转录因子USF1调控鸡小肠上皮细胞中糖类转运蛋白表达

张利环，李玲香，张 瑜，原一桐，王文魁，朱芷葳，王钦德，李慧锋＊

（1.山西农业大学生命科学学院，太谷030801；2.山西农业大学动物科技学院，太谷030801）

糖类是动物体内不可或缺的营养物质，具有提供能量、构成细胞骨架、物质代谢的碳骨架等生物学功能，只有在体内转化为葡萄糖、果糖、半乳糖等基本的单糖后才可以被肠道上皮细胞所吸收利用。在细胞膜内外，单糖跨膜转运的实现主要由糖类营养转运蛋白来完成［1-2］。其中，葡萄糖转运体（Glucose transporter，GLUT）是一类调控细胞外葡萄糖进入细胞内的跨膜蛋白家族，参与糖代谢、炎性反应和免疫应答等过程［3］。钠-葡萄糖协同转运蛋白（Sodiumdependent glucose transporter，SGLTs）是一类位于小肠黏膜和肾近曲小管细胞中的葡萄糖转运蛋白家族，其中钠离子依赖性葡萄糖转运蛋白SGLT1在小肠葡萄糖的吸收中发挥重要作用［4-5］。糖类营养转运蛋白基因何时表达、肠道不同部位的表达特点以及表达量等都要受到多种转录调控因子的调控［6］。

上游刺激因子（Upstream stimulatory factor，USF）属于进化高度保守性碱性-螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（Basic helix-loop-helix，b HLH）蛋白家族成员，主要包括USF1和USF2两种，能结合靶基因DNA上的E-box位点而发挥转录调节作用。其中，USF1可作用于多种靶基因，在糖脂代谢、细胞增殖、刺激前列腺素合成和黑素沉积等过程中发挥重要作用［7-9］。有研究表明，在肝中单糖转运蛋白基因和肝丙酮酸激酶（L-PK）mRNA表达量随葡萄糖浓度升高而增高，这些基因的5′调控区都存在着葡萄糖应答元件（Glucose response element，GLRE），USF蛋白形成复合体结合到葡萄糖应答元件上，增强L-PK基因的表达［10］。GLUT 2基因同样受到葡萄糖浓度的影响，其表达量变化与L-PK 基因相似［11］，但其受USF1调控的机制却没有L-PK基因研究的详细。

本研究通过构建USF 1真核表达载体，在鸡小肠上皮细胞中过表达USF 1，利用实时荧光定量PCR检测糖转运蛋白GLUT2、GLUT5和SGLT1的表达变化，分析转录因子USF1在小肠上皮细胞中对单糖转运蛋白基因的表达影响。研究结果不仅对研究鸡肠道营养吸收的分子调控机理有重要的理论意义，而且可以为以提高饲料转化率为目的的选育实践提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本研究以山西康牧禽业提供的海兰褐蛋鸡15日龄鸡胚若干作为肠道上皮细胞原代培养的细胞来源。

1.2 主要试剂药品

Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko购自日本Sigma公司；Recombinant Mouse EGF购自美国加州Bio Legend公司；Mouse Anti-Cytokeratin 18 Monoclonal Antibody购自美国Millipore公司；浓缩型DAB试剂盒、免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司；Lipofectamine 2000 Reagent、Trizol Reagent购自美国Invitrogen生物技术公司；SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）、第一条链合成试剂盒、T载体、pcDNA3.1载体、rTaq酶、限制性内切酶Eco R I、Xho I、T4连接酶、DL2000 Marker等购自大连TaKaRa公司；其他常规生化试剂均为试验级分析纯。

1.3 洗液的配制

1号洗液：38.0 m L PBS中加入青链霉素混合液2.0 m L，使双抗最终含量为5%；2号洗液：38.8 m L PBS中加入青链霉素混合液1.2 m L，使双抗最终含量为3%；3号洗液：39.6 m L PBS中加入青链霉素混合液0.4 m L，使双抗最终含量为1%。

1.4 引物设计

根据GenBank中鸡及相关禽类USF 1、SGLT 1、GLUT 2和GLUT 5（GenBank登录号分别为NM＿001007485.1、XM＿415247、NM＿207178和XM＿004947448）的基因信息，进行同源性比对，利用Primer5.0软件设计引物。引物信息见表1，在USF 1基因编码区的克隆引物中添加Eco R I与Xho I限制性内切酶位点。

1.5 真核表达载体的构建

以鸡小肠cDNA为模板，扩增USF 1基因的CDS区，扩增片段经纯化后，采用Eco R I与Xho I双酶切，与pcDNA3.1载体进行连接，用酶切法和测序法对重组质粒进行鉴定。

1.6 鸡IEC体外分离培养及鉴定

1.6.1 鸡IEC体外分离培养 取15日龄鸡胚，分离小肠，去除肠系膜，于超净台清洗多次，剪成1 mm3的组织块，放入盛有2倍体积50μg·m L-1嗜热菌蛋白酶HEPES消化液，37℃80 r·min-1振荡消化120 min。用PBS稀释酶消化液，反复多次稀释吹打至悬浮液清亮，1 000 r·min-1离心5 min，弃上清。采用相差贴壁法接种，细胞密度约为6.5×105个·m L-1，于40℃7%CO2培养箱进行培养，按时观察细胞贴壁生长状态。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.6.2 鸡小肠上皮细胞鉴定 通过形态学观察、细胞生长计数等方法初步鉴定原代IEC细胞。细胞角蛋白18（Cytokeratin 18，CK18）是上皮组织特异性的抗原成分，采用免疫组化法检测CK18在细胞中的表达。

1.7 转染鸡小肠上皮细胞

体外分离培养的IEC培养至第6天时，从中挑选生长状态良好、长势大致相同的9孔细胞换完全培养液，培养12 h后用Lipofectamine 2000转染重组质粒pcDNA3.1-USF1，设置空载体组和不转染组作为对照，在每组中设立6个重复，于40℃7% CO2培养箱内培养，48 h后，观察细胞形态学变化，收集细胞及上清。

收集细胞于1.5 m L RNaseFree的离心管中，采用Trizol裂解法提取总RNA，紫外分光光度法测量浓度及纯度，用1%甲醛变性凝胶电泳检测。按照Ta KaRa反转录说明书合成cDNA第一条链，-20℃保存。

1.8 检测USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因的表达量

依据Ta KaRa公司2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ定量试剂盒，筛选各引物的最佳体系和反应条件，建立了USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因的标准曲线，检测USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT 5基因的表达量，获得各样本c DNA相应基因的表达拷贝数。

1.9 统计分析

应用SAS 8.1统计软件进行方差分析，采用Duncans法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 USF 1基因CDS区片段的扩增

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳30 min后，结果显示，PCR扩增产物条带清晰，前后无非特异性条带出现，约952 bp，与预计相符（图1）。

图1 USF 1基因PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of USF 1 gene

2.2 pcDNA3.1-USF1重组质粒鉴定结果

重组载体pcDNA3.1-USF1经过限制性内切酶Eco R I和Xho I进行双酶切，1%的琼脂糖凝胶电泳后，可清晰看到酶切出的两个条带，与预期的条带相符。这表明已成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-USF1，其全长6 368 bp，USF 1插入位点为958～1 898 bp，如图2。构建的真核表达载体经过测序分析，结果显示所测序列与对应已知序列相符。

图2 pcDNA3.1-USF1酶切产物电泳图Fig.2 Electrophoretogram of plasmid pcDNA3.1-USF1 endonuclease digestion

2.3 鸡IEC形态学鉴定

纯化获得的IEC在40℃7%CO2培养箱内培养1 d后贴壁生长，并呈岛屿状分布，之后IEC逐渐向四周漂移蔓延，在7、8 d时进入对数生长期，IEC汇合成片呈“铺路石状”分布，多为多角形、卵圆形和圆形（图3），生长时IEC呈膜状移动，成片生长，很少单个细胞单独贴壁生长。

2.4 细胞生长曲线

通过计数法测定细胞生长曲线，细胞生长曲线呈“S”型（图4），有一段约48 h的潜伏期或缓慢生长期，此后，细胞进入指数生长期或对数生长期，在指数生长期，细胞的倍增时间为60～96 h，培养后期细胞生长率下降，由于产生接触抑制和密度抑制，细胞生长缓慢或停止生长，有些细胞甚至死亡。

图3 IEC形态学鉴定图Fig.3 The morphological identification of IEC

图4 鸡小肠上皮细胞原代培养生长曲线Fig.4 Growth curve of chicken intestinal epithelial cells

2.5 鸡IEC免疫组化鉴定

CK18是上皮组织中特异性的抗原蛋白，对鸡IEC进行免疫组化鉴定时，在试验组中滴加鼠抗鸡CK18单克隆抗体，在对照组中选用PBS代替一抗。光学倒置显微镜下观察发现（图5），试验组细胞浆呈棕黄色为阳性，而对照组细胞浆未着色。

2.6 鸡IEC转染后形态学观察

细胞经转染48 h后在倒置显微镜下观察质粒转染组、阴性对照组和空白对照组细胞生长状态，如图6。空白对照组中，细胞之间紧密相连呈“铺路石状”分布，多为多角形、卵圆形和圆形，细胞明亮且边界清晰；而经添加Lipofectamine 2000的转染组和阴性对照组，IEC形态发生明显的变化，IEC变暗形态不规则、边界不明显且细胞之间间隙加大失去原有的IEC形态特点。

2.7 各基因定量PCR标准曲线及熔解曲线

本研究中4条基因检测的标准曲线，各R2均大于0.98，扩增效率在92%～100%，标准曲线均符合条件（图7）。

USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因的熔解曲线如图8所示，可以观察到每条熔解曲线只有单一峰，说明PCR扩增产物的特异性很好。

图8 鸡小肠基因USF 1、GLUT2、GLUT5和SGLT1熔解曲线Fig.8 The melting curves of USF 1，GLUT2，GLUT5 and SGLT1 in chicken small intestine

2.8 USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因表达量的测定

表2为基因表达分析结果，质粒转染组USF 1 mRNA表达量较空白对照组、阴性对照组极显著增高（P＜0.01）。其中，质粒转染组USF 1 mRNA表达量分别是空白对照组和阴性对照组的2.83和2.35倍。

表2 不同转染组内各基因绝对表达量Table 2 Absolute expression of genes in different transfection groups

重组质粒pcDNA3.1-USF1成功转染IEC后，质粒转染组GLUT 2 m RNA表达量较空白对照组和阴性对照组极显著增高（P＜0.01）。其中，质粒转染组GLUT 2 mRNA表达量分别是空白对照组和阴性对照组的1.92和1.58倍；质粒转染组GLUT 5 mRNA表达量与空白对照组、阴性对照组间差异不显著（P＞0.05）；质粒转染组SGLT1 mRNA表达量较空白对照组和阴性对照组极显著增高（P＜0.01）。其中，质粒转染组SGLT1 mRNA表达量分别是空白对照组和阴性对照组的1.54和1.30倍。

3 讨 论

3.1 影响细胞转染效率因素的探讨

阳离子脂质体介导的细胞转染方法具有转染效率高，可重复性强等特点，因而被广泛应用。转染效率的高低主要与细胞接种密度、细胞的传代次数、脂质体与质粒DNA的比例、血清的含量等因素有关。本试验所使用的转染试剂是脂质体Lipofectamine2000。为了避免出现脂质体转染时对细胞毒性大，引起部分细胞死亡的情况，进行试验时适当减少了重组质粒DNA的用量，在鸡IEC细胞的汇合度达到80%～90%时进行试验，并设计脂质体用量，筛选出最佳比例。最终确定质粒DNA与脂质体的比例为1∶2时转染效果最好。

3.2 鸡IEC体外分离培养

近年来，体外分离培养IEC被作为研究探讨肠道的生物学功能、营养物质在肠道中吸收及调控机制的主要手段。鸡ICE体外分离培养不仅对研究鸡肠上皮细胞增殖、分化以及凋亡规律提供了理论依据，而且为研究营养素与外界因素对肠上皮的作用机制提供了理想的体外模型［12-13］。

获得高纯度的上皮细胞是本研究的关键环节之一。贾国东等在试验中选用20日龄的鸡胚，对肠组织分离后，采用刮取法得到肠绒毛及隐窝单位，然后在体外与成纤维细胞共同培养获得了活性较高的肠上皮细胞［14］。古少鹏等将消化后的鸡盲肠上皮细胞种植到含10%血清的细胞培养液中，1.5 h后把培养液连同未贴壁的细胞转移到离心管中离心5 min，细胞沉淀重新加入含2.5%胎牛血清的细胞培养液悬浮，后接种于培养板中可以获得较高纯度盲肠上皮细胞［15］。本试验在前人研究基础上，将消化分离得到的IEC接种到含10%鸡血清的细胞培养液中培养70 min后，收集未贴壁的细胞于含2.5%鸡血清的细胞培养液中培养可以获得较高纯度的鸡小肠上皮细胞。

3.3 USF 1基因过表达对SGLT1、GLUT2基因表达量的影响

转录因子USF最初是作为腺病毒晚期启动子的反式激活因子而被发现的［16］，USF1与糖脂吸收机制密切相关［17-18］。S.Wu等人在小鼠体内过表达人类转录因子USF1后，发现小鼠体内的新陈代谢特征包括肥胖、胆固醇水平、胆固醇LDL／VLDL比值和葡萄糖／胰岛素比值等均有显著变化［19］。C.Weigert等研究发现，转录生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）启动子的-1 013～-1 002区域与葡萄糖响应元件有高度的同源性，转录因子USF在高糖状态下正调控基因TGF-β1启动子活性［20］。目前，转录因子USF影响糖转运蛋白表达的相关研究报道非常少。C.P.Corpe等人研究发现，GLUT5在组织分布、对小肠中果糖含量的敏感度等方面存在差异性表达，并推测可能与GLUT5基因5′区域存在尾侧型同源基因（Caudal homeobox gene，Cdx A）、USF和Y染色体性别决定区（Sex-determining region of Y，SRY）结合位点有关［21］。J.Barrenetxe等人研究发现，人上皮细胞系Caco-2细胞质膜中GLUT 5和SGLT1基因的表达受TNFα调控，并进而导致糖转运的改变［22］。在肝细胞中，转录因子USF形成的复合体可以结合在L-PK基因5′调控序列的葡萄糖应答元件上，对L-PK基因的表达产生影响［23］。作为葡萄糖诱导表达的同类基因［24-25］，GLUT2在肝细胞中的表达方式与L-PK基因类似。本研究中，重组质粒pc DNA3.1-USF1成功转染IEC后，质粒转染组GLUT2和SGLT 1 m RNA表达量均极显著高于空白对照组和阴性对照组，表明转录因子USF1过表达对糖转运蛋白基因GLUT 2和SGLT 1起正调控作用。分析其作用机制可能是USF1蛋白与这两个基因的上游5′调控区的葡萄糖应答元件形成复合体，进而促进它们的表达。

4 结 论

本研究将USF 1基因真核表达载体转染到小肠上皮细胞，使其过量表达，并测定了相关糖类转运蛋白基因的表达量。证明在原代培养的鸡小肠上皮细胞中，USF 1基因的过表达在m RNA水平上调了GLUT2和SGLT1基因的表达。

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