硕士生,主要从事动物病毒分子致病机制研究,Tel:0371-65756056,E-mail:mashengming66@163.com
罗俊,E-mail:luojun593@aliyun.com
S852.659.1
A
0366-6964(2016)08-1635-10
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