我国东、西方蜜蜂中七种病毒感染状况的调查

丁桂玲，石 巍

（中国农业科学院蜜蜂研究所农业部授粉昆虫生物学重点开放实验室，北京100093）

蜜蜂是重要的授粉昆虫，全球约35%的粮食生产作物都依赖于传粉动物［1］，其中大约90%的商业授粉服务都由西方蜜蜂（Apis mellifera）完成。但多种病毒及病原体的侵扰，严重阻碍了蜜蜂群体的健康发展［2］。蜜蜂病毒病分布很广，目前已发现的病毒超过18种［3-4］，其中感染蜂群较为频繁的包括：残翅病毒（deformed wing virus，DWV）、黑色王台病毒（black queen cell virus，BQCV）、囊状幼虫病病毒（sac brood virus，SBV）、慢性麻痹病病毒（chronic bee paralysis virus，CBPV）、急性麻痹病病毒（acute bee paralysis virus，ABPV）、以色列急性麻痹病病毒（Israeli acute paralysis virus，IAPV）以及克什米尔蜜蜂病毒（Kashmir bee virus，KBV）。

DWV在世界范围内广泛流行，通常在大蜂螨（Varroa destructor）寄生蜂群之前作为隐性感染存在，可造成蜜蜂的翅膀畸形，工蜂、雄蜂寿命缩短［5］。在西方蜜蜂中，BQCV与微孢子虫的感染密切相关［6］，但东方蜜蜂（Apis cerana）感染BQCV的报道很少。SBV主要感染蜜蜂的幼虫，常常对东方蜜蜂造成很大危害。1972年，囊状幼虫病在我国广东省暴发，2008年在辽宁省流行［7］。近几年SBV在我国北京等地发病较重，2009—2010年间部分地区的东方蜜蜂发病率达100%［8］，给蜂群带来严重损失。CBPV主要影响成年蜂，受CBPV感染的蜜蜂会表现出腹部颤抖、无毛、黑化等特征，营养缺乏以及不良的天气条件都可能促进该病毒的暴发［4，9］。ABPV、KBV及IAPV亲缘关系较近，同属于二顺反子病毒科，在西方蜜蜂中普遍存在［10］，2012年在中国的东方蜜蜂中检测到IAPV［11］。

中国已有三千多年的养蜂历史，主要的本土蜜蜂资源为东方蜜蜂。19世纪末西方蜜蜂引入中国并很快成为当家蜂种，分布于全国各地，而我国原有东方蜜蜂的分布范围逐渐缩小，主要饲养在山区。目前，中国共有饲养蜂群820万群，其中三分之二为西方蜜蜂。东、西方蜜蜂是我国的两大主要饲养蜂种，追花夺蜜、转地放蜂的饲养方式使得两蜂种间的接触十分密切，同地饲养更是为疾病在不同蜂种间的传播创造了条件。西方蜜蜂是多种病毒的感染对象，近年来在国际范围内得到较多关注［12-13］，对东方蜜蜂的病毒感染研究相对较少，主要集中于SBV［14-15］。对中国蜂群中蜜蜂病毒病的流行学调查研究近几年刚刚开始，得到了一些不太一致的结果［11，16-17］，而关于我国主要饲养的蜂种东、西方蜜蜂病毒感染差异的报道更少。2012—2013年，作者从全国8省市37个蜂场收集东、西方蜜蜂共158群，进行7种常见病毒的检测，分析两个主要饲养蜂种之间的病毒感染差异情况，以期为我国蜜蜂的病毒发生特点以及蜜蜂资源的保护利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2012—2013年从我国8个省市37个蜂场收集样品，其中包括23个西方蜜蜂蜂场及14个东方蜜蜂蜂场，样品采集地分为西方蜜蜂与东方蜜蜂混养区、西方蜜蜂单独饲养区以及东方蜜蜂单独饲养区3种类型。每个蜂群收集100只左右的工蜂，放于饲喂盒中带回实验室，-80℃保存备用。样品信息见表1。

1.2 主要试剂和仪器

RNA提取袋购于瑞士Bioreba AG公司，RNA提取试剂盒RNeasy Plant Mini Kit购自QIAGEN公司，荧光定量PCR试剂盒iScriptTMOne-Step RT-PCR Kit with SYBR®Green购自Bio-Rad公司。QIAGEN的QiaCube核酸纯化仪，Nanodrop公司的ND-1000紫外分光光度计，Bio-Rad的iQ5TM荧光定量PCR仪。试验所用引物均由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列参考B.Locke等的报道［18］。

表1 东方蜜蜂及西方蜜蜂样品来源Table 1 Source of Apis cerana and Apis mellifera

1.3 样品总RNA提取

从每群各取32只工蜂，放入提取袋中，间隔浸入液氮中用研磨棒磨碎，加入5 m L超纯水，混合均匀后吸取100μL液体加入到350μL的RLT buffer中，使用RNeasy Plant Mini Kit试剂盒中相关试剂及QiaCube提取RNA。提取的RNA溶于60μL RNase-free水中，使用Nanodrop ND-1000检测RNA的质量及浓度，-80℃保存备用。

1.4 RT-PCR检测样品中病毒

使用染病样品提取的RNA以及相关引物进行RT-PCR扩增相应的病毒片段，PCR产物经纯化后与p GEM-T Easy Vector（Promega）连接，转化到大肠杆菌JM109中，培养阳性克隆并提取质粒，纯化后-20℃保存，作为阳性对照备用。一步法RTPCR使用20μL反应体系：10μL 2×SYBR®Green RT-PCR Reaction Mix，正反向引物各0.4μL（10 μmol·L-1），0.3μL iScript Reverse Transcriptase，2μL RNA模板。每次RT-PCR反应都包含一个以质粒标准品为模板的阳性对照及一个以水为模板的阴性对照。反应条件：50℃10 min；95℃5 min；95℃10 s、58℃30 s，40个循环。同时收集熔解曲线（95℃1 min；55℃1 min；55℃升到95℃，80个循环，每个循环升高0.5℃），进行扩增产物的特异性确定。

2 结 果

2.1 不同蜂种的病毒感染情况

在东方蜜蜂及西方蜜蜂中，均检测到6种病毒：DWV、BQCV、SBV、CBPV、ABPV及IAPV，均未检出KBV。其中BQCV（感染率分别为100%及97.2%）为最流行的病毒，其次为DWV（78.0%与76.9%）。与东方蜜蜂相比，SBV对西方蜜蜂的感染明显较多（P＜0.01）。CBPV、ABPV及IAPV对两种蜜蜂的感染率均较低，分别为6.0%、4.0%、10.0%和9.3%、6.5%、27.8%（表2）。

表2 6种病毒在东方蜜蜂及西方蜜蜂中的感染率Table 2 Infection rate of six viruses in Apis cerana and Apis mellifera %

2.2 不同地区蜜蜂的病毒感染情况

由图1可以看出，对于东、西方两个蜂种，除了DWV在新疆西方蜜蜂中的感染率（44.4%）稍低之外，DWV及BQCV在8个取样省市都普遍存在，特别是BQCV，感染率均超过66.7%。东方蜜蜂的4个取样地：SBV在海南、福建和辽宁检测到，感染率均低于31.6%；CBPV只在福建和辽宁发现，感染率分别为11.1%与10.5%；ABPV只在广东样品中检测到，感染率为22.2%；IAPV在海南和辽宁检测到阳性样品，在海南的感染率（30.8%）高于辽宁（5.3%）。4个取样省份中，在广东检测到3种病毒，海南及福建检测到4种，而在辽宁则检测到5种病毒。西方蜜蜂的7个取样省市：DWV、BQCV以及SBV在7个取样地均有发现，但SBV在福建的感染率（11.1%）极显著低于其他地点（P＜0.01）；CBPV在北京、辽宁和福建均检出阳性样品；ABPV只在新疆检测到，感染率为25.9%；除福建之外，IAPV在其他6个取样地均检出，在海南的感染率（61.5%）显著高于其他各地（P＜0.05）。7个取样省市中，在新疆、北京和辽宁均检测到5种病毒，而在山西、山东、海南和福建则检出4种病毒。

图1 不同样品采集地蜜蜂中6种病毒的感染率Fig.1 Infection rate of six viruses in different sample collection locations

2.3 不同类型饲养区蜜蜂的病毒感染情况

由表3看出，在西方蜜蜂饲养区检测到6种病毒，东、西方蜜蜂混养区检测到5种病毒，而在东方蜜蜂饲养区只检测到3种病毒。DWV与BQCV是3种类型饲养区中最为流行的两种病毒。SBV在西方蜜蜂饲养区的感染率为83.9%，而在东方蜜蜂饲养区未检测到阳性样品。在东、西方蜜蜂混养区未检测到ABPV，检测到的5种病毒中，DWV与BQCV在两个蜂种中的感染率相差不大，SBV、CBPV及IAPV在东方蜜蜂中的感染率均低于西方蜜蜂，其中SBV与IAPV感染率差异显著（P＜0.05）。在东方蜜蜂饲养区只检测到3种病毒：DWV、BQCV及ABPV，与DWV和BQCV相比，ABPV的感染率较低，为22.2%。

表3 不同类型饲养区蜜蜂中6种病毒的感染率Table 3 Infection rate of six viruses in different beekeeping areas %

2.4 病毒的混合感染情况

如图2所示，在东、西方两种蜜蜂中都普遍存在多种病毒的混合感染现象。在西方蜜蜂中，只有一个蜂群未检测到任何病毒，DWV或BQCV单个病毒感染的样品只占1.9%和3.7%，其余样品均被两种或多种病毒混合感染，其中受DWV、BQCV与 SBV三种病毒或DWV、BQCV、SBV及IAPV四种病毒共同感染的样品较多，占到样品总数的34.3%和15.7%。在东方蜜蜂中，BQCV单个病毒感染的样品占10.0%，受DWV与BQCV两个病毒共同感染的样品较多（52%），其余样品均受两种、三种或四种病毒混合感染。

图2 西方蜜蜂和东方蜜蜂的病毒混合感染情况Fig 2 Multiple-viruses infection in Apis mellifera and Apis cerana

3 讨 论

关于蜜蜂群病毒的流行情况，国内外对西方蜜蜂的研究较多，其中DWV与BQCV是感染西方蜜蜂的主要病毒［19-20］。对韩国的东方蜜蜂检测后发现，BQCV的感染率最高，其次为SBV，而DWV、KBV及CBPV的感染率较低［21］。之前对中国蜜蜂进行的病毒学流行情况调查结果并不一致，J.L.LI等在东方蜜蜂中只检测到ABPV、CBPV、BQCV、DWV、KBV及SBV六种病毒中的DWV与BQCV［16］；而H.X.AI等对中国的西方蜜蜂和东方蜜蜂进行病毒检测时发现DWV是西方蜜蜂最为流行的病毒，其次为BQCV、SBV、IAPV、CBPV、ABPV，东方蜜蜂的情况有所不同，SBV是其感染率最高的病毒，其次为DWV，而IAPV、CBPV与BQCV的感染率稍低［11］。B.YANG等在调查中国东、西方蜜蜂病原菌的发生情况时检测到BQCV、CBPV、DWV、IAPV及SBV五种病毒，其中DWV是最为流行的病毒（90%）［17］。与之前的结果一致，本研究未发现感染KBV的样品，不同的是，本试验在东、西方蜜蜂中均检测到6种病毒：DWV、BQCV、SBV、CBPV、ABPV及IAPV，BQCV是两蜂种中最为流行的病毒（感染率为100.0%与97.2%），其次为DWV、SBV、IAPV、CBPV与ABPV。上述研究结果的差异可能与样品数量、样品分布区域以及检测方法的不同有关。研究显示大、小蜂螨均可作为DWV载体，而西方蜜蜂经常被大、小蜂螨寄生危害，所以可推测西方蜜蜂感染DWV的可能性更大，虽然本研究显示DWV对东、西方蜜蜂的感染率无明显差异（78.0%与76.9%），但很可能受感染的西方蜜蜂中DWV的病毒量更高。

不同地区蜜蜂的病毒感染结果显示，6种病毒在不同取样地的分布不同，同种病毒在不同地区的发生率也不同。J.L.LI等研究中国的东方蜜蜂时发现，在19个取样地中，在6个省份检测到BQCV，而DWV只在3个省份检测到，DWV在福建的感染率高达92%，而在四川的感染率只有33%，BQCV在甘肃的感染率为98%，而在河南的发生率则低至12%［16］。而本研究结果显示，DWV对东方蜜蜂的感染率均高于63.2%，BQCV在各地的感染率为100%，这种感染率的差异应该与取样地及感染率计算方法相关，J.L.LI等的感染率是基于蜜蜂个体计算［16］的，而本试验中的感染率是以蜂群为单位进行的。各取样地区检测到的病毒种类与病毒数量有所差别，暗示着转地放蜂以及不同地区间的蜂种交换会促进蜜蜂病毒的传播，使其对蜜蜂的感染更加普遍。

病毒在不同类型饲养区蜜蜂中的分布显示，东方蜜蜂单独饲养区感染的病毒种类（3种病毒）少于东、西方蜜蜂混养区（5种病毒）及西方蜜蜂饲养区（6种病毒），说明东、西方蜜蜂混养可能促进病毒从西方蜜蜂传向东方蜜蜂，但本研究从东方蜜蜂饲养区收集的样品较少，应进一步扩大样品数量，验证此结果。在东、西方蜜蜂混养区，两种蜜蜂对同种病毒的感染率不同，暗示病毒与寄主之间的互作关系可能存在差异。本研究结果显示，西方蜜蜂感染SBV的比例明显高于东方蜜蜂（74.1%与22.0%），即使在重发病区辽宁，东、西方蜜蜂近距离饲养，但SBV在西方蜜蜂中的发生率（63.5%）仍然高于东方蜜蜂（26.8%），但在实际养蜂业中SBV对东方蜜蜂的危害远远大于西方蜜蜂，验证了不同寄主的SBV具有种间屏障、没有交叉感染性的结论［22-23］。为了更好地监测和预防SBV，对两种寄主的SBV的分子生物学特性、相关性和进化关系尚需要进一步研究。IAPV、ABPV与KBV的亲缘关系较近，在西方蜜蜂中分布较为普遍，2009年X.YAN等报道在中国西方蜜蜂中检测到IAPV［24］，2012年H.X.AI等在中国东方蜜蜂中发现IAPV［11］，本研究在西方蜜蜂饲养区及东、西方蜜蜂混养区均发现IAPV，而东方蜜蜂饲养区未检测到此病毒，说明IAPV有可能由西方蜜蜂传向东方蜜蜂。已有研究发现，ABPV可感染西方蜜蜂和熊蜂，并有人推测ABPV的原始寄主可能是西方蜜蜂，虽然目前尚未在其他国家的东方蜜蜂中发现ABPV，但本研究在东、西方蜜蜂单独饲养区均检测到该病毒，所以关于ABPV的原始寄主还需要进一步的验证。KBV已经在克什米尔、印度、韩国的东方蜜蜂以及多个国家的西方蜜蜂中检测到，但目前为止尚未在中国发现。

研究结果显示，病毒的混合感染普遍存在于东、西方蜜蜂中，这与之前H.X.AI等对中国蜜蜂［11］以及Y.KOJIMA等［22］对日本蜜蜂的研究结果一致，他们都发现西方蜜蜂有高达4种病毒、东方蜜蜂有高达3种病毒混合感染。而本试验在西方蜜蜂中检测到5种病毒、在东方蜜蜂中检测到4种病毒混合感染的存在，与之前的研究结果相比，混合感染的病毒数量更多，并且受多种病毒同时感染的样品比例更高，说明我国蜜蜂病毒病的感染较为严重。

4 结 论

利用RT-PCR对2012—2013年从我国8个省市37个蜂场收集的东、西方蜜蜂进行7种病毒的检测，发现两个蜂种均被6种病毒感染，其中BQCV为最流行的病毒，其次为DWV。6种病毒在不同采样地的分布及感染水平不同，不同类型饲养区蜜蜂的病毒感染也存在差异，但普遍存在多种病毒的混合感染。

致谢 对瑞典农业科学大学Eva Forsgren博士在试验过程中提供的技术指导以及广东省昆虫研究所罗岳雄、张学锋，辽宁省畜牧兽医局张大利、袁春颖，北京市门头沟雁翅镇蜂场

付兴万在样品采集过程中提供的帮助一并表示感谢。

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