牛FABP3转基因小鼠的遗传及表达特性研究

李 娟，杜新华，陈 燕，高 雪，李俊雅，许尚忠

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193）

在肉牛育种工作中，培育出肉质好、营养价值高的肉牛品种是育种工作者努力的方向。脂肪酸结合蛋白3（Fatty acid binding protein 3，FABP3）作为与动物肌内脂肪沉积相关的候选基因得到了广泛关注。研究表明，该基因SNPs位点与哺乳动物的背膘厚、大理石花纹、剪切力等脂肪沉积相关性状存在显著差异［1-2］。因此，开展FABP3基因特性研究对优质肉牛新品种的培育具有重要指导意义。

FABP3基因是脂肪酸结合蛋白基因家族的一员，主要分布在动物的心肌和骨骼肌细胞中［3］，参与脂肪酸的转运，促进脂肪酸的合成，对脂肪的沉积、转运及基因的转录具有重要作用［4-5］。FABP3可结合和转运长链脂肪酸，促进心肌和骨骼肌细胞中甘油三酯的沉积，被视为影响肌内脂肪含量的重要候选基因［6］。在家畜育种中主要集中在FABP3基因多态位点与性状之间的关联分析。F.Gerbens等［1，7-8］证明猪FABP3基因是影响肌内脂肪的候选基因。Z.G.Huang等［9］报道肉羊FABP3的mRNA表达与肌内脂肪含量呈正相关；余刚等［10-12］报道，FABP3基因与陕北白绒山羊的背膘厚、大理石花纹间存在极显著相关性。李武峰等［13］发现肉牛FABP3基因位点与牛肉嫩度剪切力显著相关，王卓和昝林森［14］发现，秦川牛FABP3基因与后腿围、背膘厚、嫩度、大理石花纹等性状存在极显著相关。因此将该基因作为肌内脂肪沉积的候选基因来寻找改善肉品质的方法，仍有大量的工作需要继续［15］。

小鼠作为重要的模式动物已得到广泛应用，其基因组改造技术成熟，且生理生化特点和发育过程与家畜相似；另一优点是小鼠作为遗传学研究材料其基因组计划已完成，为研究基因功能及其表达调控的分子机制提供了条件基础和技术手段。1982年，Palmiter实验室产生的“超级转基因鼠”首次证明了转基因鼠的可行性；2001年，塞莱拉公司宣布完成了小鼠基因组测序的草图，这极大促进了小鼠作为重要转基因模型的发展［16］。

在基因水平研究FABP3基因对牛等家畜脂肪代谢的调控机理仍处于探索中，将牛的FABP3基因转入小鼠体内，并验证其功能，是牛功能基因在模式动物体内验证的一种有效方法。本研究主要对转牛FABP3基因的小鼠及其子代进行验证，并检测目的基因在小鼠体内的遗传情况；同时，利用荧光定量和组织荧光技术验证小鼠不同组织中FABP3基因表达水平，以期探明转牛FABP3基因小鼠的遗传与表达特性，为牛FABP3基因功能研究奠定基础，也为牛的分子遗传育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究采用杜新华博士（2013年）在中国医学科学院医学实验动物研究所利用C57BL／6J品系供体鼠和公鼠获得的受精卵，通过显微注射质粒PB［CMV-EGFP-FABP3］和辅助质粒pcDNA-pBase制备得到的4只转基因小鼠2雄（编号1、2号）2雌（编号3、4号），另外购得非转基因个体5只（C57BL／6J品系）作为对照组，1雄4雌［17］。制定交配方案为第1组：1号♂转基因鼠与3号♀转基因鼠交配；第2组：2号♂转基因鼠与4号♀转基因鼠交配；第3组：1号♂转基因鼠与野生型雌性交配；第4组：2号♂转基因鼠与野生型雌性交配；第5组：野生型个体自由交配作为对照组。

1.2 方法

1.2.1 G0代转基因小鼠RT-PCR验证 将获得的4只转基因小鼠进行活体成像，确认为阳性个体；另外取10～20 mg鼠尾，按照天根动物组织总RNA试剂盒的步骤提取鼠尾总RNA。RT-PCR反应：（1）RNA变性，反应体系：Oligod T Primer 1 μL、d NTP（10 mmol·L-1）1μL、总RNA 2μL、加RNase free dd H2O至10μL；将反应液置于65℃保温5 min，迅速置于冰上；（2）反转录，反应体系：上述变性反应液10μL、5×PrimeScript II Buffer 4.0 μL、RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5μL、Prime-Script II RTase（200 U·μL-1）1.0μL、RNase free dd H2O补至20μL，42℃反应30～60 min，95℃灭活5 min，置于冰上冷却，转录后的cDNA于-20℃保存；（3）PCR扩增，以上述反应得到的c DNA为模板，以FABP3-F：5′-CCGGAATTCGCCACCATGGTGGACGCCTTC-3′，R：5′-CGCGGATCCTGCCTGTTTCTCGTA-3′为引物扩增FABP3基因。PCR反应体系：反转录的cDNA稀释10倍后取1.0 μL、d NTP（10 mmol·L-1）2.0μL、10×PCR Buffer（Mg2＋plus）2.0μL、Primer（10μmol·L-1）各0.5μL、Taq DNA酶0.5μL、加入dd H2O调至20 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；72℃延伸10 min。电泳检测转基因小鼠RNA表达情况。

1.2.2 G1代转基因小鼠阳性检测 提取4只G0代转基因小鼠基因组DNA作为转基因阳性个体对照，提取G1代个体基因组DNA。步骤如下：剪取G1代小鼠鼠尾1 cm左右，根据试剂盒OMEGA Genomic DNA Isolation Kit步聚提取基因组DNA；利用Primer primer5软件设计引物扩增牛FABP3 基因，其上游引物为 F：5′-AGCAGAAGAACGGCATCA-3′；下游引物为R：5′-TTGTGGTAGGCTTGGTCATA-3′。PCR扩增反应体系：DNA模板1.0μL、10×PCR Buffer（Mg2＋plus）2.0μL、d NTP（10 mmol·L-1）0.4μL、正反向引物各0.6μL、Taq DNA酶0.2μL、补dd H2O至20μL；扩增程序：预变性95℃5 min；35个循环：94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min；最后，72℃延伸5 min。扩增结束，电泳检测阳性条带的PCR产物送上海生工生物技术有限公司进行测序；然后，通过BLAST搜索比对以确定转基因小鼠的遗传情况。1.2.3 G1代转基因小鼠FABP3表达水平检测

为了验证牛FABP3基因在小鼠体内的表达水平，以及该基因与营养调控的共同作用下FABP3表达量的变化。选取第1组G1代阳性个体2只、第2组1只、第3组1只、第4组1只、G0代个体1只、非转基因个体4只作为阴性对照，利用荧光定量PCR检测牛FABP3在转基因小鼠子代心和骨骼肌中的表达水平。提取小鼠组织总RNA，电泳检测18S、28S条带清晰后，将RNA反转录，以小鼠β-actin基因为内参，利用Primer primer5软件分别设计引物（表1）。每个样品3个重复；相对表达量的计算采用2-ΔΔCT法，结果用“平均值±标准误”表示，并采用邓肯式新复极差检验法（DMRT法）进行表达量差异分析。

表1 荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in the Real-time PCR amplification

1.2.4 组织原位表达鉴定 选取G0代转基因小鼠1只，G1代转基因小鼠2只，非转基因小鼠2只处死后，采集心、肝、肾、背部骨骼肌组织置于液氮速冻后，放入-80℃冰箱中保存待用。切片制备：切片机打开预冷2 h，使切片机的箱体温度达-18℃，刀头温度达到-20℃。将切片机的载物托涂上一层包埋剂待其冷冻后，将包埋剂的上端削平，每只小鼠取合适大小相同的组织部位，置于载物托上，包埋剂包埋待用，将载物托安装到刀头，调试刀头后开始切片，设置切片厚度为6μm。将切片置于荧光正置显微镜下100倍放大视野中观察绿色荧光蛋白表达情况。

2 结 果

2.1 转基因个体及后代的阳性验证

2.1.1 G0代转基因小鼠的阳性验证 本研究所用转基因载体携带EGFP，因此，在荧光灯照射下，4只G0代转基因小鼠爪子及尾根部被毛覆盖较少的地方可以看到绿色荧光（图1左）。转基因小鼠1、2、3、4号个体RT-PCR电泳结果表明，位于大约400 bp的位置有明显的扩增条带（图1右），与目标基因片段大小相符，说明4只小鼠是转基因阳性个体，且牛FABP3基因在小鼠体内表达。

2.1.2 G1代转基因小鼠DNA水平阳性检测应用交配方案，4组G0代小鼠交配共产生G1代仔鼠28只；提取G1代小鼠基因组DNA扩增后，电泳检测共获得19只阳性个体（图2）。转基因小鼠子代阳性率的检测结果表明，第1组G1代个体的阳性率最高（100%），第4组次之（75%），第2组为55.6%，第3组最低（42.8%）（表2）。表明4只G0代转基因阳性小鼠个体可将目的基因遗传给后代，但转基因小鼠的后代遗传比例存在差异。

图1 4只转基因小鼠阳性检测Fig.1 The positive detecting on 4 transgenic mice

表2 转基因小鼠各组阳性率比较Table 2 Comparing the positive rate of genetic modified mice among different groups

图2 转基因小鼠子代个体基因组DNA鉴定Fig.2 PCR detection of genetic modified mice

2.1.3 阳性个体的测序结果 通过PCR扩增电泳为阳性后，测序，显示所得到的序列全部个体一致，FABP3序列信息：AGCAGAAGGACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCT-CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCGCCACCATGGTGGACGCCTTCGTGGGTACCTGGAAGTTAGTGGACAGCAAGAATTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTCGGTTTTGCTACCAGGCAGGTGGGCAATATGACCAAGCCTACCACAAA。

图3 FABP3转基因序列搜索比对Fig.3 BLAST results of the transgene sequence FABP3

序列BLAST软件搜索比对如图3，结果表明，该序列前314个碱基与载体EGFP-C1序列的相似度达99%，而后127个碱基与牛FABP3的m RNA序列对比一致性达100%，因此，本试验进一步证明携带牛FABP3基因的质粒转入了小鼠的基因组DNA中，且能够遗传给下一代。

2.2 转基因子代小鼠FABP3 mRNA表达差异

转基因子代小鼠RT-PCR检测结果表明（表3、表4），相对于阴性对照组而言，在心肌中转基因小鼠FABP3的表达增加量在1～1.7倍，骨骼肌中目的基因的相对表达增加量在1～3倍，其中2号个体的总FABP3基因的表达增加量达3.21倍。在G1代转牛FABP3基因小鼠阳性个体中，1、2号小鼠在心肌和骨骼肌中的表达量都比较高，尤其是骨骼肌中相对阴性对照个体表达量达到3倍以上，通过邓肯式新复极差检验均表现差异极显著（P＜0.01）；3号小鼠心肌和骨骼肌中的表达量也较高，通过DMRT检验在骨骼肌显著表达（P＜0.05）；第4只是转基因小鼠雄性与非转基因小鼠雌性交配所生的后代，相对于阴性对照外源基因在小鼠心和骨骼肌中的表达量差异不显著；第5只小鼠与第4只小鼠都是转基因雄性个体与非转基因雌性小鼠的后代，外源基因的表达量没有明显的增加（图4）；第6只小鼠为G0代，其表达量低于G1代个体，这可能与饲喂的日粮不同有关。

表3 牛FABP3基因在小鼠不同个体心肌中实时荧光定量PCRTable 3 RT-qPCR results of FABP3 gene in mice heart muscle

表4 牛FABP3基因在小鼠不同个体骨骼肌中实时荧光定量PCRTable 4 RT-qPCR results of FABP3 gene in mice skeletal muscle

2.3 组织原位表达

GFP是一种绿色荧光蛋白，它作为标记载体可以更直接的在荧光显微镜下观测转基因个体是否转入成功，因此对转基因个体进行了直接切片检测。

对G0代转基因小鼠不同组织的绿色荧光蛋白进行荧光检测，转基因个体的载体不可能均匀分布在小鼠体内，因此转基因个体的组织出现了许多的小亮斑。结果表明（图5），心肌中的荧光蛋白出现的亮斑相对较多，如图5A1中的箭头所指呈现绿色荧光斑点；肝中的表达量最低（图5A2）；肾（图5A3）中的荧光点也比较多，证明携带目的基因的载体EGFP蛋白存在于G0代转基因小鼠体内并得到了有效表达。

G1代小鼠切片中（图5，B1～B4）GFP蛋白仍有表达，但是亮斑的数量相对G0代明显有所减少。G1代中GFP蛋白的表达量最高的为骨骼肌、其次是心肌、肾、肝。证明转基因小鼠所携带的荧光蛋白可以通过繁殖遗传给后代，阴性对照个体可以看出细胞的分布，属自身荧光，没有出现GFP蛋白的荧光亮斑，且在荧光显微镜下观测时，自身荧光很快会被淬灭。

图4 牛FABP3基因在小鼠心肌和骨骼肌中的表达量柱状图Fig.4 The histogram of FABP3 expression of cattle in transgenic mice myocardial and skeletal muscle

图5 G0、G1代转基因阳性个体与阴性对照个体心、肝、肾、骨骼肌组织切片荧光比较100×Fig.5 The fluorescence detection of heart，liver，kidney，skeletal muscle in G0 and G1 generation 100×

3 讨 论

转基因动物的阳性鉴定及基因表达的研究是转基因动物后续功能验证的基础。本研究验证了转牛FABP3基因小鼠遗传表达情况，发现牛FABP3基因可以被整合入小鼠基因组，并遗传给子代，但不同的子代基因表达受到一定影响；不同交配组合其子代阳性率差异也较大，第一组个体中的遗传性较好，其阳性率达到100%，这可能与目的片段的插入位点和整合位点有一定关系［18］，需要通过染色体步移或者基因捕获等技术进行检测。

FABP3基因是影响脂肪沉积的关键基因，其表达上调时脂肪吸收和代谢能力增强，促进心肌和肌肉细胞中甘油三酯的沉积，从而增加肌内脂肪的含量［19］。本研究发现，在转基因小鼠不同组织中FABP3蛋白沉积存在较大差异，骨骼肌和心肌中总FABP3表达量较高，这与之前B.P.Atshaves等报道的FABP3促进心肌中脂肪的沉积结果相一致［20］；说明高油对FABP3表达起调控作用。本研究在m RNA水平检测了一只G0代个体的FABP3表达，可能个体间存在差异，其表达量偏低。在组织表达检测中，发现GFP蛋白在G1代中的表达明显少于G0代，这可能是外源基因在转基因动物及其子代中常常发生拷贝数丢失和表达沉默的现象［21］。

文献报道FABP3基因主要分布在心肌和骨骼肌细胞中，且参与心肌和骨骼肌的脂肪代谢［22-23］，因此，在心肌和骨骼肌中的表达量较高。心肌中FABP3基因表达量过高会造成心肌损伤或细胞线粒体代谢紊乱，并诱发细胞凋亡［24］。在本研究中，饲养的小鼠健康状况良好，但是G0代小鼠的繁殖性状不稳定，产子率较低，且易出现死胎等，这可能与FABP3转座子、载体插入小鼠基因组后对小鼠整体生产性能有影响，需待进一步验证。

4 结 论

本研究检测了牛FABP3基因在模式动物小鼠体内的遗传与表达特性，并通过繁殖后代验证了牛FABP3转基因小鼠的遗传性，FABP3基因的小鼠可以携带外源基因遗传。后期还需要对转基因小鼠遗传稳定性方面继续进行研究，对遗传稳定个体进行分子水平和蛋白质水平的验证，为肉牛育种工作积累有价值基因。

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