鸡囊胚细胞DMSO细管冷冻保存技术研究

王 坤，张佰忠，易康乐，朱立军，蒋 隽，燕海峰，3＊

（1.湖南省畜牧兽医研究所，长沙410131；2.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙410128；3.湖南天心黄鸡育种有限公司，长沙410143）

禽类种蛋产出时，受精卵已发育成为具有内外胚层，达40 000～60 000个细胞的X期囊胚［1］，该时期的细胞称为囊胚细胞（Blastodermal cells，BCs）。鸡BCs在禽类生物技术研究领域具有十分重要的作用：（1）BCs是潜在的鸡胚胎干细胞［2］；（2）BCs是禽类转基因技术研究中的主要靶细胞［3-5］；（3）BCs可在禽类种质资源保护利用研究领域中，通过解冻BCs制备嵌合体而重新获得活体［6-8］，解决无法冷冻保存禽类母系（W染色体）遗传资源的困境。K.Kino等［8］通过移植超低温冷冻的BCs能获得种系嵌合体，说明冷冻保存后的细胞具有很好的生命力。但在后续的研究中，对鸡干细胞的冷冻研究大多集中在原生殖细胞（PGCs），安静［9］、王丙云等［10］对鸡BCs的冷冻保存进行过研究，虽然都获得了不错的结果，但没有对于BCs冷冻保存中各种操作程序和影响因素进行研究。

本研究使用胚胎冷冻仪、细管冷冻以及二乙酰荧光素（Fluorescein diacetate，FDA）染色测定细胞活力（简称活力，Cell viability，CV）与体外培养24 h贴壁率（简称贴壁率，Cell adherent rate cultivated for 24 h，CAR）双重评价方法，对鸡BCs冷冻保存中，DMSO的浓度、冷冻及解冻速率进行研究，欲建立鸡BCs细管冷冻保存的有效方法，促进其在胚胎干细胞与遗传资源保存领域的应用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白来航鸡与黑凤鸡种蛋由湖南省畜牧兽医研究所提供。

96孔平底细胞培养板、0.25 m L细管均购自IMV公司。倒置荧光显微镜（CK40-RFL，Olympus）、离心机（TGL-16C，上海安亭科学仪器厂制造）。胚胎程序冷冻仪（NH78200-EN，AIR LIQUIDE-DMC）。DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）（Gibco公司），青霉素钠、链霉素（Biosharp公司），二乙酸荧光素（FDA）（TCI公司），丙酮、二甲基亚砜（DMSO）等试剂（VETEC公司）。

1.2 方法

1.2.1 鸡X期BCs的分离 种蛋储存于10～18℃，采用10 d内的种蛋。将蛋壳表面用70%酒精擦拭消毒，置于紫外线消毒过的蛋托上，转移到无菌室，水平朝上静置30 min左右。使用孔略大于胚盘的打孔器，制作滤纸环，灭菌。根据种蛋大小选取合适培养皿，种蛋保持静止时的方位不变，从底部小心敲破蛋壳，两手从底部破口处，往两侧迅速掰开，内容物快速落入培养皿中。使胚盘位于水平面上，用眼科剪将卵黄膜外胚盘上方的浓蛋清完全剪开，暴露干燥的卵黄膜，用尖嘴小镊子夹取滤纸环，孔正对胚胎，准确贴在卵黄膜上。沿纸环小心将卵黄膜剪开，用镊子夹住滤纸环边缘，从卵黄上分离后在盛有0.9%生理盐水的几个培养皿中轻轻摇动，依次漂洗，去除卵黄，直到胚盘从卵黄膜上脱离［11］。

1.2.2 鸡BCs体外培养 用剪去约3 mm的1 m L Tip吸取脱离的胚盘，转入含生长培养基的液滴中，分离到足够的胚盘（每次试验一般取16个左右胚）后，将胚转移到2 m L离心管中，添加1 m L生长培养基，用1 m L Tip与1 m L移液枪，每次吸入1 m L再完全排出，反复进行6下，制成密度约为8× 105m L-1的细胞悬液（按照每个胚50 000～60 000个细胞估算［1］），一部分用于冷冻备用，一部分调整密度为4×104m L-1后使用96孔板培养，作为对照细胞。每孔接种悬液200μL，在37℃5%CO2浓度与95%相对湿度的培养箱中培养。

1.2.3 冷冻 采用5种不同浓度DMSO（5℃保存）进行冷冻保护剂优化：1）5%DMSO＋30%FBS＋65%DMEM；2）10%DMSO＋30%FBS＋60% DMEM；3）15%DMSO＋30%FBS＋55%DMEM；4）20%DMSO＋30%FBS＋50%DMEM；5）25% DMSO＋30%FBS＋45%DMEM。优化其他参数时选用4）配方。

将细胞密度为8×105m L-1的BCs悬液，5℃预冷处理10 min，1∶1缓慢添加冷冻保护液，5℃平衡30 min，用经过预冷处理的0.25 m L的细管装管。通过胚胎程序冷冻仪实现3步冷冻：（1）打开程序冷冻仪，设定好程序并倒入液氮，在仪器降温至5℃时将细管放入程序冷冻仪，以-1℃·min-1的速率降温至-7℃，保持10 min。（2）继续以-1℃·min-1的速率降温，比较降温至-15、-35、-55、-75℃的效果（在优化其他参数时，选择-35℃）。（3）达到设定温度后，将细管直接投入液氮保存。

1.2.4 解冻 细管从液氮中取出后，对两种不同解冻速率进行优化：1）慢速解冻，立即投入到37℃水浴锅中，分别保持10 s、1 min、2 min、3 min后进行下一步操作（优化其它参数时使用1 min）；2）快速解冻，立即投入到50℃水浴锅中，分别保持5 s、20 s、40 s、1 min后进行下一步操作。

随着农村经济体制的改革，土地经营日益集中化、规模化，农民专业合作社、家庭农场等组织地膜使用量大，白色污染严重。应加强对合作社等组织的管理，根据农膜使用量，下达回收任务，并与其签订回收协议，采用收取保证金的方式，对于完成回收任务的退还保证金并给予资金奖励。对于没有完成回收任务的，则使用保证金组织第三方进行回收清理，倒逼新型经营主体开展废旧农膜污染防治工作。

解冻后的处理：将细管中的细胞悬液转入离心管中，缓慢添加10倍体积含10%FBS的生长培养基，用4 000 r·min-1离心5 min，去上清液，重复1次，计算活力后调整密度为4×104m L-1，按1.2.2方法培养。

1.2.5 活力与贴壁率检测 FDA细胞活力检测，将FDA加入到细胞液中，FDA终浓度为1μg·m L-1，37℃暗室染色3～5 min，取25μL制片后使用100～400倍的荧光显微镜（激发和发射波长分别为450～490和520 nm）观察并计算活力，发绿色荧光的是活细胞，不发光的是死细胞，计数需在10 min内完成。贴壁率检测，按步骤1.2.2将细胞培养24 h后，用倒置荧光显微镜对每一孔贴壁情况进行观察和评估，评估方法为贴壁细胞数占总细胞数百分比即贴壁率。

1.2.6 数据处理 采用SAS 9.2统计软件进行单因素方差分析和多重比较。

2 结 果

2.1 细胞镜检图

图1中，图1A为冷冻前BCs形态图，图1B为使用冷冻程序解冻后细胞形态图。图1C、D为FDA荧光染色结果，其中图1D是开了少量可见光的效果，可以同时辨别出死、活细胞。图1E～J为不同贴壁率细胞贴壁图。贴壁细胞聚集成集落并且与未贴壁细胞有明显界限，表现为块状或斑状。

2.2 不同DMSO浓度对鸡BCs冷冻保存的结果

由表1可知，1）在细胞活力上，未冷冻组与各冷冻组都有极显著差异（P＜0.01）；DMSO浓度为20%组活力最高，为0.58，与15%组差异不显著（P＞0.05），但与5%、10%和25%组差异极显著（P＜0.01）；10%组细胞活力最差，为0.18，与5%组差异不显著（P＞0.05）；15%组和25%组差异不显著（P＞0.05）。2）在贴壁率上，未冷冻组与各冷冻组差异极显著（P＜0.01）；其中20%组贴壁率最高，为30.5%，与15%组差异不显著（P＞0.05），与25%组差异显著（P＜0.05），与5%组和10%组差异极显著（P＜0.01），15%组和25%组差异不显著（P＞0.05）；5%组结果最差，贴壁率为0。

图1 细胞镜检图Fig.1 Cell microscopy

表1 不同DMSO浓度冷冻保存BCs的结果（n＝40）Table 1 The CV and CAR of BCs freezed by different DMSO concentrations

由图2可以看出，不同DMSO浓度，解冻后细胞活力和贴壁率的变化趋势基本相同，都是先升高后降低，在浓度为20%时达到最高值。同时也发现，浓度为5%时，细胞活力不为0，但培养24 h后贴壁率为0，说明该组细胞解冻后存活的也随后死亡或是无法贴壁。

2.3 鸡BCs不同冷冻速率处理结果

由表2可知，1）在活力上，未冷冻组与各冷冻组都有极显著差异（P＜0.01）；-75℃组解冻后细胞活力最高，为0.53，但与-35℃、-55℃组解冻后的细胞活力差异不显著（P＞0.05）；-15℃组解冻后的细胞活力最差，为0.03，且与各组之间差异都极显著（P＜0.01）。2）在贴壁率上，未冷冻组与各冷冻组差异极显著（P＜0.01）；不同冷冻速率各组间差异也极显著（P＜0.01），其中-35℃组贴壁率最高，为36.6%，-15℃组最差，没有细胞贴壁。

由图3可以看出，不同冷冻速率处理下，解冻后活力和贴壁率有不同的变化趋势。解冻后活力，在一定范围内，随着投入液氮时温度的降低，细胞活力有逐渐上升的趋势，-75℃组活力最高，-15℃组活力最低；从解冻后贴壁率看，在一定范围内，随着投入液氮时刻温度的降低，活力先升高后逐渐下降，-35℃组活力最高，-15℃组最低；同时也发现，-15℃组活力不为0，但贴壁率为0，-75℃组活力最高，但贴壁率很低。

表2 不同冷冻速率结果的比较（n＝40）Table 2 The CV and CAR of different freezing rate

图2 不同DMSO浓度冷冻结果折线图Fig.2 The line chart of CV and CAR at different DMSO concentration

图3 不同冷冻速率冷冻结果折线图Fig.3 The line chart of CV and CAR at different freezing rate

2.4 鸡BCs不同解冻速率处理结果

表3 37℃水浴不同时间解冻结果（n＝30）Table 3 The CV and CAR of different bath time in 37℃water

2.4.2 快速解冻 采用50℃水浴不同时间进行解冻，结果见表4：1）在活力上，未冷冻组与冷冻组不同解冻速率之间均差异极显著（P＜0.01）；水浴5 s效果最好，为0.70，与水浴20 s差异显著（P＜0.05），与水浴40 s、1 min差异极显著（P＜0.01）；水浴1 min效果最差，为0.41，与水浴40 s差异不显著（P＞0.05），与水浴20 s差异显著（P＜0.05）。2）在贴壁率上，未冷冻组与冷冻组各解冻速率间差异均极显著（P＜0.01）；不同解冻速率之间差异也极显著（P＜0.01）；其中水浴5 s效果最好，为36.9%，水浴1 min效果最差，为5.6%。

表4 50℃水浴不同时间解冻结果（n＝30）Table 4 The CV and CAR of different bath time in 50℃water

2.4.3 慢速与快速解冻的对比结果 由图4可以看出，解冻后活力，37℃水浴整体上优于50℃水浴，且变化趋势较平缓；50℃水浴活力整体上随水浴时间增加有下降趋势，且变化幅度相对较37℃更大，但50℃水浴5 s获得了最高活力。

由图5可以看出，37℃水浴解冻，贴壁率随着时间增加，先增加后下降，变化幅度较平缓，在整体上每一个速率都高于50℃水浴的结果，特别是在1～2 min时贴壁率最高；50℃水浴解冻，随着水浴时间增加，贴壁率不断下降，且下降幅度越来越大。

图4 不同解冻速率对活力影响折线图Fig.4 The line chart of CV thawed at different rate

图5 不同解冻速率解冻后贴壁率折线图Fig.5 The line chart of CAR thawed at different rate

3 讨 论

3.1 冷冻保护剂浓度对鸡BCs冷冻保存的影响

DMSO是一种渗透性细胞冷冻保护剂。它能在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤，同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。本研究表明，一定范围内，随着DMSO浓度增加，冷冻效果是先增加后降低，在20%时最高。这可能是由于低浓度的冷冻保护剂无法达到保护细胞受高浓度电解质损伤的要求，而DMSO具有毒性，因此浓度过大时，对细胞的毒性作用就会显现出来［12］。本研究使用浓度为20% DMSO作为冷冻保护剂，所得复苏率最高结果为70%，低于王丙云等［10］和李碧春等［13］复苏率最高为85.5%的结果，但接近K.Kino［8］的结果，可能是因为活力测定方法不同所致。

3.2 冷冻速率对鸡BCs冷冻保存的影响

本试验在国内首次使用胚胎程序冷冻仪对鸡BCs进行冷冻保存研究。对常规冷冻程序进行了改进，增加了细胞悬液预冷、-7℃平衡结晶两个步骤。细胞预冷可降低冷冻保护剂加入时产生热量对细胞的损伤，而且DMSO在常温下对细胞有较大的毒副作用，预冷则可以减少这种伤害。-7℃平衡结晶可以让细胞更好地度过“危险期”，减少冷冻损伤，这与韩威等［14］结论一致。冷冻过程中均以-1℃·min-1的速率降温［15］，对比降温至-15、-35、-55、-75℃时投入液氮保存的不同效果，发现在-15～-75℃随着温度的下降细胞活力逐渐增加，-75℃时最高，这与M.Naito等［16］在降温至-80℃投入液氮保存获得较高活力类似。但复苏后贴壁率却呈现出不同的结果，在-15～-75℃，其贴壁率是先增加后降低，最高结果出现在-35℃。细胞活力出现最高值的-75℃组，贴壁率却是4组中除了-15℃组（没有贴壁）以外最低的，可能是-75℃组，解冻后虽然活力高，但细胞已经损伤，只是这些损伤的表达较慢，而且可能投入液氮前温度越低，这种损伤越严重。在人类［17］和小鼠［18］胚胎冷冻上，也较多使用降温至-30或-35℃再投入液氮，可能该温度区域更适合胚胎的冷冻，对细胞造成的伤害较小。

3.3 解冻速率对鸡BCs冷冻保存的影响

解冻速率在一定程度上决定复苏细胞的存活力，解冻缓慢往往会导致细胞重结晶而死亡，而迅速升温则可以使其重结晶的晶体减少，还可以使细胞处在高浓度物质中的时间缩到最短，减少渗透性休克，恢复细胞的生理功能，从而降低细胞死亡率。解冻温度必须控制在一定范围内，若细胞悬浮液的温度过高，超过了细胞的耐受程度，就会造成细胞死亡。在解冻程序上，常规的方法是37℃水浴至融化［19］，但这种方法主观性强，不易重复。本研究通过固定水浴时间进行对比，使试验的重复性得到了保证。也发现虽然50℃水浴5 s细胞活力最高，但贴壁率最高则出现在37℃水浴1 min上，可能是细胞在某些温度范围内受到损伤表达较缓慢，这也再次说明细胞活力不能完全代表细胞生命力。50℃水浴5 s虽然活力上最好，但随着时间延长活力下降迅速，难以控制。37℃水浴解冻整体上无论是细胞活力还是贴壁率均高于50℃水浴结果，而且随水浴时间增加变化较小，1～3 min内均未出现较大差距，稳定性好，更适合试验中使用。

3.4 鸡BCs冷冻损伤评价方法

活力测定上，本研究室多次尝试台盼蓝染色法，但无论是自配的或是购买的染色剂，按文献报道的各种配比，都发现染色效果不佳，很难区分活细胞和死细胞，特别是在卵黄等杂质未去除干净时误差更大，而且计数时间短促，也不能显示出细胞的存活状态［20］。因此，本研究首次在鸡BCs上使用FDA荧光染色测定细胞活力，发现操作简单快捷，死活细胞对比明显，而且根据荧光的强弱还可以判断出细胞的活力高低［21］，但使用中要注意染色剂的浓度和染色时间，如果浓度太高则在视野中背景就会较亮，活细胞发出的绿色荧光就不明显，而且死细胞有时也会照亮。染色时间不够，则荧光物质积累不足，效果不佳，染色时间过长，则会导致活细胞的荧光衰减。试验中发现，在开少量可见光的情况下，可以同时看到发出绿色荧光的活细胞和不发光的死细胞，达到双染的效果，计算活力更加快捷准确。

本研究同时也使用了贴壁法来评估细胞的冷冻效果，因为依据细胞分化试验可知，鸡BCs在体外培养时，一部分细胞贴壁生长并最终分化为不同类型的细胞，还有一部分细胞则悬浮聚集分化，形成简单的类胚体［22］。所以通过BCs贴壁生长的难易程度，可以更加准确的判定其作为潜在胚胎干细胞的活力，而且在增殖和传代培养上，贴壁细胞都是最主要的对象，因此，冷冻复苏后能贴壁的细胞才能更有利于干细胞研究。试验发现冷冻复苏后的细胞贴壁时间较未冷冻细胞要晚一些，而且贴壁速率也较慢，大概在24 h以后贴壁速率才与新鲜细胞差不多，这与有关报道［14，23］类似。原因可能是，复苏后BCs细胞从冷冻时的休眠状态到体外培养恢复正常增殖能力需要一定时间。因此选择24 h作为观察时间点不仅可以获得较稳定的结果，而且结果相对明显。对比3组结果，采用活力与贴壁率两类指标评估，大体趋势是一致的，但在冷冻速率和50℃水浴解冻试验时出现不同结果，还有待进一步研究。由此，也可以发现，仅靠细胞活力评价细胞冷冻效果是不全面的，本实验室使用的贴壁法评价，将为新的细胞冷冻损伤评价标准开辟新思路。

4 结 论

鸡BCs使用DMSO浓度为20%的冷冻保护剂进行细管冷冻，以-1℃·min-1的速率降温至-7℃保持10 min，继续以同样速率降温至-35℃投入液氮保存，37℃水浴1～2 min解冻细胞，不仅可以获得较好的细胞活力，而且培养后可以获得较高的贴壁率。

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