牛Wif1基因印记及甲基化调控印记的分子机制研究

吴茜红，张明月，杨文志，吴国江，李世杰

（河北农业大学生命科学学院，保定071000）

基因组印记（Genomic imprinting）是一种非孟德尔遗传现象，是由于来自亲本双方的等位基因不对称表观遗传修饰而造成的，基因表达具有亲本特异性［1］。DNA甲基化是基因组印记的一种主要调控方式。基因组印记与生物进化、动物生长发育以及肿瘤发生都有密切关系。印记基因的研究主要集中在人类和鼠中，被鉴定的印记基因已经超过220个（http：／／igc.otago.ac.nz／home.html）；而在牛中，由于缺少序列及多态性信息，被鉴定的印记基因只有20个。

Wnt抑制因子1（Wnt inhibitory factor 1，Wif1）是无翼信号通路（Wingless－type，Wnt）的胞外抑制蛋白，可直接和 Wnt蛋白结合，从而抑制Wnt信号的传导。Wnt信号通路具有传递生长刺激信号的作用，该通路的异常激活可引起细胞异常增殖、分化而导致肿瘤的发生［2］。Wif1基因首先在人的视网膜组织中发现，在人的胚胎滋养层中表现为一个父源表达的印记基因［3－4］。定位于人12号染色体。而在牛中，其印记状态和调控的分子机理还没有被研究。本研究在分析Wif1基因在牛不同组织中印记状态的基础上，对Wif1基因启动子区等位基因特异的甲基化状态进行了分析，以期为丰富牛基因组印记及揭示Wif1基因印记的调控分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

32头成年的荷斯坦奶牛（Holstein）的组织样本，包括心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、皮下脂肪等组织采自当地屠宰场，装入编号的采样袋中，立即投入液氮，－70℃冰箱保存，以备后续试验用。

1.2 RNA的提取及反转录

利用TRIzol试剂盒提取3头牛的心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪组织的总RNA，用无RNA酶的DNase－Ⅰ去除可能的DNA污染，－70℃保存备用。利用TransGen反转录试剂盒（TransGen，China）进行cDNA的合成。20μL反应体系中含有大约4μg的RNA，反转录反应程序按厂家提供的产品说明书进行，体系加好后轻轻混匀，65℃ 变性10min，打开RNA的二级结构，然后在每个反应体系中加入1μL的 EasyScriptTM RT／RI Enzyme Mix，42℃孵育30min，70℃保温15min，终止反应，cDNA于－20℃保存待用。

1.3 Wif1基因在不同组织中的表达谱分析

RT－PCR用来检测Wif1基因在牛组织中的表达模式。依照Wif1基因序列（GenBank accession No.NM＿001075996.1），设计牛Wif1基因的特异性引 物 Wif－1F （5′－CCAACAAATGCCAGTG－3′）和 Wif－1R （5′－TCAAGCCAATGCCAAC－3′）用 于扩增812bp跨内含子的片段。利用GAPDH（GenBank accession No.BTU85042）跨内含子的引物 Gapdh－F（5′－GCACAGTCAAGGCAGAGAAC－3′）和 Gapdh－R（5′－GCGTGGACAGTGGTCATAAG－3′）扩增367bp大小的片段作为内参。反应体系为25μL：上下游引物（10μmol·L－1）各1μL，0.5μL cDNA 模板，10μL 双蒸水和12.5μL ES Tap MasterMix（CWBio，China）。扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，44℃退火30s，72℃延伸35s，35个循环；72℃总延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶回收后送华大基因公司测序。

1.4 杂合子个体筛选

利用苯仿抽提法提取32头荷斯坦奶牛肝组织的 DNA。 引 物 Wif－2F （5′－CCCACCTGAATCCAAT－3′）和 Wif－2R （5′－TCAAGCCAATGCCAAC－3′）扩增667bp DNA片段，通过PCR产物直接测序法寻找SNP，筛选杂合子。除0.5μL DNA作为模板外，其他PCR反应体系同1.3RT－PCR。扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，44℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃总延伸10min。PCR产物纯化后送华大基因公司测序。

1.5 Wif1基因的印记状态分析

被鉴定为杂合子的动物用于等位基因特异的表达状态分析。提取杂合子牛组织的RNA，反转录成cDNA、RNA提取和反转录程序同1.2，用得到的cDNA为模板，引物 Wif－1F和 Wif－1R扩增目的片段，将PCR产物胶回收后直接进行测序。

1.6 Wif1基因启动子区CpG岛预测及杂合子筛选

通过 MethPrimer 在 线 软 件 （http：／／www.urogene.org／methprimer），预测牛Wif1基因第一外显子及上游1kb序列上的CpG岛（Criteria used：Island size＞100，GC Percent＞50.0，Obs／Exp＞0.6）。为了寻找启动子区的杂合位点，设计引物 Wif1－3F（5′－AACCCTCTGACCGTTGTG－3′）和 Wif1－3R （5′－GGCATTTGGGAAGAAGTAG－3′）扩增32头牛DNA。PCR反应体系为25μL：0.5μL DNA模板，上下游引物（10μmol·L－1）各1 μL，10μL 双蒸水和12.5μL ES Tap MasterMix（CWBio，China）。扩增条件：94℃预变性5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸10min。胶回收PCR产物后直接进行测序。得到的杂合子用于等位基因特异的甲基化分析。

1.7 亚硫酸氢盐处理、引物设计及PCR扩增

按照DNA甲基化试剂盒（Zymo，USA）说明书，将1.6中筛选到的杂合子牛的约500ng肺和肝组织DNA进行亚硫酸氢盐处理。利用在线软件（http：／／www.urogene.org／methprimer），针 对Wif1基因亚硫酸氢盐转换后的DNA序列设计甲基 化 特 异 性 引 物 （BSP）Wif1－MF（5′－TTGGTTAGAGGTAGCGTAAGT－3′）和 Wif1－MR （5′－AACCTCTTAACTCTAATACGAAT－3′）扩增Wif1基因启动子区410bp片段。反应体系为25μL：1μL亚硫酸氢盐转换后的DNA模板，上下游引物（10 μmol·L－1）各1μL，9.5μL双蒸水和12.5μL ES Tap MasterMix（CWBio，China）。扩增条件：94℃预变性5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸10min。第一轮PCR产物稀释100倍后，取1μL作为第二轮模板。第二轮PCR的引物、体系和扩增条件与第一轮相同。将第二轮PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测。

1.8 克隆、DNA测序和数据分析

利用DNA 回收试剂盒（Cwbio，China）对1.7中第二轮扩增产物进行胶回收，纯化后的片段与pMD19－T载体连接，转化后涂板培养。每一个体各挑取18～22个单一的阳性克隆送华大科技公司测序。计算每一个体中mCpG占全部CpG的百分比。SPSS软件分析等位基因间甲基化水平的差异显著性。

2 结 果

2.1 Wif1基因在不同组织中的表达

RT－PCR用于分析Wif1基因在牛7个组织中的表达，包括心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪。引物Wif－1F和 Wif－1R扩增来自3头牛组织的RNA，GAPDH基因作为内参。结果在7个被检测的组织中，Wif1基因均扩增得到812bp大小的条带（图1），测序验证为目的产物，表明Wif1基因在被检测的组织中均表达。

图1 牛Wif1基因各个组织中的RT－PCR结果Fig.1 RT－PCR results of Wif1gene from different tissues of cattle

2.2 Wif1基因杂合子个体筛选

用位于Wif1基因外显子8上的引物 Wif－2F和Wif－2R扩增来自32头牛肝组织的DNA，得到667bp的DNA片段，PCR产物回收后直接测序（图2），发现一个A／C杂合位点，位于该基因的第1 759个核苷酸处（c.1759A＞C），鉴定的杂合子牛用于印记状态分析。

2.3 Wif1基因印记状态分析

图2 牛DNA测序法确定Wif1基因的杂合子个体Fig.2 Identification of an SNP （A／C）in the bovine Wif1gene by sequencing

通过比较杂合子动物中g.1759A＞C SNP位点在DNA PCR和RT－PCR产物直接测序的峰图来确定印记基因的表达状态。提取3头g.1 7 5 9A＞C SNP位点为杂合的动物的组织RNA，RT－PCR产物直接测序，SNP位点附近峰图见图3，发现Wif1基因只有在肺中为单等位基因表达（单峰），说明Wif1基因在肺中是印记的；而在心、肝、脾、肾、肌肉、脂肪中为双等位基因表达（双峰），说明Wif1基因在检测的6个组织中是非印迹的。

图3 测序法分析Wif1基因等位基因特异性的表达模式Fig.3 Allele－specific expression analysis of Wif1gene in cattle by sequencing directly

2.4 Wif1等位基因特异的甲基化状态分析

为了确定DNA甲基化在Wif1基因组织特异性印记中的可能作用，分析了Wif1基因启动子区在单等位基因表达的组织（肺）和双等位基因表达的组织（肝）中的等位基因特异的甲基化状态。用位于Wif1基因启动子区的引物 Wif－3F和 Wif－3R扩增来自32头牛肝组织的DNA，PCR产物回收后直接测序，发现一个A／G杂合位点，位于该基因的第115个核苷酸处（g.115A＞G），g.115A＞G SNP位点用于区分等位基因的两条链。用甲基化特异引物（Wif1－MF和 Wif1－MR）扩增包括g.115A＞G在内的Wif1基因启动子416bp的区域，包括了29个CpG位点，软件预测每个CpG位点上可能存在的转录因子结合的位点，发现其中14个CpG位点（第1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、15、18、24和25）上存在的7种转录因子结合的位点（图4），即ATF（TGACGT）、CREB（KWCGTCA）、GCF （SCGSSSC）、AP2（CCCMNSSS）、SP1 （GGCGGG）、HSV＿IE＿repeat（GCGGAA）、EIIaE－A（AAGGGCGC）。

分析3头杂合子牛（7号、25号和32号）肝和肺组织中等位基因特异的甲基化状态。根据在SNP位点的碱基命名来自亲本等位基因的两条链，分别为G－链和A－链（图5）。结果发现，在单等位基因表达的肺中，两条亲本链G－链和A－链的平均甲基化水平分别为38%和41%，差异不显著（P＞0.05）；在双等位基因表达的肝中，G－链（42%）和 A－链（38%）的平均甲基化水平也无显著差异（P＞0.05）。进一步对肺和肝中每个CpG位点两条亲本链G－链和A－链之间的平均甲基化率进行差异显著性分析 （图6），发现在肺中有10个CpG位点A链与G链甲基化率存在显著差异，其中第2、7、13、17个CpG位点差异极显著（P＜0.01），第1、6、9、19、23、29个CpG位点的差异显著（P＜0.05）；在双等位基因表达的肝中，有4个CpG位点A链与G链甲基化率存在显著差异，其中第7个CpG位点差异极显著（P＜0.01），第13、23、和29个CpG位点差异显著（P＜0.05）。与肝相比，肺中8个CpG位点（第1、2、6、9、17、19、23和29）两条亲本链甲基化率存在显著差异，其中3个CpG位点（第1、2和6）位于转录因子的结合位点上，由于单个CpG位点的甲基化变化会影响转录因子的结合，推测这3个CpG位点的甲基化可能参与调控Wif1基因的组织特异性印记。

3 讨 论

WIF1是近年来发现的肿瘤抑制因子，通过与Wnt蛋白直接结合抑制Wnt信号通路，从而抑制癌细胞的干性并且促使癌细胞老化。本研究分析了Wif1基因在牛7个组织中mRNA转录情况、印记状态以及启动子区DNA甲基化的状态。

Wif1基因的表达因物种、发育阶段而有差异。J.C.Hsieh等［3］在蟾蜍胚胎发育的神经胚期检测到了Wif1基因的mRNA，而在蟾蜍和斑马鱼的胚胎原肠胚期未能检测到Wif1基因的表达。Wif1基因在成年小鼠的心脏和肺脏中强表达，而在脑和眼中表达水平较低。D.D.Hunter等［5］发现在人的视网膜、软骨、肺和大脑内Wif1显著表达；Wif1分布在小鼠神经系统的很多不同区域，其中丘脑和嗅球内表达显著。C.Wissmann等［6］使用多克隆抗体的免疫组织化学分析显示，在前列腺、乳腺、肺和膀胱的正常上皮细胞核周细胞质Wif1高表达。本研究以RT－PCR方法分析了牛中Wif1基因在心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪组织中mRNA的转录情况，发现Wif1基因在7个被测组织中均表达。研究结果表明，Wif1基因在多个物种中广泛表达于多种组织中。

图4 甲基化分析的Wif1基因启动子区及预测的每个CpG位点上的转录因子Fig.4 The promoter region of Wif1gene analysed by bisulfite sequencing and the transcription factors predicted on each CpG sites

大部分印记基因在哺乳动物的胚胎和胎盘发育中起重要作用［7－10］。由于胎盘是最早印记的组织之一［11］。Wif1基因是在研究人胎盘肿瘤抑制基因时，被发现在人妊娠前3月胎盘滋养层细胞中表现为父源表达的印记基因［4］。关于Wif1基因在其他的物种和组织中的印记状态尚未报道。基于SNP位点的RT－PCR产物直接测序法是一种分析印记基因的有效方法，前期研究中应用此方法确定了Gtl2和Meg8在牛中的印记状态［12－13］。本研究发现Wif1基因在牛中的印记具有组织特异性，在被分析的7个组织中，Wif1基因只在牛的肺中是印记的，表现为单等位基因表达；而在心、肝、脾、肾、肌肉、脂肪中表现为双等位基因表达。表明Wif1基因的基因组印记具有物种特异性和组织特异性。

图5 3头杂合子牛（7、25和32号）肺和肝启动子区甲基化状态和甲基化水平Fig.5 Methylation level and status of promoter region in lung and liver tissues of 3heterozygous cattle（7，25，32）

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式，通过改变转录因子与DNA的结合，从而调控基因的组织特异表达、基因组印记和动物的正常发育［14－15］。Wif1基因启动子区域的甲基化调控Wif1基因的表达，大量的研究证明Wif1基因的启动子高甲基化与消化系统恶性肿瘤、鼻咽癌、膀胱癌、乳腺癌等恶性肿瘤有密切关系［16－22］。5－氮－2′－脱氧胞苷（5－aza－dC）是一种甲基化抑制剂，在 DNA 复制过程中，5－aza－dC与DNA甲基转移酶形成一种共价复合物，抑制甲基转移酶的甲基转移活性，从而实现去甲基化功能。在膀胱癌等细胞系中加入5－aza－dC，可使Wif1 基因的 表 达恢复正常［23－26］。本研究中，为了探究甲基化在Wif1基因的组织特异性印记中可能发挥的作用，分析了启动子区29个CpG位点的甲基化状态，发现肺中9个CpG位点的甲基化水平发生改变。对其转录因子结合位点的预测发现，该区域存在多种转录因子结合位点，这些转录因子调控着基因转录和转录表达水平的高低。如CREB是一种与细胞周期调控及记忆形成有关的核转录增强因子［27－28］。Sp1是广泛和系统的生长调控因子之一，它参与了细胞生长和分化，对肿瘤的促进作用与其参与众多癌基因、抑癌基因、细胞周期调控分子、生长相关信号转导通路分子的调节密切相关［29］。转录因子 AP－2家族是一类DNA 结合蛋白，以二聚体形式结合到DNA丰富GC的元件上，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育及肿瘤发生中起着极为重要的作用。由于单个CpG的甲基化可能会影响转录因子的结合，所以差异甲基化的CpG位点可能参与了Wif1基因的组织特异性印记。

图6 肺和肝中每个CpG位点的甲基化率Fig.6 Methylation rate of each CpG site in lung and liver tissues

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