甘肃省猪香港病毒的巢式PCR检测及VP1基因序列的系统发育分析

黄晓锋，潘阳阳，许 芳，曾巧英

(甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070)

甘肃省猪香港病毒的巢式PCR检测及VP1基因序列的系统发育分析

黄晓锋，潘阳阳，许 芳，曾巧英*

(甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070)

猪香港病毒(PHoV)于2008年在我国香港首次发现，属细小病毒新成员。本研究自甘肃省兰州、张掖、天水市养猪场和屠宰场采集血液样品147份，针对PHoV的VP1基因保守区(GenBank No.EU200677)设计2对引物，用巢式PCR(nPCR)检测PHoV。结果，甘肃省生猪PHoV总阳性率为38.10%(56/147)。其中，12周龄以上猪的阳性率(55.56%)显著高于6周龄以下猪(25.00%)(P<0.05)；三地区间的阳性率差异不显著(P>0.05)。从56份阳性样本中挑选具地域代表性的12份，对VP1扩增片段测序(GenBank注册号：JQ177084～JQ177095)，并和GenBank中的所有VP1序列一起进行系统发育分析。结果表明，12个VP1片段序列之间的相似性为95.2%～99.0%。其中，JQ177093、JQ177085和JQ177089构成一个独立的分支；其余9株和来自GenBank的12株参考序列均处于另一分支。9株中，JQ177095、JQ177087和JQ177091构成一个亚分支，紧邻罗马尼亚野猪株(JF738366)；JQ177086、JQ177090和JQ177094构成第二个亚分支，紧邻香港株HK3；JQ177088、JQ177092和JQ177084构成第三个亚分支，紧邻香港株HK5。12株PHoV的VP1基因片段序列与香港株HK1～HK6的总体相似性为96.7%～99.7%，与罗马尼亚野猪株为95.2%～99.0%。本研究结果表明，源于罗马尼亚野猪株和香港株的PHoV均在甘肃省猪群中高水平流行。

猪香港病毒；巢式PCR；基因序列；系统发育分析

猪香港病毒(porcine Hokovirus，PHoV)于2008年在我国香港首次发现[1]，是近年来几个新发现的细小病毒之一，其基因组全长与其他细小病毒接近，约为5 kb，含有2个ORF。其中，ORF1编码非结构蛋白NS1，ORF2编码结构蛋白VP1/VP2[2-3]。至目前，PHoV仅在德国、美国、喀麦隆、罗马尼亚家猪和野猪群中被检出[4-10]。该病毒感染后在淋巴结、血清、肝、脾、鼻拭子和粪便中均能够检测到PHoV[1，4-5，8-9]。我国东部地区和北京地区检出该病毒的阳性率为11%～70%[8-10]，甘肃省地处中国西北，有无该病毒的流行尚未见报道。为此，本研究选择甘肃省从东至西三个地理位置有代表性的城市，从养猪场表观健康仔猪群和生猪屠宰点采集血液样品，用巢式PCR(nested PCR，nPCR)扩增该病毒的VP1序列，并进行系统发育分析，旨在澄清甘肃省有无PHoV的流行，并且基于VP1基因序列分析其流行的PHoV和世界范围内已报道PHoV之间的分子演化关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

5×MyTaq Red Buffer、MyTaq DNA Polymerase均购自德国Bioline GmbH公司；病毒DNA提取试剂盒OMEGA DNA Mini Kit购自美国OMEGA公司；PCR产物胶回收纯化试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit购自德国QIAGEN公司；PMD18-T vector、T4 DNA ligase、competentE.coliDH5α cells 均购自TaKaRa公司。

1.2 样品采集

2012.3-2012.8，从甘肃省三个地区(兰州、张掖、天水)养猪场(0～6周龄仔猪)和生猪屠宰点(12周龄以上猪)采集健康猪血样147份，其中兰州54份(L1～L54)，张掖51份(Z1～Z51)，天水42份(T1～T42)，共计84份仔猪血样，63份屠宰猪血样，均置于-20 ℃保存备用。

1.3 针对PHoV的VP1序列设计nPCR引物

据PHoV HK7(GenBank No.：EU200677) 基因序列，在NS1和VP1保守区设计2对nPCR引物，分别用于第一轮和第二轮PCR扩增[9-10](表1)。

1.4 样品的nPCR检测

DNA模板制备：血样经DNA提取试剂盒(OMEGA)提取纯化，调整浓度后置-20 ℃备用。

两轮PCR采用相同的反应体系：5×MyTaq Red Buffer 10 μL；上下游引物各0.5 μL(25pmol·μL-1)；MyTaq DNA Polymerase 1 U；DNA模板1 μL；ddH2O补足至50 μL。其中第一轮的模板为血样提取DNA，第二轮的模板为第一轮PCR扩增产物的 10倍稀释液。设PHoV上海株[9]为阳性对照，纯水为阴性对照。

表1 针对PHoVVP1序列的nPCR引物

Table 1 Primers targeting PHoVVP1 gene sequence for nPCR

阶段Phase引物序列(5′⁃3′)Primersequences(5′⁃3′)退火温度/℃TemperaturePCR产物/bpPCRproduct参考序列Referencesequence第一轮PCRFirstroundPCRF：TTGGAGGTACCGGCAGAR：TCATCGTACCGTTCATCG57995EU200677(NS1/VP1区)(NS1/VP1region)第二轮PCRSecondroundPCRF：GCAGTCTGCGCTTAACTTR：CTGCTTCATCCACTGGTC58391EU200677(VP1区)(VP1region)

反应条件：第一轮为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增35个循环；然后72 ℃延伸10 min。第二轮为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，扩增35个循环；然后72 ℃延伸10 min。取第二轮PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测并于凝胶成像系统下观察。统计检测结果，并用t检验法进行统计学分析。

1.5 nPCR扩增所得VP1基因片段的纯化回收与测序

分别从3地区两个年龄组各选2个nPCR检测阳性样本，共12个样本，经QIAquick胶回收试剂盒纯化扩增的VP1片段，连接至PMD18-T载体，转化E.coliDH5α感受态细胞，送上海生工公司测序。

1.6 基于VP1基因片段序列的系统发育分析

对12个测序的VP1片段序列，经BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)序列分析后，和GenBank中的参考序列一并用CLUSTAL W DNAMAN 6.0(version 1.4) 进行多序列比对和系统发育分析，用MEGA 4软件采用邻近归并法评估不同系统发育组的可靠性。

2 结 果

2.1 临床检样的PHoV检测结果

经nPCR扩增，第一轮PCR扩增目的片段为995 bp(图1A)，第二轮扩增目的片段为391 bp(图1B)，符合预期大小。图示为部分检样，其余检样图片略。147份猪血样中，第一轮PCR扩增后，62份检样出现995 bp条带，第二轮PCR后，仅有56份样品出现391 bp条带，总阳性数计为56。总阳性率为38.10%；12周龄以上猪的总阳性率(55.56%)显著高于6周龄以下猪(25.00%)，各地区亦如此(P<0.05)；三地区的阳性率之间差异不显著(兰州40.74%；张掖37.25%；天水35.71%)(P>0.05)(表2)。

A.第一轮PCR扩增得995 bp片段；B.第二轮PCR扩增得391 bp片段；M.DL2000 DNA相对分子质量标准；P.PHoV阳性对照；T1～L6.检样；N.阴性对照A. 995 bp fragment amplified by the first round PCR; B. 391 bp fragment amplified by the second round PCR；M.DL2000 DNA marker；P.HoV positive control; T1-L6. Samples; N. Negative control图1 PHoV VP1序列的nPCR扩增结果Fig.1 Amplification results of VP1 sequences from PHoVs by nPCR

2.2 基于VP1基因片段序列的系统发育分析

测序后，将12个VP1片段序列在GenBank中注册(JQ177084～JQ177095)。与GenBank中已有的12个PHoVsVP1序列一起进行系统发育分析。本研究获得的12个VP1序列，相互间的相似性为95.2%～99.0%。其中，JQ177093、JQ177085和JQ177089构成一个独立的分支；其余9株和来自GenBank的12株参考序列均处于另一分支。9株中，JQ177095、JQ177087和JQ177091构成一个亚分支，紧邻罗马尼亚野猪株(JF738367/EU-ROPHoV-WB)；JQ177086、JQ177090和JQ177094构成另一个亚分支，紧邻香港株EU200673/HK3；JQ177088、JQ177092和JQ177084构成第三个亚分支，紧邻香港株EU200675/HK5(图2)。本研究检测所得12个VP1核苷酸序列与香港株HK1～HK6的总体相似性为96.7%～99.7%，与罗马尼亚野猪株相似性为95.2%～99.0%。

表2 甘肃省3个地区不同年龄猪PHoVs的nPCR检测阳性率

Table 2 Prevalence of PHoVs in domestic pigs of different ages in 3 cities of Gansu province detected by nPCR assay

地区Location年龄/周Age(weeks)样品数量NumberPHoV阳性数(阳性率/%)PHoVpositivenumber(positiverate)PHoV总阳性数(阳性率/%)PHoVpositivenumber(positiverate)兰州Lanzhou≤6>1231238(25．81)14(60．87∗)22/54(40．74)张掖Zhangye≤6>1226256(23．08)13(52．00∗)19/51(37．25)天水Tianshui≤6>1227157(25．93)8(53．33∗)15/42(35．71)总数Total≤6>12846321(25．00)35(55．56∗)56/147(38．10)

*.P<0.05

图2 PHoV VP1基因片段序列的系统发育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of VP1 gene sequences from PHoVs

3 讨 论

PHoV是细小病毒科的新成员，2008年首次发现于我国香港的猪群，故名猪香港病毒，曾经是细小病毒科香港病毒属的唯一成员[1-3]，因为该病毒和人细小病毒4型及羊细小病毒4型遗传关系亲密，据此国际病毒分类委员会(ICTV)将此三种病毒归为一个新的属，即4型细小病毒属(Tetraparvovirus)[2-3]。本病毒仅在中国[香港(44.4%)及大陆]、美国(22.2%)、德国(32.7%)、喀麦隆(47%)和罗马尼亚(50.54%)有报道[2-7，9]。

本研究在甘肃省自0～6周龄和12周龄以上健康猪群采集血样，经nPCR检测，PHoV总阳性率为38.10%(56/147)。关于阳性率计算，据nPCR的设计原理，其第二轮PCR是以第一轮产物为模板，目的是提高特异性和灵敏性：若第一轮PCR出现非特异条带，经第二轮引物的差异可剔除，提高特异性；若第一轮PCR产物浓度低于电泳的检出阈值，经第二轮可放大信号，提高灵敏性。故理论上只需以第二轮扩增结果计为最终阳性数。据此，本研究计第二轮扩增的56份阳性为最终阳性数。图1显示，本研究第一轮扩增后未出现大小异常的条带，在第二轮扩增后，多数检样(T1、T3、Z4、L1、L5、L6)信号显著增强，说明设计nPCR方法还是必要的；但有些检样(如L2)的两轮信号相当，更不寻常的是L3和Z3，第二轮扩增后条带消失，和预期恰好相反；二轮信号的持平和消失，提示在二轮引物区出现了显著的突变或缺失，导致引物的退火效率下降(L2)甚至根本不能结合(L3和Z3)。国外检出的PHoV相似性高达98%～99%[1，4-5]，编码非结构蛋白NS1的OFR1区(155—2 065 nt)为基因高变区，而编码VP1和VP2的ORF2 (2 214—4 991 nt)保守[5]，本研究的第二轮引物正是基于此研究结论，靶标VP1序列(2 588—2 978 nt)而设计，但据L3和Z3的结果可推断VP1基因区也并非保守，而是同样可高变。另，国内2 125—2 129 nt位缺失株[10]的发现证明，ORF1-ORF2间隔区也可高变。上述证据均提示，相比国外分离株，国内流行的PHoV，基因演化更活跃。理论上分析，本研究L3和Z3仅有的第一轮995 bp条带，应该是PHoV特异的阳性条带，因为非特异条带的大小如此吻合的概率甚小。为证实此推论及确认第二轮没有产物的确切原因，有待全基因测序与分析。若据此推论，以两轮PCR的阳性总数计为最终总阳性数，则总阳性率为42.2%(62/147)，仍略低于我国东部地区(46.5%)[9]和北京(51.3%)[8]。

PHoV的阳性率在健康猪群和发病猪群之间未发现显著差异[1，4-5，8]，故本研究自健康猪群采集血样检测的PHoV阳性率具有客观代表性。但关于具体的阳性率数据，不同的样品(肝、脾、肺、血液、粪便)之间可能也会存在差异。和本病毒属于同一个属的羊4型细小病毒的检测中，肝(66.7%)的检出率表观上略低于脾(71.4%)[11]。然而表观数据的小差异并不影响研究的意义和结论。本研究的最大意义在于，证实了甘肃省存在猪香港病毒，且在猪群中高水平流行，阳性率可达38.10%。

至目前，PHoV只存在一个基因型，并没有和地域相关的基因型出现。但据本研究VP1基因片段的序列演化分析，12个VP1序列相互间的相似性为95.2%～99.0%，且在进化树中已经呈现2个独立的分支，相比世界范围内PHoV的相似性为98%～99%[1，4，5]，遗传距离显著增加，提示甘肃省流行的PHoV正在朝不同的方向演化。其中，JQ177093、JQ177085和JQ177089构成一个独立的分支，和另一分支相似性仅95.2%，提示VP1序列已经出现新的演化方向；其余9株和来自GenBank的12个参考序列均处于另一分支，与罗马尼亚野猪株序列(JF738366)和香港家猪HK1～HK3序列亲缘关密切程度不等，是演化较慢的病毒群，但也证明甘肃省同时存在源于罗马尼亚野猪株和香港家猪株的PHoV。

本研究基于VP1片段序列的分析结论和我国东部地区PHoVs 的全基因序列分析结论(95.4%～99.3%)[9]高度吻合，一致提示，我国流行的PHoVs 普遍比国外的演化速度要快。

因为PHoV是一个新病毒，很多生物学特性及致病性等均不明确。已有的证据表明，通常和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及猪圆环病毒2型(PCV2)混合感染，阳性率可高达47%[1，8]，但究竟在致病性中发挥多大作用，发挥何种作用均有待研究。肝、脾、淋巴结、血液、鼻腔、肠道等多组织脏器中均能够检测到该病毒[1-9]，提示该病毒没有明确的组织嗜性，系全身性感染。检出率随猪的周龄而升高，包括血样[4-5，9]，提示：一，如果该病毒对幼龄猪最易感或对各周龄猪的易感性相当，则该病毒自幼龄感染后能够持续存在于全身组织及血液，即同时具有持续性感染和持续性病毒血症的特性；二，反之，如果该病毒不具持续性感染和持续性病毒血症的特性，那么，该病毒对猪的易感性随周龄的增加而增加。

4 结 论

首次在甘肃省检测到猪香港病毒(PHoV)的高水平流行(56/147，38.10%)，12周龄以上成年猪的阳性率(55.56%)显著高于6周龄以下仔猪(25.00%)(P<0.05)。基于VP1基因片段序列的系统进化分析表明，源于罗马尼亚野猪株(JF738366)和香港家猪株(HK1～HK6)的PHoV均在甘肃省流行。

[1] LAU S K，WOO P C，TSE H，et al.Identification of novel porcine and bovine parvoviruses closely related to human parvovirus 4[J].JGenVirol，2008，89(Pt 8)：1840-1848.

[2] KNOWLES N J，HOVI T，HYYPIA T，et al.Family Parvoviridae[M]// Virus Taxonomy 9th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.London：Academic Press，2011：405-425.

[3] COTMORE S F，AGBANDJE-MCKENNA M，CHIORINI J A，et al.The familyParvoviridae[J].ArchVirol，2014，159(5)：1239-1247.

[4] ADLHOCH C，KAISER M，ELLERBROK H，et al.High prevalence of porcine Hokovirus in German wild boar populations[J].VirolJ，2010，7：171.

[6] XIAO C T，GIMÉNEZ-LIROLA L G，HALBUR P G， et al.Increasing porcine PARV4 prevalence with pig age in the U.S.pig population[J].VetMicrobiol， 2012，160(3-4)：290-296.

[7] ADLHOCH C，KAISER M，KINGSLEY M T，et al. Porcine hokovirus in domestic pigs，Cameroon[J].EmergInfectDis，2013，19(12)：2060-2062.

[8] LI S，WEI Y，LIU J，et al.Prevalence of porcine hokovirus and its co-infection with porcine circovirus 2 in China[J].ArchVirol，2013，158(9)：1987-1991.

[9] PAN Y，ZENG Q，ZHU C，et al.Frequency and characterization of porcine hokovirus(PHoV) in domestic pigs in eastern China[J].ArchVirol，2012，157(9)：1785-1788.

[10] LI B，MA J，XIAO S，et al.Genome sequence of a highly prevalent porcine partetravirus in Mainland China[J].JVirol，2012，86(3)：1899.

[11] TSE H，TSOI H W，TENG J L，et al. Discovery and genomic characterization of a novel ovine partetravirus and a new genotype of bovine partetravirus [J].PLoSOne， 2011，6(9)：e25619.

(编辑 白永平)

Detection of Porcine Hokovirus (PHoV) by Nested-PCR in Domestic Pigs in Gansu Province and Phylogenetic Analysis Based onVP1 Gene Sequences

HUANG Xiao-feng，PAN Yang-yang，XU Fang，ZENG Qiao-ying*

(CollegeofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

Porcine Hokovirus(PHoV) is a new parvovirus of pigs which was recently discovered in Hong Kong，China in 2008.In present study，a total of 147 blood samples were collected from pig farms and slaughter houses in Lanzhou，Zhangye and Tianshui city，Gansu province.Two pairs of primers were designed based onVP1 regions of PHoV genome(GenBank accession No.EU200677).One hundred and forty seven samples were detected by nested PCR(nPCR) assay for PHoV.The nPCR showed an overall prevalence of PHoV as high as 38.10%(56/147).Of which，>12-week-old pigs showed a significantly higher positive rate(55.56% ) than <6-week-old piglets(25.00%) (P<0.05)，while there was no significant differences among three cities (P>0.05).Out of the 56 positives，12 were selected in terms of geographical distribution for sequencing(GenBank accession No.：JQ177084-JQ177095).Phylogenetic analysis together with 11 referenceVP1 sequences of PHoV from GenBank revealed a homology of 95.2%-99.0% among the present 12VP1 sequences.Of which，JQ177093，JQ177085 and JQ177089 formed a separate branch in the phylogenetic tree，and other 9 together with 12 reference sequences from GenBank formed the second branch.Of the later 9，JQ177095，JQ177087 and JQ177091 formed a sub-branch closely related to JF738366 from wild boar in Romania，whereas JQ177086，JQ177090 and JQ177094 formed another sub-branch just next to HK3 from Hong-kong pigs，and the third sub-branch of JQ177088，JQ177092 and JQ177084 closely related to HK5.The present 12 PHoV-VP1 sequences shared a homogeneity of 95.2%-99.0% with Romania wild boar isolate (JF738366)，and 96.7%-99.7% with Hong Kong-originated HK1-HK6.The present findings confirmed a high prevalence of PHoVs both evolved from Romania wild boar isolate and Hong Kong pig isolates in Gansu province.

porcine Hokovirus(PHoV)；nested PCR(nPCR)；gene sequence；phylogenetic analysis

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.014

2015-02-10

国家自然科学基金项目(30960284)；甘肃农业大学伏羲杰出人才项目

黄晓峰(1985-)，男，甘肃临洮人，硕士生，主要从事兽医微生物与免疫学研究，E-mail：panyangyang_2007@126.com

*通信作者：曾巧英(1968-)，女，博士，教授，主要从事动物疫病的分子致病机制及免疫防制研究，E-mail：zengqy@gsau.edu.cn，Tel：0931-7631783

S852.659.2

A

0366-6964(2015)10-1816-06