牛偏爱密码子优化后的Beta蛋白多克隆抗体制备

齐 昱，邢燕平，周欢敏，房 君，钱 呈，王海涛

（内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特010019）

同源重组是基因工程研究中常用的技术手段，在研究基因功能和制作转基因生物方面具有重要作用。传统的同源重组方法效率较低，操作繁琐，成本高。近几年来，一种基于λ噬菌体Red重组酶作用的同源重组技术逐渐成为基因工程研究的热点之一，并取得了一系列重要进展。Red同源重组系统由λ噬菌体exo、bet、gam 3个基因组成，它们分别编码Exo、Beta、Gam 3种蛋白质［1-2］。Beta蛋白是Red同源重组系统中最关键的酶，在重组过程中起着决定性的作用，只需40 bp的同源区域既能介导同源重组，且在无Red系统中其他两种蛋白参与的情况下即可使单链DNA与染色体上的同源区域发生重组。

研究发现将某一物种的基因在其他物种细胞中进行表达时，表达效率通常会有所下降。这是由于不同物种间对密码子偏爱性差异导致的。不同物种间密码子偏好性的出现是由于同义密码子的使用频率存在显著差异［3-4］，可能是由不同物种中氨基酸特异性t RNA的含量、特异性及编码效率［5］或mRNA转录效率决定的［6］。密码子优化是提高蛋白表达水平的可行途径之一。

迄今尚没有关于利用瞬时表达Beta蛋白对牛体细胞进行高效同源重组的报道。鉴定Beta蛋白是否在牛体细胞中瞬时表达以及表达量的多少都离不开Beta蛋白的抗体，目前市场上尚无利用牛偏爱密码子进行优化后的Beta蛋白的抗体出售。本研究以牛偏爱密码子对bet基因进行改造并利用基因工程法表达并纯化了Beta蛋白，制备其多克隆抗体，为下一步在牛体细胞中实现Beta蛋白的重组功能提供检测抗体，并为进一步研究bet基因的功能和Beta蛋白在牛及其他哺乳动物同源重组方面的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 试验动物 5只2月龄雄性CD1小鼠购自内蒙古大学动物中心。

1.1.2 试剂 E.coli BL21和表达载体p ET28a由本实验室保存；DNA maker、Primer Star PCR酶和连接酶Ligation High均购自Ta KaRa公司；限制性内切酶Bam H I和Not I购自Themo Scientific公司；Trans T1感受态细胞购自全式金公司；IPTG、蛋白maker购自Fermentas公司；质粒提取试剂盒购自天根公司；胶回收试剂盒、引物合成和DNA测序均由上海生工生物工程有限公司完成；菌体蛋白提取试剂盒购自QIAgen公司；His tag纯化试剂盒购自Promega公司；弗氏佐剂、鼠源His tag抗体和磷酸酯酶标记的山羊抗鼠IgG均购自Sigma公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG购自深圳达科为公司；

1.2 方法

1.2.1 bet基因的优化与扩增 将已公布的λ噬菌体bet基因序列（登录号为AP005153），在不改变氨基酸序列的前提下，根据牛（Bos taurus）偏爱密码子采用GenScript公司OptimumGene Codon Optimization Analysis在线软件（http：／／www.genscript.com.cn）对bet基因密码子优化并进行全基因组合成。优化参数主要包括密码子适应指数（Codon adaptation index，CAI）、GC含量调整及优势密码子频率（Frequency of optimal codons，FOP）等。根据优化后的序列设计引物，上游引物：5′-AAGGATCCATGAGTACAGCCCTAG-3′（下划线处为限制性核酸内切酶Bam H I位点）；下游引物：5′-AAGCGGCCGCGGCAGCAACCTTCTG-3′（下划线处为限制性核酸内切酶Not I位点）。扩增条件：94℃预变性5 min；94℃1 min，58℃1 min，72℃2 min，30个循环；72℃延伸10 min。

1.2.2 bet原核表达载体的构建 PCR产物和p ET28a载体分别经Bam H I和Not I双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。将酶切后的PCR产物和载体片段混合加入Ligation High，16℃过夜连接。将连接产物转化到Trans T1感受体细胞中，用菌落PCR和酶切鉴定的方法筛选含有目的基因的重组质粒，并对筛选出的质粒进行测序分析。

1.2.3 重组质粒在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达 将经序列测序分析后完全正确的重组质粒转化入E.coli BL21感受态细胞中，形成重组菌。按1∶100的体积比将重组菌接种到含50 mg·L-1Kan的LB液体培养基中，200 r·min-1，37℃震荡培养至菌液OD600nm＝0.4～0.6后，向菌液中加入终浓度为0.4 mmol·L-1IPTG，25℃120 r·min-1诱导4 h，收集菌液。

1.2.4 融合蛋白的纯化和检测 收集的菌液用His LinkTMspin protein purification system试剂盒（Promega公司）进行纯化，步骤详见说明书。将纯化过程中产生的裂解液上清，过柱液和洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot鉴定（一抗为鼠源His tag抗体，二抗为山羊抗鼠IgG）。

1.2.5 Beta蛋白多克隆抗体的制备 免疫前，先分别采集5只试验鼠的眦血分离血清，作为后续抗体检测试验的阴性对照样品。初次免疫时免疫剂量为每只试验鼠0.5 mg抗原，纯化的融合蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，超声乳化后对试验鼠进行皮下和腹腔下多点注射；初次免疫两周后，对试验鼠进行二次免疫，免疫计量同样为0.5 mg，与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化；10 d后第3次免疫，免疫计量为0.1 mg。第3次免疫1周后，心脏采血分离血清，采用Western blot方法检测抗体的特异性（一抗为制备的多克隆抗体，二抗为山羊抗鼠IgG）；用ELISA测定抗体滴度（用纯化后的蛋白包板，一抗为制备的多克隆抗体，二抗为HRP标记的山羊抗鼠IgG）。

2 结 果

2.1 bet基因的优化

参考λ噬菌体bet基因序列，以牛偏爱的密码子对bet基因进行密码子优化。优化后CAI相对频率明显增加（图1）。基因序列中GC含量应为50%～70%，过高或过低会严重影响基因的表达效率，优化后bet基因的GC含量略优于优化前（图2）。影响基因表达的另一项重要因素是低使用频率密码子在基因中的含量，为提高基因的表达效率，在不改变氨基酸序列的前提下，尽量用高使用频率的密码子代替低使用频率的密码子。优化后bet基因的优势密码子比例达到62%，明显优于密码子优化前（图3）。优化前后bet基因序列比对分析显示原始bet基因核苷酸序列多处密码子发生改变，但编码的氨基酸序列并没有改变（图4）。

2.2 bet基因的扩增

经PCR扩增后，得到大小约为780 bp的基因片段，与理论值783 bp大小吻合（图5）。

2.3 原核表达载体的构建和鉴定

重组质粒经Bam HⅠ和NotⅠ双酶切和1%琼脂糖凝胶电泳，获得大小约为780 bp的片段，与理论值783 bp相符的（图6）。测序比较后与优化后的bet基因序列完全一致。

图1 密码子优化前（A）后（B）bet基因的密码子适应指数Fig.1 CAI of original（A）and optimized（B）bet gene

图2 密码子优化前（A）后（B）bet基因的GC含量Fig.2 GC content of original（A）and optimized（B）bet gene

图3 密码子优化前（A）后（B）bet基因的优势密码子频率Fig.3 FOP of original（A）and optimized（B）bet gene

2.4 重组质粒在大肠杆菌BL21菌株中诱导表达和融合蛋白纯化

用0.8 mmol·L-1IPTG同时诱导转化重组质粒p ET28a-bet的菌BL21（BL21／p ET28a-bet），转化原始载体p ET28a的菌BL21（BL21／p ET28a），以及未转化任何质粒的菌BL21（BL21／-）。经SDSPAGE分析，BL21／p ET28a-bet的菌体蛋白出现大小约为33 ku的特异性条带，而BL21／p ET28a和BL21／-的菌体蛋白中都未出现该条带（图7）。该特异性条带与His-Beta融合蛋白预期大小相符。经过HisLinkTMSpin Protein Purification System试剂盒纯化后，His-Beta融合蛋白呈现出一条带，纯度较高（图8）。纯化前后的菌体蛋白样品经Western blot检测均呈现单一条带（图9），证明纯化得到的蛋白为His-Beta融合蛋白。

2.5 Beta蛋白多克隆抗体特异性与滴度检测

分别以纯化前后的His-Beta融合蛋白样品为抗原，获得的鼠免疫血清稀释1∶2 000作为一抗，磷酸酯酶标记的山羊抗鼠的IgG 1∶4 000稀释作为二抗，进行Western blot检测，显色后出现分子质量约为33 ku的条带（图10）。说明本文获得的Beta蛋白多克隆抗体具有很强的特异性。

将纯化后的Beta蛋白包被ELISA板，以免疫前的5只鼠血清为阴性对照（200倍稀释，平均OD值为0.098 2），分别测定5只试验鼠不同稀释倍数血清的OD值，取平均值。通过ELISA检测，检测结果显示，Beta抗体滴度可达1∶41 700，并具有良好的量效关系（R2＝0.904 3）（图11）。

3 讨 论

图4 密码子优化前后的bet基因序列Fig.4 Original and optimized bet gene sequence

图5 bet基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定Fig.5 Identified the PCR result of the bet gene by agarose gel electrophoresis

Red同源重组系统由λ噬菌体exo、bet、gam 3个基因组成，它们分别编码Exo、Beta、Gam 3种蛋白质。Exo蛋白是种核酸外切酶，可结合在双链DNA的末端，从DNA双链的5′端向3′端降解DNA，产生3′突出端。Gam蛋白可与Rec BCD核酸外切酶结合，抑制其对外源DNA的降解作用［7］。Beta蛋白是一种退火蛋白，在溶液中，Beta蛋白自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA3′突出端，防止DNA被单链核酸酶降解，同时介导互补单链DNA退火，其机制有两种：一种是链入侵，另一种为单链退火［8-9］。

图6 重组质粒pET28a-bet酶切鉴定Fig.6 Identified the recombinant plasmid pET28a-bet by endonucleases digestion Bam H I and Not I

图7 SDS-PAGE分析pET28a-bet表达产物Fig.7 SDS-PAGE analysis of expression products of pET28a-bet

图8 SDS-PAGE分析His-Beta纯化产物Fig.8 SDS-PAGE analysis of purified His-Beta fusion protein

图9 His-beta融合蛋白的Western blot检测Fig.9 Detection of His-beta fusion protein by Western blot

图10 Western blot检测Beta蛋白多克隆抗体的特异性Fig.10 Western blot detection of specificity of polyclonal anti-beta antibody

图11 ELISA检测Beta蛋白抗体效价Fig.11 Beta polyclonal antibody titer evaluation by ELISA

K.C.Murphy［10］较早利用质粒p TP223表达Red重组酶，使线性DNA片段与染色体发生重组，使大肠杆菌基因缺陷株KM22重组效率大大提高。H.M.Ellis等［11］研究发现，单链DNA可与染色体上的同源序列（40～70 bases）发生重组。与双链DNA重组机制不同，这种单链DNA重组只需要Beta蛋白作用，无需Exo和Gam蛋白参与。近年来，Beta蛋白在微生物的生物工程学改造方面得到广泛应用。但是关于Beta蛋白在哺乳动物或大型家畜细胞中的同源重组方面的研究和应用却鲜有报道。2000年，Y.Zhang等［12］构建含有red（bet）基因的载体pcDNA redβ／PGKneo＊，将其转入小鼠ES细胞，电转入两侧各含28个碱基同源序列的单链DNA，成功地将neo基因突变修复，这说明单链DNA重组技术在哺乳动物细胞中也可以实现。因此，制备经牛偏爱密码子优化后的Beta蛋白的多克隆抗体，可以为今后研究Beta蛋白在牛及大型哺乳动物和家畜的转基因应用方面奠定基础。

很多与融合蛋白诱导表达相关的研究中提到重组菌诱导表达后，在细胞破碎的上清中很难找到融合蛋白，表达产物几乎全部以包涵体的形式存在［13-14］。这可能与p ET系统的高效表达有关。蛋白表达量越高越容易形成包涵体，其原因可能是蛋白合成的速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确地配对。为了解决这一问题，笔者拟通过降低IPTG浓度，降低温度和转速达到控制和降低蛋白表达速度的目的。IPTG是β-半乳糖苷酶的活性诱导物质，它能够诱导外源基因的表达并普遍应用于原核表达系统，使其表达量增加。IPTG具有使表达产物稳定、易鉴定、易纯化等优点，但对于特定的外源基因，其最佳诱导条件往往有所不同。因此，对IPTG最佳诱导浓度、诱导时间、诱导温度以及转速等因素的摸索就成为整个抗体制备过程中的重要环节。经过反复试验和比对最终确定诱导Beta蛋白的最佳条件为IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1，25℃120 r·min-1诱导4 h。本研究通过优化IPTG诱导条件成功解决了这一问题，诱导出Beta融合蛋白并使融合蛋白在细胞破碎后的上清液中大量存在，从而不必再获取和处理包涵体，简化了试验过程。

4 结 论

本研究以牛偏爱密码子将bet基因优化并成功构建于原核表达载体p ET28a上，形成重组质粒p ET28a-bet；目的蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达；纯化得到预期大小的融合蛋白His-Beta；制备了特异性较高的Beta蛋白多克隆抗体，为进一步研究bet基因的功能和Beta蛋白在牛及其他真核生物同源重组过程中的应用奠定基础。

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