水牛BMP1基因对颗粒细胞增殖与凋亡的功能研究

雷小灿，张海航，崔奎青，刘福航，刘庆友，石德顺

（广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁530005）

哺乳动物卵泡发育一直是发育生物学的研究重点，卵泡发育是受各种因素精密调控的复杂过程［1-4］。颗粒细胞在促性腺激素的作用下，自身合成分泌的一系列受体和细胞因子等通过缝隙连接间接调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长发育直至成熟，从而调控卵泡的生长、成熟或者闭锁［5］。因此，颗粒细胞的增殖与凋亡对卵泡发育起重要作用，亦是卵泡发育不同阶段的标志。研究发现骨形态发生蛋白1（Bone morphogenetic protein 1，BMP1）基因是一类属于虾红素家族的金属蛋白酶［6］，具有分离原骨胶原C末端前肽，参与形成细胞外基质，诱导软骨和骨的生成，亦可通过分离键蛋白而参与早期胚胎发育及卵泡发生等功能［7］。BMP1基因在爪蟾、家鸡、小鼠和绵羊等动物的胚胎和卵泡发育过程中的表达模式已有相关报道［8-11］。并已阐明BMP1基因通过BMP1／chordin／BMPs的机制［12-13］，激活GDF8／GDF11［14-15］、TGF-β1［16］和IGF［17］等因子的分子机制发挥重要的生物学功能，表明BMP1基因在动物卵泡发生过程中具有重要的作用。此外，有研究结果证实，金属蛋白酶家族其他成员（如MMP-2、MMP-3、MMP-9［7，18-19］等因子）在卵泡胚胎发育过程中的表达规律，阐明MMP-1具有促进肺泡上皮细胞的增殖与迁移，并抑制其凋亡的功能［20］，MMP-8具有促进血管平滑肌细胞的增殖能力［21］。但BMP1基因在水牛卵泡发生中的功能研究却鲜有报道，开展对BMP1基因的研究将有助于人们从基因角度进一步阐明动物卵泡的形成和胚胎发育的机制，对医学和畜牧业等领域将产生积极的影响。而BMP1基因是否具有调控卵巢颗粒细胞的生长功能迄今还未见相关报道，因此，BMP1基因是否通过调控水牛颗粒细胞的增殖与凋亡从而参与水牛卵泡发育过程有待进一步深入研究证实。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用卵巢采自南宁市鲁班路屠宰场。

1.2 主要试剂

BMP1基因重组蛋白购自R＆D System公司（1927-Z-010），抗BMP1抗体购自Santa Cruz公司（SC-27324），Fas、Bax和Caspase-9的抗体和二抗均购自Proteintech公司（13098-1-AP，50599-1-Ig，10380-1-AP），β-actin抗体购自Cell siglaling公司（＃4967）。CCK-8试剂盒、Trizol试剂、DMEM试剂购自Life Technology公司，荧光定量SYBR Green Master Mix购自Roche公司，一步快速反转录试剂盒购自北京全式金生物公司。

1.3 方法

1.3.1 引物设计 根据NCBI数据库已知的牛和水牛各基因序列，利用Oligo6.0软件分别设计BMP1、细胞周期关键蛋白Cyclin D1和Cyclin D2，PCNA（增殖细胞核抗原）以及细胞凋亡信号通路相关因子的荧光定量引物及18S r RNA内参基因的引物，引物序列见表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2 水牛颗粒细胞的体外分离 从屠宰场收集水牛卵巢，30 min内送回实验室，用带有10号针头的注射器分别收集卵巢表面直径为2～6 mm卵泡的卵泡液，体视显微镜下拣出卵母细胞，将卵泡液收集于15 m L的离心管中，37℃静置5 min，抽取上清，1 200 r·min-1离心5 min，弃上清，加DMEM重悬沉淀，1 200 r·min-1离心3 min，取上清，在1 200 r·min-1离心5 min，收集细胞沉淀，用DMEM洗2～3遍，即为较纯净的水牛颗粒细胞。

1.3.3 水牛颗粒细胞的体外培养 收集好的水牛颗粒细胞按照适当的细胞浓度，在含有10%FBS（胎牛血清）的DMEM的基础培养基，分别于6 cm的培养皿中，接种细胞数为每孔106个；分别培养24、48、72和96 h，通过胰酶消化的方法收集细胞，进行总RNA的提取。BMP1重组蛋白和抗BMP1抗体添加试验：在基础培养基中分别添加0、5、15、2 5和50 ng·m L-1BMP1重组蛋白和0、5 0、1 0 0、200和400 ng·m L-1抗BMP1抗体，并培养于6 cm培养皿中，接种细胞数为每孔106个；分别于体外培养72 h后，收集细胞，用于总RNA或者总蛋白的提取。颗粒细胞增殖试验：采用96孔板进行培养，接种细胞数为每孔104个。并于培养后72 h左右，按照试剂盒说明书进行检测。颗粒细胞在37

℃、5%CO2的培养箱中培养，24 h后对培养的细胞进行清洗换液，之后继续培养至试验所需时间。

表1 qRT-PCR引物序列及相关条件Table 1 Primers for quantitative PCR

1.3.4 CCK-8检测水牛颗粒细胞的增殖 添加不同浓度BMP1重组蛋白或者抗BMP1抗体的颗粒细胞，于96孔培养板中培养72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续避光孵育1.5 h，在酶标仪中通过450 nm吸收波长测定吸光度。每组试验重复3次，每次试验设5个重复，利用SPSS软件进行统计分析，不同字母代表差异显著（P＜0.05）。

1.3.5 RNA的提取利用 Trizol法分别提取培养不同时间和添加不同浓度BMP1重组蛋白及抗BMP1抗体的水牛颗粒细胞总RNA。RNA提取后，通过分光光度计及电泳检测其纯度和完整性，并置于-80℃冰箱保存备用。按照一步快速反转录试剂盒（北京全式金生物公司）进行反转录反应，反转录体系20μL：2μg总RNA，5＊TransScript Allin-One Super Mix for qPCR 4μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free Water补足20μL，轻轻混匀，42℃孵育15 min，85℃灭活5 min，4℃终止。

1.3.6 qRT-PCR q RT-PCR的反应体系为20 μL：RT-PCR产物1μL，2×FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）10μL，Primer F／R（10 μmol·L-1）0.6μL，RNase Free water 8.4μL。反应条件：95℃变性10 min；95℃15 s，60℃（或者55℃）1 min，40个循环，试验对每个样品进行3次重复。用内参18S r RNA对其进行标准化，运用2-△△Ct方法计算目的基因的相对表达量，组间差异利用SPSS软件进行统计分析，不同字母代表差异显著（P＜0.05）。

1.3.7 Western blotting 收集添加不同浓度BMP1重组蛋白和抗BMP1抗体的水牛颗粒细胞，分别加入RIPA（RIPA加入量为细胞体积的10倍）裂解液裂解组织，（并添加PMSF蛋白酶抑制剂，终浓度为100μg·m L-1，防止蛋白降解）。在冰上裂解30 min后，12 000 r·min-1离心10 min，按体积比加入4×loading buffer，沸水煮沸变性10 min。将变性后的蛋白进行SDS-PAGE（10%分离胶）分离。电泳结束后，利用伯乐半干转印系统将蛋白转移至NC（硝酸纤维素膜）膜上，转膜结束后，用5%脱脂牛奶室温封闭45 min。TBST洗3遍后，每次10 min，各基因的抗体用一抗稀释液稀释后，4℃冰箱孵育过夜。第2天，用TBST彻底洗膜3次，每次10 min，孵育山羊抗兔IgG-HRP二抗室温孵育1 h，TBST彻底洗膜3次后，将NC膜放置在伯乐成像系统上，滴加ECL化学发光液，成像并用Imagelab分析试验结果。

2 结 果

2.1 BM P1基因在水牛颗粒细胞中体外培养不同时间的表达

为探讨BMP1基因在水牛颗粒细胞中的表达情况，通过qRT-PCR的方法检测BMP1基因在体外培养水牛颗粒细胞0、24、48、72和96 h的表达规律。结果显示（图1），以体外分离的颗粒细胞0 h为参照，BMP1基因随着颗粒细胞在体外培养时间的延长其相对表达量逐渐增高，且差异显著。体外培养达到96 h时，BMP1基因在颗粒细胞中的表达量最高。颗粒细胞培养24～48 h，BMP1基因相对表达量无显著差异，培养到48 h后，BMP1基因的表达开始显著升高，颗粒细胞培养72～96 h，BMP1基因相对表达量无显著差异。

图1 BMP1基因在体外培养颗粒细胞不同时间的表达Fig.1 The expression of BMP1 in the different time of granulosa cells cultured in vitro

2.2 BMP1基因对水牛颗粒细胞增殖的影响

在体外培养的颗粒细胞中添加不同浓度的BMP1重组蛋白和抗BMP1抗体，利用CCK-8试剂盒检测颗粒细胞的增殖情况。结果显示（图2），添加了BMP1重组蛋白的颗粒细胞的增殖特性显著增强，且25 ng·m L-1BMP1重组蛋白可以显著提高体外培养水牛颗粒细胞的增殖（图2A）；抗BMP1抗体添加试验结果表明，随着抗体浓度的升高，颗粒细胞的增殖特性显著下降，400 ng·m L-1抗BMP1抗体能够显著抑制颗粒细胞的增殖，随着抗BMP1抗体浓度的升高，其抑制效率逐渐增强，并具有明显的计量依赖性（图2B）。

图2 BMP1基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖特性的影响Fig.2 The Effect of BMP1 on the proliferation activity of buffalo granulosa cells

2.3 BMP1基因对颗粒细胞增殖的分子机制

BMP1可以显著促进体外培养水牛颗粒细胞的增殖，以18S为内参基因，应用qRT-PCR技术研究BMP1重组蛋白和抗BMP1抗体对细胞周期关键蛋白和增殖细胞核抗原表达的影响（图3）。结果显示，BMP1重组蛋白可以显著提高Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA在颗粒细胞中的表达，其中25 ng·m L-1BMP1重组蛋白与其他各组差异显著（图3A）；抗BMP1抗体添加试验结果表明，随着抗BMP1抗体浓度的升高，Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA的相对表达量显著下降，并且具有明显的计量依赖性，这3个基因在400 ng·m L-1抗BMP1抗体添加组中表达量最低（图3B）。

2.4 BMP1基因调控颗粒细胞凋亡的分子机制

以18S r RNA为内参基因，qRT-PCR检测BMP1基因对死亡受体途径、线粒体途径和内质网应激通路3种细胞凋亡途径的关键作用因子在颗粒细胞中mRNA水平的表达情况。结果显示（图4），BMP1重组蛋白添加组可以显著抑制死亡受体途径中Fas、FasL、TNFa、TNFR1基因，线粒体途径中Cytochrome C和Apaf 1基因，以及内质网应激途径中Chop基因的表达（图4A），抑制Caspase家族Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的表达，促凋亡因子Bax的表达亦受到抑制，BMP1重组蛋白可以显著提高抗凋亡因子Bcl-2的表达（图4C）。在抗BMP1抗体添加组，各促凋亡基因的相对表达量显著升高，抗凋亡因子Bcl-2的表达量显著下降（图4B和图4D）。Western blotting检测Fas、Bax和Caspase-9蛋白水平的表达情况，结果显示（图5），BMP1重组蛋白可以显著抑制Fas、Bax和Caspase-9蛋白表达（图5A），而抗BMP1抗体可以显著提高它们的表达（图5B），经过半定量分析（图5C和5D），这些基因在蛋白和m RNA表达趋势趋于一致。

图4 BMP1基因对凋亡信号通路相关因子的mRNA表达变化的影响Fig.4 BMP1 affect the genes expression at mRNA level associated with apoptosis signaling pathways

3 讨 论

颗粒细胞从卵原细胞的生长，到原始卵泡的启动、募集，初级卵泡和次级卵泡的形成，以及有腔卵泡的选择和优势化过程都发生了不同的形态和功能变化。研究表明BMP1基因在绵羊幼年和成年时期的卵巢中均有表达，并从初级卵泡～次级卵泡等不同阶段的卵泡发育过程中持续表达，且特异性地在颗粒细胞表达［11］，笔者前期的研究结果表明，BMP1基因显著的表达于水牛、猪和小鼠的颗粒细胞中（未发表）。利用颗粒细胞作为细胞模型研究BMP1基因在水牛卵泡发生中的功能是可行和可信的。本研究结果亦表明，BMP1基因在颗粒细胞中的表达随着体外培养时间的延长而逐渐增加，说明BMP1基因的表达随着颗粒细胞的增殖而逐渐增强。有研究表明通过CCK8检测MMP-1具有促进肺泡上皮细胞的增殖与迁移，并抑制其凋亡的功能［20］；MMP-8具有促进血管平滑肌细胞的增殖能力［21］。但目前对于BMP1基因能否促进细胞的增殖尚无报道，本研究证实添加BMP1重组蛋白可以显著提高体外培养颗粒细胞的增殖能力。

图5 BMP1基因对凋亡信号通路相关因子的蛋白表达变化的影响Fig.5 BMP1 affect the genes expression in protein level associated with apoptosis signaling pathways

有研究表明，细胞周期关键蛋白D（Cyclin D）在细胞G1期向S期过渡时具有重要作用［22］，Cyclin D 1的过度表达可以使细胞提前进入S期，从而缩短G1期进而缩短细胞周期［23］。Cyclin D 1和Cyclin D 2在小鼠处于增殖过程中的生殖母细胞中表达量较高［24］；在牛雌激素活跃的优势化卵泡中颗粒细胞Cyclin D 2的表达显著高于雌激素非活跃组的卵泡［25］，表明Cyclin D在卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖发挥重要作用。且在Cyclin D 2敲除的小鼠中发现颗粒细胞的增殖能力受损，且卵泡发育受阻，不再增大［26］。结合本研究结果显示，添加BMP1重组蛋白可以显著提高体外培养颗粒细胞的增殖能力，且能显著提高Cyclin D 1和Cyclin D 2的表达，说明BMP1基因具有促进颗粒细胞增殖的功能。此外，PCNA可以作为研究细胞增殖活性的一种标志物，研究表明PCNA在大鼠卵巢原始卵泡中的颗粒细胞和卵母细胞中均不表达［27］，但从初级卵泡开始，颗粒细胞和卵母细胞中均能观察到PCNA的表达，且随着卵泡的发育，其表达有逐渐增强的趋势。在牛和猪等卵巢中也得到了相似的结果［28］。PCNA的表达伴随着卵泡直径的逐渐增大，颗粒细胞的增殖而逐渐增加，本研究结果表明，BMP1基因能够促进PCNA的表达，再次揭示BMP1基因具有促进颗粒细胞增殖的能力。

Cyclin D也具有一定的抗凋亡功能［29］，在小鼠造血干细胞的生长过程中需要Cyclin D的表达，且Cyclin D通过抑制Fas和FasL的表达进而抑制造血干细胞的凋亡，敲除Cyclin D的细胞中Fas和Caspase-8的表达明显升高。特别是MMP也通过调控促凋亡和抗凋亡因子发挥凋亡作用，其中MMP-2［30］、MMP-3［31］、MMP-7［32］和MMP-9［33］等都具有抗凋亡的活性。也有研究表明，MMP-7和MMP-3的组织抑制剂（TIMP3）通过激活死亡受体Fas和TNF-R 1的表达，激活Caspase-8和Caspase-3进而诱导黑色素瘤细胞的凋亡［34］。但是关于BMP1基因参与调控细胞凋亡的机制还未见相关报道。本研究的结果表明，BMP1重组蛋白可以显著抑制促凋亡基因的表达，并显著抑制Caspase基因的表达，表明BMP1基因通过促进细胞增殖进而相对抑制细胞的凋亡。此外，通过BMP1基因对细胞凋亡信号通路相关因子的表达变化趋势来看，BMP1基因亦可能主要通过死亡受体途径来影响细胞的凋亡，这种机制可能与BMP1基因具有特殊的蛋白质结构域，亦或是一种分泌型的蛋白有关［35］。迄今未见相关研究表明MMP或BMP 1通过线粒体途径或者内质网途径参与调控细胞凋亡机制的报道，本研究证实了这两个细胞凋亡信号通路中关键基因的表达变化，说明BMP1基因有可能通过调控这些基因而参与抑制细胞的凋亡，但从各基因的表达趋势上，BMP1基因在这两个信号通路中并不发挥主要作用，且其明确的作用信号通路需要进一步研究证实。

本研究结果表明，BMP1基因可能具备某种生长因子的活性，能够促进体外培养水牛颗粒细胞的增殖并且能抑制其凋亡。表明BMP1基因在水牛卵泡发生过程中可能具有重要的功能，以及其对腔前卵泡、小腔卵泡体外成熟的影响，为原始卵泡库的充分开发利用提供理论依据，并对阐明调控卵泡选择优势化和排卵的分子机制，对系统开发利用大家畜卵泡奠定理论基础。但BMP1基因参与动物卵泡发生的分子机制还待进一步深入研究。

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