胚胎干细胞显微注射对小鼠和猪胚胎发育影响的研究

董 晓，冯书堂，王红军*

(1.青岛农业大学生命科学学院，青岛 266109；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

胚胎干细胞显微注射对小鼠和猪胚胎发育影响的研究

董 晓1，冯书堂2*，王红军1*

(1.青岛农业大学生命科学学院，青岛 266109；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

旨在为小鼠和猪多能性干细胞嵌合体制作提供参考，探讨胚胎干细胞(Embryonic stem cells或Embryonic germ cells，ES/EG)显微注射及受体胚胎发育时期等对胚胎发育的影响。对小鼠ES细胞和猪EG细胞分别进行研究：(1)将小鼠ES细胞分别注入小鼠桑椹胚和囊胚，比较不同发育时期受体胚胎体外培养的发育率和孵化率，以及注射胚胎和未注射胚胎体外培养的发育率和孵化率。结果表明，显微注射后的桑椹胚体外培养发育率和孵化率分别为94.7%和70.2%，囊胚率分别为84.6%和80.8%，注射后桑椹胚体外培养发育率极显著高于囊胚(P<0.01)，但注射后囊胚体外培养孵化率极显著高于桑椹胚(P<0.01)；未注射胚胎(注射胚胎)的体外培养发育率和孵化率分别为96.6%(89.9%)和67.8%(75.2%)，未注射胚胎发育率极显著高于注射胚胎(P<0.01)，但注射胚胎孵化率极显著高于未注射胚胎(P<0.01)。(2)将猪EG细胞分别注入猪桑椹胚、早囊、囊胚及孵化囊胚，比较不同发育时期受体胚胎移植后妊娠率以及注射胚胎和未注射胚胎体外培养的孵化率，并对猪EG细胞显微注射针和固定针的规格进行了探讨。结果表明，显微注射的桑椹胚、早囊及囊胚移植后妊娠率为67%，而显微注射的孵化囊胚移植妊娠率为0，桑椹胚、早囊及囊胚移植后受体母猪妊娠率极显著高于孵化囊胚(P<0.01)，由桑椹胚、早囊及囊胚注射后移植获得了两头嵌合体仔猪；显微注射和未显微注射的猪胚胎其孵化率分别为47.54%和72.97%，未注射胚胎孵化率极显著高于注射胚胎(P<0.01)。确定猪EG嵌合体制作过程中，注射针外径约为30 μm，内径约为25 μm；固定针外直径约为130～150 μm，内径约为40 μm。嵌合体制作时，胚龄宜早不宜迟，桑椹胚显微注射更易操作，而且导入的时期较早，ES/EG细胞在嵌合体组织中可以有很高的贡献率，故选择桑椹胚进行注射。在本试验条件下，显微注射对小鼠胚胎发育影响不大，对猪胚胎影响较大，说明猪胚胎显微注射条件需要进一步优化。

胚胎干细胞；嵌合体；显微注射

自1981年首次建立胚胎干细胞以来[1-2]，胚胎干细胞(ES/EG)在现代生命科学及生物药物的生产方面起着越来越重要的作用。2006年，诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cell，iPS)建立成功，在干细胞、表观遗传学以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响，不仅是因为它在基础研究方面的重要性，而且为人们带来光明的应用前景[3]。将iPS/ES/EG细胞导入植入前胚胎制备嵌合体证明其多能性和研究细胞分化机制的有效手段[4]。嵌合体是指细胞来源于两个或两个以上不同胚胎的动物。嵌合体的制作是研究发育机理、基因表达机制、产生动物新品种和制作疾病模型的有效手段[5]。制作动物胚胎干细胞嵌合体常用的方法有两种，即卵裂球聚合法和显微注射法。卵裂球聚合法是将去除透明带的4-～8-细胞胚胎或桑椹胚与多能干细胞共培养使其聚合在一起生长，从而将多能干细胞导入受体胚胎的方法[6]。由于聚合法耗时较长，对培养条件要求较高，多数试验采用显微注射法制备嵌合体。显微注射法首先采用的是囊胚注射法，是把一种或多种胚胎的卵裂球、内细胞团细胞、畸胎瘤干细胞(Embryonic carcinoma cells，EC)、ES/EG细胞等供体细胞直接注射到另一枚囊胚的腔隙中获得嵌合体的方法[7-8]。桑椹胚注射法是把供体细胞注射到桑椹胚的透明带与胚胎细胞腔隙中，使供体细胞与胚胎细胞共同发育形成嵌合体[9]。显微注射法是制备iPS/ES/EG细胞嵌合体的经典方法，该方法成功率高，但是整个过程精细复杂，从iPS/ES/EG细胞培养、注射针/持胚针的制作、注射胚胎的收集、显微注射、注射胚胎移植、嵌合体鉴定等，涉及很多技术环节，影响因素很多，迄今尚缺乏影响因素的相关报道。本试验探讨了受体胚胎发育时期对ES/EG细胞注射后小鼠和猪胚胎发育的影响、显微注射对小鼠和猪胚胎发育的影响，以及猪EG细胞显微注射针的规格等，以期为小鼠和猪iPS/ES/EG细胞嵌合体的制作提供参考。

1 材料与方法

1.1 小鼠ES细胞显微注射

1.1.1 试验动物 8～10 周龄的雌性昆明白小鼠，腹腔注射PMSG10 IU·只-1，间隔48 h腹腔注射hCG10 IU·只-1，与昆明白公鼠合笼，次日晨检查阴道栓，见栓时按12 h计(试验所用昆明白小鼠购自青岛农业大学试验动物中心)。

1.1.2 注射针、固定针及移胚管的制备 参考冼美薇的报道[10]。注射针制作：将外径1.05 mm、内径0.8 mm的毛细玻璃管用拉针仪(Leitz，German)拉成细针，用煅烧仪断成平口，而后在磨针仪(Narishige，Japan)上磨出45°斜面，再在煅烧仪上吊尖。小鼠ES注射针外径约为20 μm，内径为12～15 μm。固定针制作：用酒精灯加热毛细玻璃管，拉出一段细管，断成平口，在火焰上灼烧端部，使其圆滑。固定针外径约为100～120 μm，内径为25 μm(20～30 μm)。移胚管：内径为130～138 μm，外径约200 μm。1.1.3 ES细胞的准备 ES细胞由北京大学生命科学学院胚胎干细胞中心馈赠。选择处于生长旺盛状态的ES细胞，按常规方法消化成单细胞悬液，接种至预先涂有0.1%明胶的培养皿中，置37 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养1.0～1.5 h，取出培养皿，可观察到饲养层细胞已经贴壁，而状态良好的ES细胞黏附在饲养层上，状态不好的ES细胞和细胞碎片漂浮在培养液中。小心地吸去培养液，再加入新鲜培养液，将ES细胞轻轻吹打下来，饲养层细胞则留在皿底。这样可得到去除了大部分饲养层细胞而且状态良好的ES细胞。收集含ES细胞的培养液，1 000 r·min-1离心10 min，用少量ES细胞培养液重新悬浮细胞备用。也可以将培养皿中的ES细胞团用细的拨针剥离下来，在0.25%Trypsin-0.04%EDTA液中消化，同时用吸管轻轻吹打，将ES集落外围离散下来的单细胞和小细胞团块迅速移入ES细胞培养液中。继续用吸管轻轻吹打离散剩余的团块，如此反复，直至将大的ES集落都离散为单细胞和约含10 个细胞的小团块为止，将分批离散下来的单细胞和小细胞团块移入ES培养液中，1 000 r·min-1离心10 min收集ES细胞，用少量ES细胞培养液重新悬浮细胞备用[10]。

1.1.4 受体小鼠胚胎的收集和培养 分别在妊娠2.5、3.5 d处死小鼠，取出子宫，用PBS+5%胎牛血清(Fetal calf serum，FCS)冲洗、收集桑椹胚和囊胚，用于ES细胞注射的受体胚胎。

1.1.5 显微注射操作 取1滴PBS+10%FCS液在载玻片的注射小室中，用石蜡油覆盖制成注射小滴；待注射胚胎在含5 μg·mL-1细胞松弛素B(Cytochalasin B，CB)的PBS+10%FCS胚胎培养液中处理5～10 min，用移胚管吸取6～8枚胚胎移入注射小滴中，用固定针吸附固定待注射胚胎，用注射针吸取5～10 个ES细胞或ES细胞小团块，注射入胚胎透明带或囊胚腔中。

1.1.6 体外培养 注射后的胚胎在PBS液中清洗3遍，而后移入PBS+10%FCS培养液，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，观察胚胎发育情况，记录第4.5天的发育胚胎数和第5.5天的孵化胚胎数。未经CB和注射处理的胚胎发育情况作为对照。

1.2 猪EG细胞显微注射

1.2.1 固定针、注射针、移胚管的制备 固定针、注射针、移胚管的制备方法同1.1.2，只是猪试验用的固定针、注射针、移胚管内径要粗点。

1.2.2 试验动物 五指山猪胎儿来自自然发情或经超数排卵处理的性成熟母猪。超数排卵方法为肌肉注射PMSG1 000 IU·头--1，隔72 h后肌肉注射hCG500 IU·头--1，hCG注射24 h后进行第1次配种，第2天进行复配，配种的第1天记为0 d；注射受体胚来自大白猪(公猪)×长枫白猪(母猪)；长枫白猪或长枫黑猪作为注射胚胎移植受体(所有试验用猪来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所)。

1.2.3 猪PGC采集与培养传代 原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGC)来自妊娠26～27 d的五指山猪胎儿生殖嵴。猪胎儿生殖嵴用PBS液冲洗数次，然后将其放在表面皿中用注射器的后柄充分研磨碎，加入新鲜PGC/EG培养液(DMEM+10%FCS)，将研磨碎的组织移入离心管中，用吸管充分吹打，静置10 min，吸取上清液离心，用适量PGC/EG培养液重新悬浮含有PGC的沉淀，接种于预先铺有STO饲养层的培养皿中，在38 ℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。隔天换液，逐天观察细胞生长状况，约4 d 细胞集落长出，7 d 左右即可用0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化液进行常规消化传代，直至获得EG细胞系[11]。

1.2.4 受体猪胚胎的获取 长枫白猪发情周期的第16～17天，肌肉注射PMSG 1 000 IU·头--1，72 h后注射HCG 500 IU·头-1促排卵，次日发情的母猪用大白公猪配种，配种的第1天记为0 d。嵌合体制作时，分别在第5天(多为囊胚、早囊，少量为桑椹胚)和第6 天(此时大部分为孵化囊胚)手术法收集胚胎，用于EG细胞注射的受体胚胎。

1.2.5 注射用细胞的准备 分别利用五指山小型猪新鲜PGC和第1～6代的EG细胞进行显微注射。其中EG细胞的准备方法同1.1.3。

1.2.6 胚胎注射程序 欲注射胚胎在含5 μg·mL-1CB的PBS+10%FCS液中处理5～10 min。每个猪胚胎注射5～10 个EG细胞或EG细胞小团块，将注射完的胚胎移入PBS+10%FCS培养液中，在38 ℃，饱和湿度，5%CO2条件下培养1～3 h，使胚胎恢复。

1.2.7 体外培养 收集5 d猪胚胎(多为早囊和囊胚)注射EG细胞，胚胎在PBS液中清洗3遍移入PBS+10%FCS培养液中，置于38 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，观察胚胎发育情况，记录第6 天的孵化胚胎数。未经CB和注射处理的胚胎发育情况作为对照。

1.2.8 胚胎移植 选取发情时间比受体胚胎供体猪滞后1～2 d的长枫白或长枫黑母猪做注射胚胎受体猪。将注射了EG细胞的胚胎手术法移入受体母猪子宫。移植后需注意观察受体母猪身体状况及是否返情。

1.3 统计分析

数据采用t检验进行差异显著性分析，P<0.01，表示差异极显著。

2 结 果

2.1 小鼠ES细胞显微注射

本试验共收集168 枚小鼠胚胎，用于比较受体胚胎不同发育时期对注射ES细胞后小鼠胚胎体外发育的影响及显微注射对胚胎体外发育的影响。注射前鼠胚胎、刚刚注射后鼠胚胎以及注射鼠胚胎体外培养后形态变化见图1～3。经显微注射的桑椹胚体外培养发育率和孵化率分别为94.7%(54/57)和70.2%(40/57)。囊胚(注射时多数为早期囊胚)体外培养发育率和孵化率分别为84.6%(44/52)和80.8%(42/52)。注射后桑椹胚体外培养发育率极显著高于囊胚(P<0.01)，但注射后囊胚体外培养孵化率极显著高于桑椹胚(P<0.01)(表1)。未经注射直接培养的胚胎(胚胎培养液为PBS+10%FCS)发育率为96.6%，孵化率为67.8%，注射ES的胚胎(注射前胚胎在PBS+10%FCS+5 μg·mL-1CB中处理5～10 min，胚胎培养液为PBS+10%FCS)发育率为89.9%，孵化率为75.2%。未注射胚胎发育率极显著高于注射胚胎(P<0.01)，但注射胚胎孵化率极显著高于未注射胚胎(P<0.01)(表2)。

2.2 猪EG细胞显微注射

猪EG注射针外径约为30 μm，内径约为25 μm；固定针外径约为130～150 μm，内径约为40 μm；移胚管内径为250 μm。

图1 注射前鼠胚胎 200× Fig.1 Mouse embryos before microinjection 200×

图2 刚注射后鼠胚胎 100×Fig.2 Mouse embryos just after ES microinjection 100×

图3 注射后鼠胚胎体外培养后孵化(4.5 d) 200×Fig.3 Hatched mouse embryos after ES cell microinjection and in vitro culture(4.5 d) 200×

收集312 枚胚胎进行15 次猪EG显微注射及胚胎移植试验。为了保证受体母猪能够妊娠，需移入足够量的胚胎，采用每次每头受体猪移植20多个胚胎，其中含约一半数目的未注射胚胎以促进妊娠。结果只有1头猪妊娠期满产下8头仔猪，其中两头证明为嵌合体[11]。选用了两种胚胎用于EG细胞注射，一种是桑椹胚、早囊及囊胚，一种是孵化囊胚。桑椹胚、早囊及囊胚注射后移植妊娠率为67%(4/6)，而孵化囊胚注射后移植妊娠率为0(0/5)，差异极显著(P<0.01)。结果表明，孵化囊胚不适宜注射制作嵌合体。表3为两类胚胎注射后移植结果比较。图4是猪囊胚的显微注射，图5是刚注射后猪胚胎状态。收集98 枚5 d猪胚胎(多为早囊和囊胚)，用于比较显微注射EG对猪胚胎体外发育的影响。从表4可以看出，显微注射EG和未经显微注射的猪胚胎其孵化率分别为47.54%和72.97%，未注射胚胎孵化率极显著高于注射胚胎(P<0.01)。

3 讨 论

囊胚注射法是制备多能性干细胞嵌合体的经典方法，但在猪的嵌合体制作中，发现猪的囊胚滋养层与透明带变得较软，易发生粘针、堵针情况，增加了操作难度。桑椹胚注射法仅需刺破透明带即可将多能性干细胞导入胚胎内部，与囊胚注射相比技术难度较低。由于导入的时期较早，多能干细胞在嵌合体的各种组织中有更高的贡献率。本研究小鼠胚胎注射的结果表明，注射后桑椹胚体外培养发育率极显著高于囊胚(P<0.01)，但注射后囊胚体外培养孵化率极显著高于桑椹胚(P<0.01)。

陈伟胜等[12]发现，导入的受体胚胎越早，形成嵌合体的嵌合程度越高，但嵌合体的获得率低，原因是在小鼠桑椹胚显微注射过程中，注射针有时对胚胎结构破坏比较大。在本试验中，也发现注射胚胎的早期死亡多为注射时破坏较大所致，而破坏程度较小的则未对胚胎发育构成影响，一方面胚胎早期生存能力较强，另一方面本试验用了细胞松弛素B(CB)起了很大作用，目前尚未见到用CB对胚胎处理制作胚胎干细胞嵌合体的报道，细胞松弛素作为细胞骨架松弛剂可以减弱细胞骨架基础的坚固性[13]，考虑到CB可以使细胞骨架松弛，降低注射对胚胎的危害作用，并且还有激活作用，增强胚胎的生存发育能力，所以尝试使用处理注射胚胎，结果表明，未注射胚胎发育率极显著高于注射胚胎(P<0.01)，但注射胚胎孵化率极显著高于未注射胚胎(P<0.01)。对照组未注射胚胎未经CB处理，表明其在体外培养发育时未表现出明显的发育优势，在孵化率方面甚至低于注射胚，用CB对胚胎处理5～10 min，对体外培养获得的较高孵化率起了很大的作用，有关CB对嵌合体制作的影响还需要进一步的研究。

表1 桑椹胚和囊胚注射ES细胞后体外发育情况

Table 1Invitrodevelopment of embryos after ES cell injection at morulae or blastocysts stages

胚期Embryonicstage胚胎数Embryonumber注射ES细胞数InjectedEScellnumber发育胚数Developedembryonumber孵化胚数Hatchedembryonumber发育率/%Developmentalrate孵化率/%Hatchabilityrate桑椹胚Morula575～10544094．7A70．2B囊胚Blastocyst525～10444284．6B80．8A

同列数据后标有不同大写字母者表示组间差异极显著(P<0.01)，下同

Different capital letters(A&B) in the same column indicate significant difference between groups(P<0.01).The same as below

表2 显微注射ES细胞对小鼠胚胎体外发育的影响

Table 2Invitrohatchability rates of ES cell-microinjected embryosand non-injected controls in mice

胚胎数Embryonumber注射ES细胞数InjectedEScellnumber发育胚数Developedembryonumber孵化胚数Hatchedembryonumber发育率/%Developmentalrate孵化率/%Hatchabilityrate1095～10988289．9B75．2A590574096．6A67．8B

表3 桑椹胚、早囊及囊胚与孵化囊胚注射EG细胞后移植结果

Table 3 Developmental abilities of pig embryos derived from EG cells injected into morulae，early blastocysts，blastocysts or hatched blastocysts

组别Group胚胎数EmbryoNo．受体猪数No．ofrecipient移植胚胎数/头Transplantedperrecipient妊娠数No．ofpregnant分娩数No．ofdelivered妊娠率/%Pregnancyrate分娩率/%Deliveryrate桑椹胚、早囊及囊胚M，EB，B1866314167A17A孵化囊胚HB126525000B0B

M.桑椹胚；EB.早囊；B.囊胚；HB.孵化囊胚

M.Morula;EB.Early blastocyst;B.Blastocyst;HB.Hatched blastocyst

表4 显微注射EG细胞对猪胚胎体外发育的影响

Table 4Invitrohatchability rates of EG cell-microinjected embryosand non-injected controls

胚胎数Embryonumber注射EG细胞数InjectedEGcellnumber孵化数Hatchedembryonumber孵化率/%Hatchabilityrate615～102947．54B3702772．97A

图4 猪囊胚的显微注射 100×Fig.4 Microinjection of pig blastocyst 100×

图5 刚注射后猪胚胎 100×Fig.5 Pig embryos right after EG cell microinjection 100×

猪在异种器官移植等方面有巨大潜在价值，随着iPS/ES/EG细胞介导转基因途径的建立及基因定点敲除技术的不断发展，猪的iPS/ES/EG细胞培养和嵌合体制作等研究一直是近年科研热点。迄今国际上仅有4 个团队获得了猪EG细胞嵌合体[9，11，14-16]，只有L.R.Chen等[17]获得了猪ES嵌合体，后来有报道获得了iPS嵌合猪和种系嵌合体猪[18-19]，但在猪iPS/ES/EG细胞嵌合体制作影响因素方面探讨很少。显微注射操作技术性比较强。本研究在小鼠显微注射针和固定针制作方法和规格上主要参考文献[10，20]中固定针、注射针的制作方法。在猪的嵌合体制作方面，只有S.Mueller等[16]提到注射时采用的固定针内径为130～140 μm，注射针内径为20 μm[16]。猪的囊胚直径约为150 μm，最终将固定针外径定为130～150 μm，内径定为40 μm；猪EG细胞的直径为5～15 μm，但由于猪EG细胞黏性较强，增大了吸取EG细胞的难度，所以将注射针的直径定为25 μm。

导入胚胎干细胞数目也会影响到嵌合胚发育，导入细胞数太少则嵌合率低，过多则易导致发育异常，在孕中期被吸收。小鼠的ES嵌合体制作，一般注射5～10 个[12]或者10～15 个ES细胞既可有较高正常发育率又可有较高的嵌合体形成率[8]。前期试验结果证明，注射量在5～10 个ES细胞比较合适[21]。在猪的EG嵌合体制作中，EG细胞注射量10～30 个[9，14]、PGC注射量5～15 个[15-16]均有报道，本试验在小鼠试验的基础上，每个注射小团块约含5～10 个EG细胞。本试验也曾采用新鲜猪PGC、培养24 h的猪PGC用于注射，但未获得嵌合体。而获得嵌合体的EG细胞注射时已培养到第6代，这些EG细胞生长状态良好，说明EG细胞状态对嵌合体发育影响也很大。

在本试验中，分别注射两种不同发育阶段的猪胚胎，结果表明在桑椹胚、早期囊胚及囊胚这一阶段时，注射后移植受体母猪妊娠率较高，而在孵化囊胚阶段注射后移植妊娠率很低。所获嵌合体猪就来自桑椹胚、早囊及囊胚注射胚胎。在这一阶段，EG细胞可在胚胎发育中有更大的贡献[11]。本研究在猪的试验过程中采用的是和小鼠胚胎注射时相同的条件，都是用CB预处理10 min，但是却没有收到在小鼠试验中的效果，因为猪胚胎体外培养要求条件更高，还需要进一步探索。

4 结 论

本研究确定了猪EG嵌合体制作过程中，注射针外径约为30 μm，内径约为25 μm；固定针外径约为130～150 μm，内径约为40 μm。嵌合体制作时胚龄宜早不宜迟，桑椹胚显微注射更易操作，而且导入的时期越早，ES/EG细胞在嵌合体组织中会有更高的贡献率，所以可以选择桑椹胚进行注射。在本试验条件下，显微注射对小鼠胚胎发育影响不大，但是对猪胚胎影响较大，猪胚胎显微注射条件需要进一步优化。

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(编辑 程金华)

Analysis of Factors Influencing Embryonic Development after Mouse or Pig Embryonic Stem Cells or Embryonic Germ(ES/EG) Mircoinjection

DONG Xiao1，FENG Shu-tang2*，WANG Hong-jun1*

(1.CollegeofLifeScience，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China； 2.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China)

The goal of this study was to assess how different microinjection conditions influence chimeras production after ES/EG cells injection into embryos in mouse and pig.Mouse ES cells were micrioinjected into embryos at morula or blastocyst stages.Hatching rate and blastocyst rate after cell injections were measuredinvitro.Non-injected embryos were used as controls.In mouse，embryos showed significant higher developmental rate when ES cells were injected into morulae compared to those injected into blastocysts(P<0.01).In contrast，cells injected into blastocysts had higher hatchability than those injected into morulae(P<0.01).Compared to non-injected controls，ES cell injected embryos had higher hatchability but lower developmental rate afterinvitroculture(P<0.01).We further assessed porcine embryonic development after EG cells microinjection into morulae，early blastocysts，blastocysts，or hatched blastocysts，and we also investigated the optimal injecting/ holding pipette sizes for pig EG cell microinjection.Our data showed that pregnancy rates of EG cells microinjected into morulae，early blastocysts，or blastocysts，were significant higher than those injected into the hatched blastocysts(P<0.01).The hatched rate was significantly lower in microinjected embryos compared to non-injected controls(P<0.01).Two chimeric piglets were obtained after embryo transfer.In addition，we found that the optimal inner and outside diameters for pigs EG microinjection were 25 and 30 μm for the injecting pipette，and 40 μm and 130-150 μm for the holding pipette，respectively.Upon comparison of different conditions，we determined optimal injecting/holding pipette sizes for pig EG cell injection.Furthermore，ES/EG cells microinjection into morulae could achieve higher contribution rate in chimera.Microinjection had lower impact on mouse embryonic development compared to pig，suggesting that pig embryonic microinjection condition has to be further optimized.

embryonic stem cells；chimera；microinjection

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.011

2015-02-11

山东省“泰山学者海外特聘专家”启动经费(6631111314)；山东省自然基金2014年面上项目(ZR2014CM011)

董 晓(1969-)，女，山东人，副教授，博士，主要从事干细胞与干细胞治疗研究，E-mail：1163155358@qq.com

*通信作者：王红军，教授，E-mail：hjwang11@hotmail.com；冯书堂，研究员，E-mail：fst508@sina.com

Q28

A

0366-6964(2015)10-1784-07