不同尾型绵羊全基因组选择信号检测

刘 真，王慧华，刘瑞凿，吴明明，2，张淑珍，张 莉，赵福平，杜立新，魏彩虹＊

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；2.中国农业大学动物科技学院，北京100193）

绵羊是最早被驯化的草食家畜［1］，可上溯至11 000年前的中石器时代末期［2］。在漫长的驯化过程中，动物的行为习惯、体型外貌及重要性状因受到人工选择而发生巨大变化［3］。不同品种在受到人工选择的过程中，表型改变是对目标基因强烈定向选择的结果，而与选择相对应的基因组信息，即所谓的“选择信号”（Selection signature），是选择在基因组上留下的印迹，通常表现为某些位点或DNA片段多态的降低或者基因的纯合［4］。

检验正向选择的检测方法有很多，包括HKA检验、Tajima’s D检验、Fu ＆Li’s D检验、H检验、Ka／Ks检验、M.K检验、LRH检测和FST检验等。目前对多个群体进行选择信号检测最常用的方法是群体分化指数（FST）法。群体遗传分化是指物种群体间存在明显的等位基因频率差异，通常遗传漂变和选择过程均可造成群体间的遗传分化。基于FST法对全基因组范围内的单个位点估算FST值，就能分析其分化程度，最终实现选择信号检测［5］。FST检验已经被证实是最简单且有效的群体遗传指标之一［6］，用FST检验进行群体间选择信号的检测最初运用于人类进化遗传学研究［7］，现已在各种畜禽中得到了广泛应用［8-13］。

研究表明，野生绵羊最早是瘦尾羊，由于自然选择和人类驯化，瘦尾羊部分进化为脂尾型绵羊［14］。绵羊脂尾（臀）性状是在恶劣自然环境中生存的必需性状，在天寒地冻、营养匮乏等恶劣生态环境下，脂尾型绵羊能够消耗脂肪提供能量来维持自身的新陈代谢，起到“保命”作用。但是近些年，随着人们生活水平的不断提高以及对危害人类健康的心血管疾病等的高度关注，高脂肉类逐渐受到冷落，脂尾（臀）型绵羊品种也越来越不受消费者欢迎。此外牧民定居点不断扩建、牧草种植等配套设施不断完善，尾（臀）脂的“保命”作用也已不值一提。而且从饲养成本考虑，生产1 kg脂肪消耗的饲草可产生2 kg瘦肉，显然过多的尾脂沉积也会加大饲养成本［15］。因此，低脂型肉羊品种将成为今后的培育方向，研究绵羊尾部脂肪的沉积规律及分子调控机制，以减少尾部不必要的脂肪沉积，对低脂肉用绵羊的培育具有重要的理论价值与实际意义。

本研究利用蒙古羊和藏羊的全基因组SNP芯片数据，基于FST法检测2个品种间的遗传分化程度，检测其基因组上的选择信号，运用GO功能富集分析筛选受到选择的且与绵羊重要性状相关的候选基因，并采集呼伦贝尔羊（大尾和小尾品系）和藏羊尾脂组织，对其中与脂肪合成代谢相关的重要候选基因进行mRNA表达量研究，以期获得与脂肪沉积相关的候选基因，为绵羊尾型选育及品种改良提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分别选取60只蒙古羊和60只藏羊为试验材料，采用颈静脉采血，EDTA抗凝，-20℃保存，用于基因组DNA提取。提取的DNA用于SNP 50K芯片基因型检测。采集呼伦贝尔羊大、小尾品系（呼伦贝尔鄂温克旗畜牧站羊场）和藏羊（青海祁连藏羊保种场）尾脂组织各10只，浸泡于RNA later（QIAGEN），-70℃保存，提取m RNA后用于候选基因相对表达量分析。

1.2 试验方法

1.2.1 基因型检测 利用血液基因组提取试剂盒（天根）提取血液样品中基因组DNA，使用Illumina Ovine SNP50K芯片进行分析获得SNP分型数据，采用GenomeStudio软件进行数据筛选和SNP等位基因频率的分析，剔除未定位的SNPs位点，用PLINK软件进行质量控制。质量控制的标准是：平均检出率大于0.9，平均最小等位基因频率大于0.01。为了能更好地对现有绵羊基因组（Ovis aries 3.1）注释，SNP位置又重新按照Ovis aries 3.1的位置进行调整，最终共计46 355个SNPs用于后续的分析。

1.2.2 选择信号检测 群体分化指数FST是用来度量群体的分化程度，用亚群体和整个群体的两个等位基因相关来表示。通过估计群体间杂合性大小与整个群体杂合性大小的差异，来检测不同群体的分离程度，反应不同群体经历不同的育种目标和进化历史。

本研究按照B.S.Weir等［16］描述的无偏估计FST方法对筛选留下的SNP位点进行计算，得到两个群体的每一个SNP位点的群体分化指数FST值。其计算公式：

其中MSG为检测的群体内部位点的误差均方，其计算公式：

MSP是检测的群体之间位点的均方差，其计算公式：

nc指校正后的群体间平均样本大小，其计算公式：

上述各式中，i是总亚群数S的一个群体，i＝1，2，…S；PAi是第i个亚群中SNP等位基因A的频率；ni是亚群体i的平均样本大小；是各群体中PA的加权平均值，即

本研究的FST数据计算基于R语言（http：／／www.r-project.org／）pegas软件包完成，画图基于R语言ggplot软件包完成。

1.2.3 候选基因检测和注释 对计算出的FST值进行统计分析，绘制曼哈顿分布图。将筛选出的前1%SNPs作为受选择位点。参照NCBI数据库（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／genome？term＝ovis%20aries）和CSIRO数据库（http：／／www.1ivestockgenomics.csiro.au／sheep／oar3.1.php）的Ovis aries 3.1基因组数据库，对筛选出来的受选择位点进行基因注释。以选择信号发生区域核心SNP为中心，上下游各扩展50 kb为选择区段。将落在这个选择区段内的基因定义为选择信号的“候选基因”。

1.2.4 候选基因富集分析 利用DAVID v6.7（http：／／david.abcc.ncifcrf.gov／summary.jsp）数据库对候选基因进行GO（Gene Ontology）分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析。GO功能富集分析主要包括生物学过程（Biological process）、细胞组分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）分析。

1.2.5 引物设计与合成 根据绵羊PPARG基因mRNA序列（GenBank登录号：NM＿001100921.1）和PDGFD基因mRNA序列（GenBank登录号：XM＿004015965.1）设计引物，选用18S r RNA基因作为内参基因。采用Primer3 plus（http：／／www.bioinformatics.nl／cgi-bin／primer3plus／primer3plus.cgi）在线软件设计引物，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。引物序列、退火温度及PCR产物长度见表1。

1.2.6 RNA的提取和反转录 采用Trizol（Ta KaRa公司）法提取组织样的总RNA，测定总RNA的浓度和纯度。按照PrimeScriptTMⅡ1st Strand c DNA Synthesis Kit反转录试剂盒（Ta Ka-Ra公司）进行反转录。反转录为20μL体系，第一步（10μL）：包括4μL总RNA，1μL d NTP Mixture，0.5μL Oligo d T Primer，0.5μL Random 6 Primers，4μL RNase Free d H2O，反应条件：65℃5 min，冰上急冷2 min；第二步（20μL）：包括上述反应液10μL，4μL 5×PrimeScriptⅡBuffer，0.5μL RNase Inhibitor，1μL PrimeScriptⅡRTase，4.5 μL RNase Free d H2O，反应条件：42℃50 min，95℃5 min。反转录产物4℃保存备用。

表1 引物序列、退火温度及PCR产物长度Table 1 Primer sequence，annealing temperature and PCR product size

1.2.7 实时荧光定量PCR反应 荧光定量PCR在Bio-Rad公司ICycler IQTM5荧光定量PCR仪上进行。反应体系：SYBR®Green PCR Master Mix 10μL，上、下游引物各0.4μL，RNase Free d H2O 7.2μL，cDNA模板2μL。反应程序：95℃15 s，60℃30 S，40个循环。熔解曲线分析：95℃10 s，60℃1 min，然后以0.5℃／10 s的速率从60℃缓慢升温到95℃。每个样品做3个重复。

1.2.8 实时荧光定量PCR数据统计与分析 首先将组内尾脂组织的实时荧光定量数据中每个样品的3个重复进行比较，去除极端值后用于后续数据处理，采用2-△△ct法计算相对表达量。运用SPSS17.0软件（SPSS Science，Chicago，IL，USA）的ANOVA过程进行单变量方差分析。

2 结 果

2.1 候选基因的确定及功能富集分析

本试验共有46 355个常染色体SNPs参与FST计算，FST平均值为0.029，最高值为10号染色体OAR10＿29511510.1位点（FST＝0.865，图1）。其中465个FST值在前1%SNP位点定义为受选择和差异位点。

图1 全基因组FST值分布情况Fig.1 Genome-wide distribution of FST values

按照Ovis aries 3.1基因组数据信息进行基因注释，共找到448个基因。注释标准为以选择信号发生区域核心SNP为中心，上下游各扩展50 kb为选择区段。部分候选基因与绵羊重要性状相关，主要包括繁殖性状（RXRG、FGFR2、SOX 6）、肉质性状（PPARG、PDGFD）、生长发育性状（BMP2、PPP1CC、FGF7）、体形外貌性状（MSRB3、RXFP2、MITF）及免疫抗病性状（BCAP29、NF1）等。

2.2 脂肪合成代谢相关候选基因筛选及功能富集分析

本研究重点关注脂肪代谢合成相关候选基因。发现在448个候选基因中有50个基因与脂肪合成代谢相关（表2），占所有候选基因的10%以上。将这50个基因进行GO富集分析，P阈值设定为0.01，共得到52个GO条目，部分结果见表3。GO富集分析结果发现，这些基因主要富集在脂类生物

合成、磷脂代谢、细胞形态发生、生殖过程及细胞调节等生物学过程。在细胞组分富集分析方面主要富集在细胞组分、内质网、膜组分等。从分子功能富集分析看出20个候选基因主要富集于脂肪酸连接酶活性、脂质结合、激活蛋白结合等。值得注意的是：其中有5个条目包含RRARG基因，分别为脂质代谢调节过程、转移酶活性调节、细胞大小调节（生物学过程富集）和脂质结合（分子功能富集）及细胞液（细胞组分富集）；另有2个条目包含PDGFD基因，分别为磷酸盐代谢过程调节和磷代谢过程调节（生物学过程富集）。此外，通过KEGG通路分析还得到一个与脂肪合成代谢有关的PPAR信号通路（图2），包括基因PPARG、RXRG、SLC27A2和ACSL6。

表2 筛选出的与脂肪合成代谢相关的候选基因Table 2 The candidate genes related to lipid metabolism under selection

表3 脂肪代谢相关候选基因GO富集分析Table 3 The result of GO enrichment analysis of candidate genes related to lipid metabolism

图2 PPAR信号通路Fig.2 PPAR signaling pathway

2.3 PPARG和PDGFD尾脂组织表达量差异

本研究共筛选到448个候选基因，GO功能富集分析和KEGG通路分析均表明，PPARG基因（FST＝0.31）与脂肪合成代谢密切相关，前人研究也发现，PPARG能够促进脂肪细胞合成，加快脂肪分化和沉积［17-19］。另外一个受到显著选择的基因PDGFD，FST值为0.59，处于总SNP的前0.1%。研究表明，PDGFD基因能够促进脂肪前体细胞增殖并抑制其分化［20-21］，而且其在人类脂肪组织中的表达量比除甲状腺组织之外的其他组织都要高［22］，故把这两个基因作为与脂肪合成代谢相关的重点候选基因，并在呼伦贝尔羊（大尾和小尾品系；肥尾）尾脂和藏羊（瘦尾）尾脂中分别研究PPARG和PDGFD的表达量差异（图3和图4），以探索PPARG和PDGFD的调控作用。

图3给出了PPARG基因在3个不同尾型绵羊群体尾脂中的表达量差异。可见，呼伦贝尔羊大尾及小尾品系尾脂PPARG表达量均显著高于藏羊（P＜0.01），且呼伦贝尔羊大尾品系尾脂PPARG表达量显著高于小尾品系（P＜0.05）。

图4给出了PDGFD基因在3个不同尾型绵羊群体尾脂中的表达量差异。可见，呼伦贝尔羊大尾及小尾品系尾脂PDGFD表达量均显著高于藏羊（P＜0.01），约4倍，而呼伦贝尔羊大尾品系尾脂PDGFD表达量与小尾品系无明显差异。

图3 3个不同尾型绵羊群体PPARG表达量差异Fig.3 The relative expression difference of PPARG in 3 sheep populations with distinct tail types

图4 3个不同尾型绵羊群体PDGFD表达量差异Fig.4 The relative expression difference of PDGFD in 3 sheep populations with distinct tail types

3 讨 论

3.1 群体分化指数（FST）检验方法在家畜中的应用

随着J.M.Akey等［7］在基因组水平利用SNP的FST经验分布检测到174个候选基因构成第一张人类正选择基因图谱的问世，其他物种全基因组SNP芯片得到广泛应用，用来探究群体内或亚群间受选择的基因。基因组水平的研究，不同的统计分析方法效率不同，得到的结果有时也会不同。K.R.Thornton等［6］研究表明，群体分化指数FST是群体基因组研究中最简单有效的群体遗传分化指标之一。其原理是中性条件下的遗传漂变（Genetic drift）造成了群体间的FST值，群体在候选基因及附近遗传标记特异的正选择作用可能引起FST值的增大［23-24］。近几年，该方法在家畜中得到广泛应用［8-13］。李秀领等［25］利用FST方法对商用品种大白猪和地方品种通城猪的全基因组SNP芯片数据进行分析，检测两个品种的遗传分化程度，共得到76个候选基因，其中部分基因与生长繁殖性状及免疫应答有关，其研究结果为猪产肉、抗病等性状候选基因的深入挖掘提供了有益参考。刘喜冬等［26］利用FST检验方法分析西门塔尔牛群体的遗传分化，共检测到3 064个群体特异的候选基因，部分基因与牛肉质及繁殖性状相关，构建了我国肉牛的全基因组选择信号图谱，为深入研究人工选择和生物进化提供了线索。曾滔等［27］采用群体分化指数FST法对苏尼特羊、德国肉用美利奴羊和杜泊羊进行群体间选择信号检测分析，得到365个候选基因，其中部分与绵羊生长、繁殖及肉质性状相关，为绵羊育种提供了有益参考。

3.2 不同尾型绵羊群体选择信号分析

本研究利用FST法对蒙古羊和藏羊进行选择信号分析，共检测到448个候选基因。利用DAVID在线软件对筛选出的448个候选基因进行GO富集分析，共得到43个GO条目。结果表明，这些基因主要富集在发育过程、细胞形态建成、大分子分解代谢、转录调控、性别分化等生物学过程。细胞组分富集分析发现7个受选择的基因，富集在初级纤毛、细胞桥粒。此外，在分子功能富集分析方面，发现13个基因，主要富集于活性亚硫酸盐细胞膜转运活性、硫酸盐细胞膜转运活性及形成有活性的C-S键。本研究重点关注绵羊脂肪沉积代谢，故从中挑选出与脂肪合成代谢相关的候选基因，共50个，包括PPARG、PDGFD、RXRG等。GO分析结果发现，这些基因主要富集在脂类生物合成、磷脂代谢、细胞形态发生、生殖过程及细胞调节等生物学过程，细胞组分富集分析方面主要富集在细胞组分、内质网、膜组分等，分子功能富集分析方面主要富集于脂肪酸连接酶活性、脂质结合、激活蛋白结合等。

本研究筛选到的候选基因中，部分基因已经在其他相关文献中得到报道。如J.W.Kijas等［12］通过选择信号检测对世界多个绵羊品种进行全基因组分析得到的一些基因及相关基因，包括NPR2、MSRB3、ABCG2、RXFP2、NF1、BMP2、MITF、FGF7等，均在本次研究中被筛选到。NPR2为鸟苷酸环化酶受体，与小鼠卵母细胞减数分裂的阻滞相关［28］。L.A.Doyle等首先发现ABCG2（ATP结合转运蛋白G超家族成员2）与肿瘤细胞耐药有关［29］，H.G.Olsen等后来发现ABCG2A与产乳量、乳蛋白率及乳脂率紧密相关［30］。NF1与人类神经纤维瘤相关［31］。FGF7为成纤维细胞生长因子7，能够刺激小鼠乳腺上皮细胞和肌上皮细胞的增殖［32］。同时，也检测到S.Qanbari等［33］对不同国家多个奶牛及肉牛品种进行选择信号检测发现的ADAMTS6基因。ADAMTS6基因与肿瘤发育相关［34］。另外，与M.H.Moradi等［14］对伊朗脂尾和瘦尾绵羊品种进行全基因组选择性清除扫描检测到的与脂肪沉积相关候选基因中部分基因保持一致，包括SPAG8、HINT2等。研究表明，SPAG8为精子关联抗原8，在雄性生殖细胞分化时产生，可能在精子发生的细胞分裂中起到一定作用［35］。HINT2在小鼠体内能够影响血糖调节和线粒体功能［36］。此外，将本次研究检测的候选基因与L.Zhang等［37］获得的绵羊肉用性状全基因组关联分析结果相比较，也发现一些相关基因，包括GRM8、CRADD、RPL 36、RPL3、RPL 23A、EPB41L 2、LRRC58、LRRC8A、LRRC18、SHISA3等。

本研究检测到的候选基因中，部分基因与绵羊的生长发育性状（BMP2、PPP1CC）、繁殖性状（RXRG、FGFR2）、体形外貌性状（MSRB3、RXFP2、MITF）及肉质性状（PDGFD、PPARG）等重要性状相关。BMP2为骨发育形态蛋白2，参与骨骼形态和体型发育［12］。PPP1CC基因为蛋白磷酸酶1的催化亚基，它是广泛存在于骨骼肌中的一种糖原相关磷酸酶，具有去磷酸化及糖原合成酶后期失活作用［38］。PPP1CC是骨骼肌收缩作用所需成分之一［39］，且可能与细胞周期阻滞、凋亡及组织的缺氧有关［40］。最新研究表明，PPP1CC是骨骼肌强度性状相关的候选基因位点［41］。RXRG基因作为视黄酸的一种受体（RXR）的配体激活转录因子，结合到靶基因的特定应答序列（DNA）上，调节基因的转录表达，是细胞分化和组织形态发生的主要调节因子。视黄酸是细胞分化和组织形态发生的主要调节因子，在上皮细胞生长、细胞分化、组织维持、视觉、胎儿发育及繁殖等过程中发挥着重要作用［42］。黄萌等［43］研究表明，RXRG基因AB基因型鲁西牛比AA基因型个体更易产生双胎，鲁西牛单双胎群体中的基因型组成对双胎性状的影响极显著，表明RXRG对牛的繁殖力有显著的影响。另外，本次研究发现RXR基因富集在PPAR信号通路（图2）中，表明其可能与脂肪代谢沉积相关。FGFR2是胚胎中最早表达并传导FGF信号的一种FGF受体。研究表明靶向断裂纯合FGFR2基因致使小鼠胚胎附植后不久便死亡［44］。在牛上的研究发现，FGF2可能通过与FGFR2作用，促进滋养外胚层细胞DNA的合成反应［45］，有利于胚胎存活。FGFR2在胚胎血管形成和维持胚胎血管完整性方面起重要作用，抑制FGFR2表达，则导致上皮细胞迁移的抑制，增加细胞凋亡［46］。MSRB3为蛋氨酸亚砜还原酶B3，研究表明，MSRB3与人类耳聋相关［47］。最新全基因组关联分析（GWAS）表明，MSRB3在犬［48-49］和猪上作为与耳型相关的候选基因。S.E.Johnston等［50］发现RXFP2与绵羊角的缺失相关，此外，RXFP2可能与生殖相关，M.Gautier等［51］发现RXFP2能够影响雄性动物繁殖力。文献表明，MITF可与KIT基因互作影响黑色素细胞发育，导致猪、牛色斑表型的形成［52］。

3.3 尾脂组织PDGFD和PPARG基因的相对表达量

PDGFD是PDGF 4个家族成员中促进增殖作用最强的一个，它最早是在人类血小板中被检测并纯化出来，隐藏在α颗粒中并释放出来对血小板起到激活作用［53-54］。研究表明，PDGF基因能够促进脂肪前体细胞增殖并抑制其分化［20-21］。实时定量PCR研究表明，PDGFD在人类脂肪组织中的表达量比除甲状腺组织之外的其他组织都要高［22］。PPARG属于过氧化物酶体增殖物激活受体家族的一员，是诱导脂肪分化的充分且必需条件，能够启动脂肪细胞的分化［55］。P.Tontonoz等［18］研究发现，PPARG可以促进纤维母细胞转化成脂肪细胞。J.R.Jones等［56］研究发现，PPARG基因敲除小鼠喂食高脂肪食物情况下，体重和体脂肪含量显著低于对照组。另外，PPARG能促进小脂肪细胞生成［57］，可以调节脂蛋白脂酶、乙酰-Co A合成酶、脂肪酸结合蛋白及脂肪酸转运蛋白等的表达［58］。这些研究充分表明，PPARG能够调控脂肪细胞的生长分化过程。

PPARG在蛋白质、葡萄糖及脂质的代谢过程中也具有重要调控作用［59］，能够调控细胞增殖、细胞周期和生长发育过程中部分相关基因的表达［60-61］。林婄婄等［61］在不同脂尾型绵羊脂肪组织中对PPARG的发育性表达研究表明，PPARG的表达在品种间存在差异，广灵大尾羊（长脂尾型）尾脂组织中PPARG的表达量高于小尾寒羊（短脂尾型）尾脂组织，而且月龄对PPARG的表达无显著影响。本次研究中，重点挑选与脂肪代谢合成相关的候选基因，对其中检测到的PPARG和PDGFD基因利用呼伦贝尔羊大尾和小尾品系尾脂及藏羊尾脂进行了表达量分析。呼伦贝尔羊大尾和小尾品系均属于短脂尾型绵羊，尾部沉积大量脂肪，且呼伦贝尔羊大尾品系尾脂含量明显高于小尾品系，而藏羊属于短瘦尾型绵羊，尾部沉积脂肪非常少。结果显示，对于PPARG基因，呼伦贝尔羊大尾及小尾品系尾脂表达量均显著高于藏羊，且呼伦贝尔羊大尾品系显著高于小尾品系；对于PDGFD基因，呼伦贝尔羊大尾及小尾品系尾脂表达量显著高于藏羊，而呼伦贝尔羊大尾品系与小尾品系尾脂表达量无明显差异，这与文献报道一致［20-22，55-57，61］，进一步说明PPARG和PDGFD与绵羊的尾部脂肪沉积有关，可作为绵羊尾型选育的候选基因，为绵羊尾型和肉质改良提供了重要参考。

3.4 选择信号检测展望

目前基因组水平选择信号的检测还处于起始阶段。由于家畜的大部分驯化性状受到多个基因的共同影响，且基因之间的互作造成基因表达的不确定，再加上受到分子、细胞、组织、个体及生态环境甚至客观因素等多层面多因素的复杂影响，使得选择信号的检测难度很大，检测结果的准确性也受到一定影响。另外，FST法本身也有局限性，如果基因在完成选择的群体中已经固定下来，基因周围的连锁不平衡就会被充分的重组降解，得到的FST值就比较小，候选基因就检测不到。随着高密度SNP芯片的进一步发展及统计分析方法的进一步改进，更多的群体遗传分化奥秘将会被揭开，更多的选择信号位点将会被检测到，也将得到更多与绵羊重要性状相关的候选基因，更好地促进我国绵羊的育种与改良。

4 结 论

本研究利用蒙古羊和藏羊群体的SNP芯片分型数据，基于遗传分化系数FST法进行群体间选择信号检测并进行基因注释，共找到448个候选基因，从中筛选出50个与脂类代谢相关的基因，GO分析发现，它们主要富集在脂类生物合成过程、磷脂代谢、脂质结合等条目，其中4个基因（PPARG、 RXRG、SLC27A2和ACSL6）富集在PPAR信号通路中。对与脂类代谢相关的重要候选基因PPARG和PDGFD进行相对表达量分析，结果表明这两个基因与脂肪沉积密切相关，可以作为尾型选育的候选基因。本研究筛选到的候选基因中部分与绵羊重要性状相关，为绵羊尾型选育、品种改良及功能基因组研究提供了重要参考依据。

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