种蛋孵化死胚及孵化厅环境样本中铜绿假单胞菌的分离鉴定及其耐药性分析

余 蕴，向 勇，李庆钵，刘 鹏，黎丽珍，廖 明，曹伟胜, 3, 4, 5, 6*

(1. 华南农业大学兽医学院，广州 510642；2. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广州 510642；3. 农业农村部人兽共患病重点实验室，广州 510642；4. 广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广州 510642；5. 人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室，广州 510642；6. 农业农村部兽用疫苗创制重点实验室，广州 510642)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一种分布广泛的人兽共患条件致病菌，可以在人、动物、环境中循环传播[1-2]，严重影响着人类健康和畜禽养殖生产。研究人员对PA耐药性的关注度从未降低，它是医院临床高度关注并愈发棘手的问题，作为对抗PA最后一道有效防线的亚胺培南和美罗培南等碳青霉烯类抗菌药也逐渐失去其作用[3-4]。近年来，有研究发现鸡及其养殖环境当中的PA中一些重要耐药基因的检出率逐渐升高，如金属β内酰胺酶(metallo-β-lactamases，MBLs)的相关耐药基因MBLVIM-2和MBLSPM-1等[5-6]。张艳等[7]对从医院分离到的100株PA进行耐药性分析，数据显示，亚胺培南耐药基因oprD2的检出率为93.0%，显著高于其他耐药基因的检出率，提示PA的耐药性日渐严重，极大的危害临床抗感染治疗，在全球范围内均构成极大的威胁[8-10]。但目前对种禽场孵化厅中PA的感染情况和耐药性的相关报道仍然较少。因此，本研究旨在对广东省种禽场孵化厅中PA的流行情况进行调查，为预防和控制该病原菌提供理论依据；其次，对分离到的PA进行抗菌药物敏感性分析及耐药基因的检测，为种禽场的合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

LB琼脂培养基、LB液体培养基、MH琼脂培养基、MH培养基、铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠杆菌ATCC25922均为广东环凯微生物科技有限公司产品。NAC琼脂培养基、NAC液体培养基、无菌均质袋等均为青岛海博生物技术有限公司产品。rTaqPCR Premix为上海翌圣生物科技有限公司产品；药敏纸片为OXOID公司产品。SQ Tissue组织DNA提取试剂盒为OMEGA公司产品。

1.2 样品采集

2018年3月—2019年1月，从广东省5个不同规模化种禽场收集孵化厅内21日龄仍未出壳且外壳完好的种蛋孵化死胚共655份，以及孵化机灰尘、污垢等环境样本共24份，总计样本679份。环境样本用灭菌棉拭子采集并放入装有适量的灭菌NAC液体培养基的15 mL离心管中，从样品采集到运送至实验室不超过8 h。

1.3 PA的分离与鉴定

用75%酒精将死胚外壳充分消毒3次，无菌操作取出胚体并剪碎，尤其使胸腔、腹腔和卵黄囊充分暴露，随后将整个胚体放入无菌均质袋。接着加入适量的无菌NAC液体培养基到装有样品的无菌均质袋中，37 ℃、120 r·min-1条件下选择性增菌8 h， 增菌后移取1 mL增菌液转种于10 mL新的无菌NAC液体培养基内，37 ℃、120 r·min-1进行二次选择增菌12～16 h。接着用接种环蘸取菌液划线接种于NAC琼脂培养基，37 ℃培养18～24 h，挑取疑似PA的绿色单菌落，参考文献[11-12]进行菌种16S rRNA基因和特异性基因oprI的PCR鉴定，并送至广州擎科生物有限公司测序，引物序列见表1。

表1 PA的16S rRNA和oprI基因的PCR引物序列及产物片段大小

1.4 药物敏感性试验

根据世界卫生组织 (World health organziatio, WHO)推荐的 K-B 纸片扩散法和美国临床实验室标准化委员会(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推荐的操作规程，以铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠杆菌ATCC25922为药敏试验质控菌株，严格参照CLSI2019标准对试验结果进行判定，测定所有PA分离株对22种抗菌药物的敏感性。抗菌药物：氨苄西林(ampicillin，AMP)、复方新诺明(complex sulfamethoxazole，SXT)、萘啶酸(naphthyridic acid，NA)、卡那霉素(kanamycin，K)、四环素(tetracycline，TE)、氯霉素(chloramphenicol，C)、哌拉西林(piperacillin，PRL)、头孢噻肟(cefotaxime，CTX)、头孢吡肟(cefepime，FEP)、头孢他啶(ceftazidime，CAZ)、头孢哌酮(cefoperazone，CFP)、亚胺培南(imipenem，IPM)美罗培南(meropenem，MEM)、氨曲南(aztreonam，ATM)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam，TZP)、头孢哌酮/舒巴坦(cefoperazone/sulbactam，SCF)、妥布霉素(tobramycin，TOB)、阿米卡星(amikacin，AK)、庆大霉素(gentamicin，CN)、环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、左氧氟沙星(levofloxacin，LEV)和多黏菌素B(polymyxin B，PB)。

1.5 耐药基因检测

参照SQ Tissue组织DNA提取试剂盒(OMEGA)说明书提取PA总DNA。参考文献[13-14]中的PCR引物及反应体系和条件对相应28个耐药基因(TEM、SHV、CTX、VEB、VIM、IMP、SPM、GIM、oprD2、NDM、DHA、OXA-10、OXA-23、qnrA、qnrD、qnrS、aac(3)-I、aac(3)-II、aac(6′)-Ib、aac(6′)-II、ant(3″)-I、tetA、tetB、catB、cmlA、qacE△1-sul1、mcr-1和NDM-1)进行PCR检测。PCR产物大于500 bp时反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min， 35个循环；72 ℃后延伸8 min。PCR产物小于500 bp时反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃后延伸8 min，退火温度可根据引物合成的Tm值作适当调整。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，通过凝胶成像分析系统观察并拍照保存。

2 结 果

2.1 PA的分离与鉴定

PA在NAC琼脂培养基及LB琼脂培养基上均呈现出圆形、光滑、湿润的绿色菌落，并带有特殊芳香气味，生化分析结果显示其均符合PA的生化特性(表2)。对分离到的疑似PA菌株的16S rRNA及oprI基因进行PCR扩增，结果显示其扩增出大小约为470和214 bp左右的片段(图1)，结合测序结果确认为PA。本研究分离鉴定出PA共77株(77/679，11.3%)，其中,2株来源于环境样本中的孵化机污垢(2/24，8.3%)，75株来源于死胚(75/655，11.5%)(表3)。

表2 PA分离株的生化鉴定

M. DNA相对分子质量标准；1. PA分离株；2. 阳性对照；3. 阴性对照M. DNA marker; 1. PA isolates; 2. Positive control; 3. Negative control图1 PA的16S rRNA和oprI基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product for 16S rRNA and oprI gene

2.2 抗菌药物敏感性

药物敏感性试验结果显示，除天然耐药的AMP、K和NA之外，PA对TE、SXT、C的耐药性较强，耐药率分别为100%、100%、75.4%，其次为CTX(11.7%)、CIP(9.1%)、LEV(9.1%)、CN(7.9%)、TOB(7.8%)；另外，PA对PRL、CFP和AK也表现出了较低的耐药率；未检测到对FEP、CAZ、IPM、MEM、ATM、TZP、SCF和PB耐药的PA菌株。除天然耐药外，耐3类或3类以上抗菌药的PA占比为74.1%(57/77)，表现出多重耐药性，其中，耐3类抗菌药的菌株数量最多，占62.3%(48/77)；耐4类抗菌药的菌株占比为3.9%(3/77)；耐6类抗菌药的菌株占比为7.8%(6//77)。耐药谱分析显示(表4)，所有分离菌株100%表现出耐4种及以上抗菌药，最广耐14种抗菌药，其中6耐菌株最多。

2.3 耐药基因检测

77株PA的28种耐药基因检测结果显示，18种耐药基因检测阳性(表5)，其中磺胺类的qacE△1-sul1检出率最高，对应的耐药表型是SXT；而碳青霉烯类耐药基因oprD2的检出率达到11.7%，对应的耐药表型主要是IPM；质粒介导诱导产生氟喹诺酮类耐药的qnr基因qnrA、qnrD和qnrS的检出率均为9.1%；氨基糖苷类的aac(3)-II和ant(3″)-I耐药基因检出率最高；氯霉素类耐药基因检出率最高为cmlA(2.6%)；四环素类耐药基因以tetA(3.9%)为主。磺胺类的耐药基因qacE△1-sul1阳性率为13.73%，而5种常见的MBLs耐药基因(VIM、IMP、SPM、GIM、NDM)及氨基糖苷类的aac(3)-I和mcr-1检测结果均为阴性。

表3 种鸡场中PA分离株的数量及分离率

表4 PA的耐药谱及相应数量

表5 PA耐药基因的检出率

3 讨 论

当前，PA是医院内重要的条件致病菌，常引起免疫力低下或有外伤伤口患者的严重感染，而且是导致重症病房患者死亡的罪魁祸首[15-16]。关于医院及其环境中PA的流行情况有太多的文献报道，相比之下，关于动物源PA的流行情况却较少报道，缺乏该方面的流行病学数据。本研究共分离到77株PA，总体分离率为11.3%，其中,2株来源于环境样本(2/24，8.3%)，75株来源于死胚(75/655，11.5%)；数据表明，不仅在死胚中发现有不同程度的PA感染，而且种禽场周围环境中也有一定比例的PA污染。有研究表明，种禽场环境当中的PA是污染种蛋的一个重要因素，尤其是孵化箱内环境[17-19]。而在G场的死胚和环境样本中均分离到了PA，因此作者推断环境中的PA可能是导致种蛋感染的重要原因，即胚胎可能被孵化箱内的PA污染，并侵入蛋壳，致其死亡；另一方面，即便是在死胚和环境样本中均分离到了PA，但也不能将鸡胚死亡或孵化率较低的结果全部归因于PA的感染，因为在个别养殖场的死胚中也分离到了沙门菌[20]；所以，孵化率受影响是多种因素共同作用的结果。但在F场中并未分离到PA，说明其饲养管理和生物安全措施实施得较好，推测这也是该场孵化率稍高于其他养殖场的原因。所以在家禽养殖过程中，不应该继续忽视PA的存在，应当重视起来，需要加强饲养管理及生物安全措施，防止PA污染种蛋，避免损失。

本研究选取了常用的22种抗菌药进行药物敏感性试验，其中,IPM、PRL、FEP、CAZ等都是医院临床治疗PA感染性疾病的一线药物[21-22]，但部分PA分离株也对其表现出了耐药现象，即便其耐药率较低，但也应当引起重视，特别是医院临床抗感染的一线药物亚胺培南。而在所调查的11个养殖场中，均未使用上述抗菌药，这也从侧面反映出PA在群体遗传进化过程中，其耐药性越来越强，推测与全球范围内医院中多重耐药PA菌株的暴发流行有关；反观AMP、K、NA这3种抗菌药，在养殖场中的使用率极高，但PA对其天然耐药，因此不具备预防治疗意义。而PA对SXT、TE、C三者的耐药率也很高，因此养殖场需要更换其他抗菌药使用。另外，耐药谱分析显示,最广耐14种抗菌药；其中多重耐药PA占比高达为62.3%，这些数据表明禽源PA的耐药情况同样不容乐观，且日渐严重。耐药基因oprD2对应的耐药表型是亚胺培南，且医院内的PA分离株对IPM表现出较强的耐药性[23-24]。而在本研究中，虽然未检测到对IPM耐药的菌株，但其oprD2基因的阳性率高达11.7%，推断可能是因为oprD2耐药基因没有表达或表达量不够，不足以引起对应的耐药表型，同时也提示种禽场PA分离株对IPM的耐药性转移风险水平较高。虽然本研究中分离到的PA并未被检测到MBLs耐药基因，但仍然不能掉以轻心，毕竟已表现出对碳青霉烯类耐药性转移的风险，并且有必要进行动物源PA耐药基因的监测。

PA目前的流行情况(尤其是医院内的流行情况)已经十分严峻，而医院中PA的流行在某种程度上对动物源PA的流行造成了一定的威胁，医院内的PA传播至ICU病人，病人将PA带入到家庭环境，最终导致其宠物感染PA并发病，这都是有依据可言的。另一方面，由于PA强大的耐药性和对环境的适应性，使其本身就具有较强的流行性。在面对动物源PA的逐渐流行时，应该趁早将其扼杀在摇篮里。

4 结 论

通过对5个不同种鸡场中的种蛋孵化死胚和环境样本进行铜绿假单胞菌的分离鉴定，发现其死胚中均存在不同程度的感染，且个别种鸡场的死胚和环境样本中均分离到了该菌。这些PA分离株具有多重耐药性，提示种鸡场一方面应做好生物安全措施，加强饲养管理，及时对种蛋、孵化机及其周边环境进行清洁和消毒；另一方面应定期进行药敏试验，根据结果合理选择并交替使用抗菌药，如阿米卡星、哌拉西林、头孢哌酮等可作为铜绿假单胞菌较好的预防或治疗药物。