版纳微型猪近交系DLDH基因编码区序列扩增及生物信息学分析

成文敏，潘伟荣，尹俊芳，黄 言，查星琴，肖 晶，曾养志＊

（1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明650201；2.昆明市官渡区人民医院，昆明650021；3.云南省版纳微型猪近交系重点实验室，昆明650201）

二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase，DLDH）是丙酮酸盐脱氢酶复合物PDHc、α戊二酸脱氢酶KGDC和支链α酮酸脱氢酶BCKDC的组成部分［1-2］，定位于线粒体，属氧化还原酶类，在真核生物中参与甘氨酸代谢［3］。DLDH具有4个特色功能域，在线粒体中形成同型二聚体，能够催化NADH氧化成NAD＋［4］，同时还原O2、不稳定的高价铁［5］、一氧化氮［6］和泛醌［7-8］等。除了具有脱氢酶和黄递酶的活性外，DLDH还具有蛋白酶活性［9］，是一种高度变化的在能量代谢和维持氧化还原态平衡方面起着多重关键作用的氧化还原酶。同时DLDH还可参与丙酮酸／乳酸代谢，使用DLDH特异性抑制剂抑制DLDH活性会发生乳酸累积，导致细胞内ROS、c AMP水平、p H和钙离子浓度降低［10］。

精子获能是哺乳动物受精过程中正常受精的必经阶段，涉及到生物物理学和生物化学的转换［11］，包括精子代谢、细胞内p H、c AMP、离子浓度、质膜通透性、膜重组及活性氧等［12-14］，其中精子代谢是近年研究的热点。PDHc和它的亚基DLDH可通过调控精子细胞内乳酸、p H和钙离子浓度影响精子的获能和顶体反应［10，15-16］。K.Mitra等报道，在精子获能过程中DLDH被酪氨酸磷酸化提示了一种新的代谢和信号传递方式［15］，当DLDH受抑制时，c AMP水平也会明显降低［17］，c AMP作为DLDH的下游信号分子，其水平对仓鼠［17］、大鼠［18］和牛［19］精子超活化和顶体反应有明显影响。目前，国内外对于DLDH基因与精子获能的相关研究已经取得了较大进展，但主要集中在大鼠［18］、仓鼠［10-11，15，17］、牛［19］等物种，DLDH基因在版纳微型猪近交系的研究仍未见报道，尤其是DLDH基因与版纳微型猪近交系繁殖力的相关研究仍未开展。

版纳微型猪近交系（Banna mini-pig inbred line，BMI）是采用全同胞或亲子交配的高度近交方式，并进行科学严格的选择，育成的世界上第一个大型哺乳动物近交系。BMI的培育成功，不仅为生物医学研究提供最佳的试验动物，还可为异种移植及基因改造提供最佳供体目标猪，为医学基础理论和临床研究带来深刻的影响乃至变革［20］。由于BMI在近交过程中，基因高度纯合，导致一些疾病的发生，使其繁殖能力降低。因此，本研究通过取自BMI睾丸组织，采用RT-PCR技术获得DLDH基因的编码区序列，并进行生物信息学分析，旨在揭示BMI DLDH基因的生物学特性，为后续研究精子发生和精子获能机制、提高BMI繁殖力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所使用的组织样本取自BMI 133家系睾丸组织，经液氮处理后置于-80℃冰箱保存。用于RNA提取及反转录等所涉及的试剂如Trizol裂解液、第一链合成试剂盒购自Invitrogen公司，2×PCR Premix Taq购自宝生物公司（TaKaRa）。RNA提取所用水为经DEPC处理的水。

1.2 RNA提取及反转录

依产品说明，将经过液氮处理置于-80℃冰箱保存的睾丸组织取出，解冻后将组织剪切成小块，在低温条件下用研钵研碎组织，用Invitrogen公司的Trizol提取睾丸组织总RNA，使用SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System进行cDNA链的合成，建立20μL的反应体系，用于逆转录1 pg～5μg总RNA。将1μL oligo（d T）20（50μmol·L-1）、1 pg～5μg总RNA、1μL 10 mmol·L-1d NTP混合物加DEPC处理的超纯水到10μL置于无核酸酶的微量离心管中，65℃孵育5 min后，迅速置于冰上冷却至少1 min。短暂离心后，加入以下组分：2μL 10×第一链合成缓冲液、2μL 0.1 mol·L-1DTT、4μL 25 mmol·L-1MgCl2、1μL RNase-OUTTM核酸酶抑制剂（40 U·μL-1）、1μL Super-ScriptⅢRT（200 U·μL-1），混合，并在50℃下孵育50 min，85℃孵育5 min以终止反应，迅速置于冰上冷却。加1μL RNase H到离心管中，37℃孵育20 min，获得的cDNA经琼脂糖凝胶电泳检测后置于-20℃冰箱保存备用。

1.3 引物

根据GenBank公布的猪NM＿214062.1序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6引物设计和分析软件设计1对特异引物，扩增1 724 bp长度的DLDH序列（包括编码区及部分侧翼序列，位于序列的16～1 739 bp位置）。引物序列：F：5′-GCTTAGCGGAGGTGAAGGAGTT-3′，R：5′-TTCCCTTCTGTCCAAACCTATT-3′。

1.4 PCR反应、产物回收及测序

50μL反应体系包括2×Gloden PCR Reaction Mix 25μL，10μmol·L-1的上下游引物各1μL，cDNA模板2μL，H2O 21μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min；95℃变性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环；最后72℃延伸1 min。PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统拍照，采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，将所得的PCR产物送交公司进行直接测序。

1.5 生物信息学分析

将测序所得的BMI DLDH基因编码区序列使用Lasergene软件初步编辑、比对，人工校对，获得开放阅读框，与GenBank中所公布的与其核苷酸编码区序列和相应氨基酸序列相似性大的猪、人、小鼠、牛、马、绵羊、山羊、鸡、野鸭、猫、狗、狒狒、猩猩等13个物种进行比对分析，通过Bioedit软件完全比对，获得物种DLDH基因以及编码蛋白之间的变异情况，经Edit Plus软件编辑输出结果，通过MEGA4.0软件采用邻接法（Neighbors-jointing，NJ）和最小进化法（Minimum-evolution，ME）重建系统进化树。系统树中节点的自举置信水平采用Bootstrap估计，NJ法和ME法都采用了1 000次循环。利用ExPasy（http：／／www.expasy.org／tools）中的Protparam推测序列的氨基酸组成、蛋白质分子质量、等电点、稳定性和总亲水性等；磷酸化位点采用NetPhos 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／）预测；Net OGlyc 3.1（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Net OGlyc／）预测糖基化位点；SignalP3.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）预测信号肽；跨膜结构预测利用TMHMM（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）；SOPMA（https：／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa＿automat.pl？page＝／NPSA／npsa＿sopma.html）参与二级结构预测；SWISS（http：／／swissmodel.expasy.org／interactive）参与蛋白三级结构预测。

2 结 果

2.1 PCR扩增结果

PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，DLDH基因扩增出1 724 bp大小的片段，与预期结果相符，扩增出的条带清晰、明亮。

2.2 BMI猪和其他12个物种DLDH基因编码区核苷酸序列和编码蛋白质氨基酸序列相似性

与GenBank上公布的猪的对应序列（NM＿ 214062.1）进行比对后确定BMI DLDH基因编码区序列长1 530 bp。猪（NM＿214062.1）、人（NM＿000108.4）、小鼠（U73445.1）、牛（NM＿001206170.1）、绵羊（XM＿004007853.1）、山羊（XM＿005679140.1）、马（NM＿001301150.1）、猫（XM＿003982645.2）、狗（NM＿001003294.1）、猩猩（XM＿002803427.1）、狒狒（XM＿009203661.1）等11个物种的DLDH编码区核苷酸序列长度均为1 530 bp；鸡（NM＿001030727.1）DLDH编码区核苷酸序列长度为1 527 bp，鸭（XM＿005010274.1）DLDH编码区核苷酸序列长度为1 545 bp。

图1 DLDH基因琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.1 PCR result of DLDH gene by 2%agarose gel electrophoresis

BMI DLDH基因编码509个氨基酸。与上述物种相对应的猪（NP＿999227.1）、人（NP＿000099.2）、小鼠（AAC53170.1）、牛（NP＿001193099.1）、绵羊（XP＿004007902.1）、山羊（XP＿005679197.1）、马（NP＿001288079.1）、猫（XP＿003982694.1）、狗（NP＿001003294.1）、猩猩（NP＿001126999.1）、狒狒（XP＿009201925.1）等11个物种的DLDH基因均编码509个氨基酸；鸡（NP＿001025898.1）DLDH基因编码508个氨基酸，鸭（XP＿005010331.1）DLDH基因编码514个氨基酸。物种间核苷酸序列与氨基酸序列相似性结果见表1。

将BMI与GenBank公布的猪核苷酸序列进行比对，BMI在第399位、405位、730位核苷酸处发生突变，结果见图2。

利用NJ法和ME法构建了系统进化树，结果见图3和图4。

2.3 BMI猪DLDH基因编码蛋白质的特性分析

表1 BMI与13个物种间DLDH基因编码区核苷酸序列和编码蛋白质的氨基酸序列相似性Table 1 Similarity rates of nucleotide sequences and amino-acid sequences of coding region of DLDH gene between BMI and 13 species %

图3 NJ法构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree by NJ

图4 ME法构建的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree by ME

2.3.1 DLDH蛋白分子质量及等电点预测 用 Ex PaSy ProtParam程序预测DLDH基因开放阅读框共编码509个氨基酸，由20种氨基酸组成，分子量为54.187 2 ku，理论等电点（pI）为7.67；其中甘氨酸占11.2%，丙氨酸占9.8%，缬氨酸占9.2%。DLDH蛋白不稳定系数为30.21，属于稳定蛋白；脂溶指数为93.30，总的亲水性平均系数（Grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.015，具有轻度疏水性。

2.3.2 DLDH蛋白磷酸化及糖基化修饰位点用Net OGly 4.0和Net NGly 1.0进行结果预测表明，DLDH蛋白中有两个O-糖基化位点，分别在第28和第128位氨基酸；有两个N-糖基化位点分别是：NETL位于第73～第76位氨基酸；NNSH位于第93～第96位氨基酸。Net Phos2.0预测表明，DLDH蛋白存在19个磷酸化位点，其中9个丝氨酸（Ser）磷酸化位点（A170、A203、A208、A285、A292、A297、A405、A446、A476）、9个苏氨酸（Thr）磷酸化位点（A188、A194、A199、A240、A282、A341、A345、A431、A489）、1个酪氨酸（Tyr）活性位点A97。采用SignalP 4.1对DLDH蛋白进行预测表明，DLDH不含有蛋白信号肽。TMHMM server预测未发现跨膜区。

2.3.3 DLDH蛋白结构预测 用SOPMA方法预测的DLDH蛋白的二级结构如图5所示，参与α-螺旋的氨基酸有157个，含量达到30.84%；有148个氨基酸参与延伸链，占29.08%；55个氨基酸可能参与β-转角，占10.81%；149个氨基酸可能参与无规则卷曲，占29.27%。将获得的BMI和GenBank公布的猪DLDH氨基酸序列提交至SWISS-MODEL程序，自动搜索同源蛋白作模板，得到DLDH单亚基三级结构模型，结果见图6、图7所示。

3 讨 论

3.1 猪DLDH基因的保守性

图5 DLDH二级结构Fig.5 Secondary structure of DLDH

图6 BMI DLDH三级结构Fig.6 Tertiary structure of DLDH in BMI

图7 猪DLDH三级结构Fig.7 Tertiary structure of DLDH in pig

本研究检测了BMI JS133家系睾丸组织DLDH基因的编码区序列，结果表明，所扩增的DLDH基因序列中包含由1530 bp碱基组成的完整ORF，编码509个氨基酸，ATG和TAA碱基分别为ORF的起始和终止密码子，表明在目的基因扩增和测序过程中碱基装配没有产生无义突变致使氨基酸序列编码中断。对不同物种核苷酸和氨基酸序列进行比对，结果表明，DLDH基因序列在物种间具有高度相似性，并且所有重要功能性氨基酸都是保守的。

前人的研究结果表明，DLDH可通过参与丙酮酸／乳酸代谢，从而影响精子获能和顶体反应［10］，同时还可通过影响c AMP水平，参与睾酮的合成通路［17］。说明DLDH基因在提高雄性动物精子发生顶体反应方面发挥重要的作用，但目前尚无DLDH基因与猪精子发生过程相关性的研究报道。本试验扩增了BMI DLDH基因编码区序列并进行了比对，结果表明，BMI 133家系在第399位T→C和405位A→G为同义突变。730位C→T核苷酸发生错义突变，氨基酸由苯丙氨酸突变为亮氨酸，这些多态性可作为BMI的分子标记。

3.2 猪DLDH基因的分类学地位

从BMI与GenBank中获得的其他11个物种的DLDH基因编码的氨基酸序列构建的分子系统进化树看，BMI猪与普通家猪聚为一类，为偶蹄目猪科动物；牛、绵羊、山羊聚为一类，牛、羊均为偶蹄目牛科动物；猫为猫科，狗为犬科，均为食肉目动物，聚为一类，马为奇蹄目马科动物，单独一类；猩猩为猩猩科，狒狒为猴科，人为人科，均属灵长目，聚为一类；小鼠为啮齿目鼠科，单独聚为一类，以上所有物种均为哺乳纲。鸡为鸡行目雉科，野鸭为雁形目鸭科，均为鸟纲，聚为一类。

3.3 猪DLDH蛋白结构预测

随着生物信息学的发展，利用软件进行蛋白质结构预测已成为发展趋势。本试验中通过对DLDH基因编码的蛋白质进行结构预测，结果表明，DLDH蛋白中存在着丰富的磷酸化位点，说明磷酸化位点修饰对DLDH的蛋白活化起着重要作用。通过蛋白二级结构预测显示，α-螺旋与无规则卷曲可能是DLDH蛋白的主要结构，形成的DLDH单亚基三级结构中包含α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲，最终形成的DLDH蛋白为单亚基组成的同二聚体，其中每个亚基都与一分子的FAD以共价键的形式相连。BMI与猪蛋白质结构预测显示，由于BMI中399、405位点处发生同义突变，730位点发生错义突变，由苯丙氨酸突变为亮氨酸，导致DLDH三级结构发生改变，其功能是否发生变化仍需要进一步研究。

4 结 论

采用RT-PCR技术获得BMI DLDH基因完整的编码区序列，其序列全长1 530 bp，编码509个氨基酸，且与其他物种存在较高的相似性。与Gen-Bank公布的猪DLDH序列比对结果显示，BMI 133家系在第399位、405位、730位核苷酸发生突变，是否导致DLDH蛋白功能发生改变仍需进一步深入研究。BMI DLDH蛋白中有丰富的磷酸化位点，可通过磷酸化修饰提高DLDH蛋白的活性。本次试验扩增的DLDH基因可为进一步研究BMI DLDH基因的表达信号通路、与精子获能和顶体反应发生相关基因的表达调控提供必要的基础。

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