检测胸膜肺炎放线杆菌7型抗体的竞争ELISA方法的建立与应用

李树清，陈志飞，张 强，吴建祥，刘雨潇，王巧全，林颖峥，宋 青，唐智芳，陆承平

(1.上海出入境检验检疫局，上海 200135；2.浙江大学，杭州 310058； 3.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；4.南京农业大学，南京 210095)

检测胸膜肺炎放线杆菌7型抗体的竞争ELISA方法的建立与应用

李树清1，陈志飞1，张 强1，吴建祥2，刘雨潇3，王巧全1，林颖峥1，宋 青1，唐智芳1，陆承平4*

(1.上海出入境检验检疫局，上海 200135；2.浙江大学，杭州 310058； 3.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；4.南京农业大学，南京 210095)

针对猪传染性胸膜肺炎(App)最主要的流行血清型7型，建立该型特异的抗体检测方法，并应用于出入境检疫。使用App 7型参考菌株制备单克隆抗体，基于辣根过氧化物酶标记的单抗，建立检测App 7型抗体的竞争ELISA方法，用于检测出入境临床采集及免疫接种的猪血清样品，并与商品化进口试剂盒进行比较。结果显示制备的单抗为IgM，与App 7型参考菌株之外的其他14个血清型以及27株其他相关菌株均无交叉反应。建立的竞争ELISA方法只能检测App 7型抗体，特异性好。用该方法检测App 7型参考菌株免疫猪的血清，免疫后14 d可检出抗体，35 d抗体滴度达峰值，并维持此滴度至143 d。使用建立的竞争ELISA检测免疫猪及临床血清样品260份，结果与法国IDvet试剂盒检测符合率为97.2%，与加拿大Biovet试剂盒检测符合率为97.9%～98.2%。建立的竞争ELISA方法可以应用于App 7型抗体的检测。

胸膜肺炎放线杆菌7型；抗体检测；竞争ELISA

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，App)引起猪的一种呼吸道传染病，具有高度传染性。该病最急性或急性型发病率和死亡率都在50%以上，慢性型可导致猪生长缓慢，成为僵猪。该病是集约化猪场常见猪病之一，是我国进口种猪检疫的猪病之一。我国曾多次从美国、丹麦、英国等进口种猪中检出猪传染性胸膜肺炎。

根据胸膜肺炎放线杆菌可溶性抗原荚膜多糖CPS和脂多糖LPS抗原性的差异，可将其分为15个血清型[1]，所有型都可能致病，但有显著差异。血清学抗体检测是最重要的诊断方法之一。由于App在各个国家分布的血清型不同，且各型之间没有完全的交叉保护，因此，准确诊断感染血清型是预防和控制该病的基础。App血清7型(S7)是重要的致病性血清型，我国从美国、加拿大进口种猪都要求检疫此血清型，同时也是我国的流行型。根据吉林大学雷连成等从我国长春分离的App菌株毒力测定，血清7型对小鼠的致死率达66.5%[2]。

由于App各型之间抗原的相似性，部分型之间有交叉反应，如4与7，3、6与8，1、9与11型之间均有交叉反应。目前还没有只检测App S7抗体的商品化试剂。为准确鉴定App S7抗体，作者使用App S7参考菌株制备单克隆抗体，基于纯化的腹水单抗，研制了竞争ELISA检测App S7抗体的方法及试剂，可以准确检测App S7型抗体。同时，应用于免疫猪及出入境临床样品的检测，并与目前主要的两种进口商品化试剂盒进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶标记的抗鼠抗体及四甲基联苯胺(TMB)均为Sigma产品；对-硝基苯磷酸盐(PNPP)购于生工生物工程(上海)股份有限公司；单抗亚型检测试剂盒(荷兰HyCult Biotechnology产品)，IDvet检测App4/7型试剂盒及检测App1～12型试剂盒(法国IDvet公司产品)；Biovet检测 App4/5/7型试剂盒(加拿大Biovet公司产品)；蛋白保护剂、稳定剂购于上海西宝生物技术有限公司。

1.1.2 菌株 试验中用于检测单抗特异性的App1～15型参考菌株及其他27株相关菌株来源见表1。

1.1.3 对照血清 试验中用于检测竞争ELISA特异性的血清由上海出入境检验检疫局制备或收集保存。包括App猪阴性对照血清，App 1～12型猪高免血清，猪乙型脑炎、猪蓝耳病、猪伪狂犬、猪戊型肝炎、猪布氏杆菌病、猪O型口蹄疫、猪副猪嗜血杆菌病、猪支原体病、猪弓形虫病阳性血清，App 4型、7型兔高免血清以及林氏放线杆菌兔高免血清。

1.1.4 免疫猪不同时期的血清 免疫猪不同时期血清由上海交通大学农业与生物学院制备。使用App S7参考菌株免疫两头猪(1号，2号)，免疫前用IDvet试剂盒检测App1～12型血清抗体，以及李树清等[3]建立的核酸检测方法检测鼻拭子，抗体和核酸均为阴性。免疫前及免疫后至56 d，每周采血一次，以后第134和143天采血。

1.1.5 临床血清样品 2009年至2014年采自丹麦、加拿大、美国进口猪，上海供港猪及上海检验检疫局保存的临床样品260份，详见表2。

1.2 方法

1.2.1 单抗的制备及特异性检测 巧克力培养基培养App S7参考菌株(WF83)，甲醛灭活后作为免疫抗原；参考吴建祥等[4-5]的方法进行免疫、融合和筛选。阳性杂交瘤细胞用于生产小鼠腹水单抗，按照荷兰HyCult Biotechnology生产的小鼠单克隆抗体检测试剂盒说明书[6]进行单抗亚型鉴定。

使用间接ELISA鉴定单抗特异性。抗原(序号见表1)包括App1～15型参考菌株，及其他27株相关菌株。

表1 胸膜肺炎放线杆菌和相关细菌菌株

Table 1 App and reference strains used in test

序号No．种名Name菌株Strain血清型Serotype来源Origin1A．pleuropneumoniae40741丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute2A．pleuropneumoniae15362丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute3A．pleuropneumoniae14213丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute4A．pleuropneumoniaeM624丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute5A．pleuropneumoniaeK175A丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute6A．pleuropneumoniaeL205B丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute7A．pleuropneumoniaeFemϕ6丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute8A．pleuropneumoniaeWF837丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute9A．pleuropneumoniae4058丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute10A．pleuropneumoniae132619丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute11A．pleuropneumoniae1303910丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute12A．pleuropneumoniae5615311丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute13A．pleuropneumoniae832912丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute14A．pleuropneumoniaeN27313丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute15A．pleuropneumoniae390614丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute16A．pleuropneumoniaeHS14315丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute17A．lignieresiiP670丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute18A．lignieresiiP155丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute19A．lignieresiiP671丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute20A．lignieresiiATCC49236(NCTC4189)丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute21A．rossiiATCC27072丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute22A．suisCAPM(CCM)5586丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute23A．equuliNCTC8529丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute24Mannheimia(Pasteurella)haemolyticaNCTC9380丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute25PasteurellaaerogenesATCC27883丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute26PasteurellamultocidaCCUG17976B丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute27BordetellabronchisepticaCCUG219丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute28StreptococcussuisNCTC10234丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute29TrueperellapyogenesCCUG13230丹麦兽医研究所DanishVeterinaryInstitute30Bordetellabronchiseptica波2兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)31Bordetellabronchiseptica波052兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)

(转下页 Carried forward)

1.2.2 单抗的纯化及效价测定 将腹水单抗参考杜平方法[7]用硫酸铵纯化。参考韩文瑜等的方法[8]，用改良过碘酸钠法将纯化的单抗与HRP偶联，即得到HRP标记的单抗。

采用直接ELISA法测定酶标抗体效价，以App S6抗原为阴性对照。

1.2.3 竞争ELISA检测AppS7抗体

1.2.3.1 抗原和样品血清的最佳工作浓度的测定：参考杜军等[9]的方法制备多糖抗原，将抗原1∶200至1∶6 400稀释，使用1.2.2中滴定的酶标单抗，竞争ELISA检测阳性、阴性猪血清及空白对照(用稀释液代替血清)。选择阴性对照血清竞争较少，且吸光值在1.0左右的抗原浓度作为抗原工作浓度。

将App S7猪高免血清、兔高免血清以及猪阴性血清和兔阴性血清分别按照1∶4至1∶512倍比稀释，使用以上确定的抗原及酶标抗体的浓度，用竞争ELISA检测，同时设立空白对照，选择阴性血清竞争结合较少时的最低血清稀释度为血清最佳稀释浓度。

1.2.3.2 竞争ELISA阴性和阳性临界值(Cutoff值)的确定：参考OIE推荐的方法[10]，使用已知阳性和已知阴性血清确定Cutoff值。用于确定Cutoff值的血清235份，其中用于确定Cutoff值的阳性32份，为App S7标准菌株免疫猪或临床检疫阳性，均用两种商品化试剂盒确定为阳性的猪血清。用于确定Cutoff值阴性的血清203份，分别来自加拿大90份、法国22份、丹麦55份进口种猪及上海供港猪场36份，均经过两种商品化试剂盒检测确定为阴性的猪血清。血清按照1.2.3.1中确定的最佳稀释浓度稀释，用竞争ELISA检测。计算阳性、阴性血清分别与阴性对照血清吸光值的百分比，根据其比值作散点图，根据散点图确定Cutoff值。

1.2.4 竞争ELISA的特异性 使用确定的竞争ELISA程序检测1.1.3中的对照血清，以判定该方法的特异性。

1.2.5 竞争ELISA试剂的稳定性和重复性 抗原包被过夜，用含保护剂的封闭液封板，抽真空。阳性和阴性血清加入防腐剂，均4 ℃保存。酶标抗体用稳定剂按照1∶100稀释，37 ℃保存。按照竞争ELISA检测程序，在16 d内检测7次阴性、阳性血清，按照酶储存37 ℃ 1 d相当于储存2～8 ℃ 1.5个月计算，检测试剂的稳定性。

对4份已知血清重复检测7次，比较检测结果的重复性。

1.2.6 竞争ELISA揭示免疫猪血清抗体消长规律 用竞争ELISA检测2号免疫猪不同时期采集的血清，分析其抗体消长规律。

1.2.7 竞争ELISA与商品化检测试剂盒比较 用竞争ELISA分别检测两头免疫猪不同时期采集的血清、临床血清样品，同时用加拿大Biovet公司[11]和法国IDvet公司[12]的间接ELISA试剂盒检测，并计算竞争ELISA与进口商品化检测试剂盒的符合率。

2 结 果

2.1 单抗特性

获得的单抗经小鼠单抗亚型检测试剂盒检测为IgM亚型。

使用间接ELISA鉴定单抗特异性，该单抗仅可特异性地与App S7抗原反应，不能与App其他14个血清型的抗原以及其他27株相关菌株抗原反应。以App S7为抗原，酶标单抗的最佳工作浓度为1∶20 000。

2.2 竞争ELISA检测App S7抗体试剂盒的研制

2.2.1 抗原及血清最佳工作浓度 竞争ELISA的程序：包被抗原，加入被检的血清及HRP标记的单抗，然后显色测定吸光值(OD450 nm)。当抗原为1∶800以下稀释度时，阴性血清与空白对照吸光度比值均在95%以上，且阳性血清与阴性血清吸光度的差异最大，见图1。因此，选用抗原1∶800为最佳工作浓度。血清1∶16稀释时，阴性血清竞争结合不明显，因此血清1∶16为被检血清的最佳稀释浓度。

2.2.2 竞争ELISA检测结果判定 阳性血清与阴性对照吸光值百分比的散点图见图2，阴性血清与阴性对照吸光值百分比的散点图见图3。通过散点分布图分析阳性血清比值绝大部分在20%以下 (仅1份血清比值在20%以上，概率为3.13%)，故设置阳性比值为小于或者等于20%为阳性临界值。而大部分阴性血清比值均在40%以上(仅3份阴性血清在40%以下，其概率为1.48%)，故设置阴性比值大于40%时为阴性临界值，介于两者间的为可疑。

图1 不同抗原稀释度检测血清的吸光值Fig.1 The absorbance of sera and control at different dilution of antigen

图2 阳性血清比值的散点图Fig.2 The scatter diagram of the ratio of positive sera with negative control

图3 阴性血清比值的散点图Fig.3 The scatter diagram of the ratio of negative sera with negative control

结果计算及判定：计算阳性、阴性对照平均OD值，及样品与阴性对照的比值(S/N)。阴性对照血清OD值应大于0.8；阳性对照与阴性对照的OD比值应小于或等于20%；对照成立才能进行样品判断；1∶16稀释的血清样品，其S/N值≤20%为阳性，S/N>40%为阴性，40%≥S/N>20%为可疑。

2.3 竞争ELISA的特异性

建立的竞争ELISA可特异检测App 7型猪血清和兔血清，与其他血清无交叉，特异性为100%。

2.4 竞争ELISA的稳定性和重复性

竞争ELISA检测，在16 d内阴性、阳性血清变化见图4。结果显示，酶标抗体保存于37 ℃第7天，阴性血清OD值没有明显的变化，第9天OD值显著下降至0.8以下，但到第16天阳性与阴性的比值仍然低于20%，阳性对照仍然成立。按照7 d计算，该试剂在4 ℃保质期最少10个月。

按照竞争ELISA检测程序，对4份血清重复检测7次，结果完全一致，与预期结果相符。

图4 不同时间阴性和阳性血清吸光值的变化Fig.4 The change of the absorbance of positive and negative serum at different time

2.5 免疫猪血清抗体消长规律

根据竞争ELISA对2号免疫猪血清效价的测定：免疫14 d后血清1∶128稀释为阳性，经过多次免疫，35 d后效价上升，血清1∶1 024稀释仍为阳性，143 d后抗体效价仍然维持在这个水平。

2.6 竞争ELISA与商品化检测试剂盒比较

2.6.1 检测免疫猪 用IDvet试剂盒和Biovet试剂盒检测两头免疫猪不同时期采集的血清，与竞争ELISA检测结果比较。三种试剂检测2号猪的结果完全相符。Biovet试剂盒检测1号猪，有一份样品不同，其余均相符。

2.6.2 检测临床样品 竞争ELISA检测260份临床样品，与IDvet试剂盒及Biovet试剂盒比较，结果有8份不相符，其余均相吻合，具体见表2。

2.6.3 竞争ELISA与其他商品化检测试剂盒的相符率 将2.6.1和2.6.2检测的结果(见表3)进行比较。如果将可疑算作阳性，则竞争ELISA与IDvet的相符率为97.2%[(281-8)/281]，与Biovet的相符率为98.2%[(281-5)/281]；如果将可疑算作阴性，则竞争ELISA与Biovet的相符率为97.9%[(281-6)/281]。说明作者建立的竞争ELISA试剂盒与商品化检测试剂盒有很好的相符性，可用于临床样品的检测。

3 讨 论

3.1 单抗亚型

单抗筛选中，得到3株针对App S7型单抗，本文选择了其中一株反应强的单抗进行试验，该单抗经亚型鉴定为IgM。加拿大A.Lebrun[13]报道的App S7单抗也为IgM，可能与App的全菌免疫原主要为多糖(CPS和LPS)抗原有关。

3.2 竞争ELISA的优势

目前国内还没有特异检测App 7型的商品化试剂盒，因为7型与4型有部分相似的表面抗原，会出现交叉反应。为准确检测App7型，作者从App15个血清型中筛选到仅针对7型的单抗，在此基础上，研制了竞争ELISA检测App7型抗体的方法和试剂，对App的诊断和免疫防控有重要意义。另外，与间接ELISA相比，竞争ELISA检测无种属特异型，除检测猪抗体外，还能检测鼠等实验动物抗体，可以用于猪传染性胸膜肺炎实验动物模型效果评估。且竞争ELISA方法检测样品可以在1 h内完成，比目前的商品化间接ELISA检测试剂盒快0.5 h，比检验检疫行业标准[14]使用的阻断ELISA快1.5 h，1 d内可以完成多批次样品检测，符合疫病快速诊断的要求。

3.3 竞争ELISA与其他试剂盒的比较

国内外可检测App S7的商品化试剂盒主要有：加拿大Biovet公司生产的以长链脂多糖LPS为检测抗原的间接ELISA试剂盒[11]，可同时检测App4/5/7型；法国IDvet公司生产的以长链脂多糖LPS为检测抗原的间接ELISA试剂盒[12]，可同时检测App4/7型；美国IDEXX[15]及华中农大[16]生产的间接ELISA试剂盒，使用重组毒素蛋白ApxⅣ为检测抗原，可以检测全部血清型App，且能区别活菌感染和灭活菌免疫；法国LSI[17]生产的间接ELISA试剂盒，使用毒素蛋白ApxⅠ及表面转铁结合蛋白Tbp2作为检测抗原，可检测所有血清型的App。根据国外对商品化试剂盒的比较[18]，以长链脂多糖LPS为检测抗原的间接ELISA检测实验感染猪的敏感性和特异性最好。作者建立的竞争ELISA方法与这类试剂盒比较，符合率达到97%以上，说明建立的竞争ELISA方法可用于临床样品的检测。由于此前没有能准确鉴定S7型抗体的试剂，在确定本方法的敏感性时只能使用标准菌株制备的阳性血清32份，数量较少，因而还需要将研制的竞争ELISA试剂盒在临床上更多的应用与验证。

表2 三种试剂盒检测临床样品结果

Table 2 The results of clinical samples detected by three types of kits

样品SamplecELISAIDvetBiovet阳性Positive阴性Negative可疑Suspicious阳性Positive阴性Negative阳性Positive阴性Negative可疑Suspicious丹麦猪血清55份55serumfrompigsimportedfromDanmark05500550550法国猪血清32份32serumfrompigsimportedfromFrance03200320320加拿大猪血清112份112serumfrompigsimportedfromCanada21073211021100美国猪血清20份20serumfrompigsimportedfromAmerica02000200200上海供港猪血清40份40serumfrompigslocatedinShanghaifarm04004360400本单位保留血清1份1serumstoredatSHCIQ01010001共计260份Total26022553725322571

表3 三种试剂盒检测结果比较

Table 3 The comparison of results detected by three types of kits

样品SamplecELISAIDvetBiovet阳性Positive阴性Negative可疑Suspicious阳性Positive阴性Negative阳性Positive阴性Negative可疑Suspicious临床样品260份260samples22553725322571免疫2号猪11份11samplescollectedfromNo．2immunizedswine92092920免疫1号猪10份10samplescollectedfromNo．1immunizedswine72182532共计281份Total28118259424257162623

4 结 论

在制备胸膜肺炎放线杆菌(App)7型单抗的基础上，研制了竞争ELISA方法及相应的试剂，可以特异地检测App 7型抗体，与国外商品化检测试剂盒有很高的符合率，可应用于临床样品的检测。

致谢 上海交通大学农业与生物学院孙建和教授，严亚贤教授，中国农业科学院上海兽医研究所魏建超博士在文章的撰写上给予了无私的帮助，在此表示感谢。

[1] 陆承平.兽医微生物学[M].5版.北京：中国农业出版社，2012：136-138. LU C P.Veterinary microbiology[M].5rd edition.Beijing：China Agriculture Press，2012：136-138.(in Chinese)

[2] 雷连成，华 芳，王丽哲，等.猪胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定与毒力测定[J].中国兽医学报，2008，28(4)：359-362. LEI L C，HUA F，WANG L Z，et al.Isolation and identification ofActinobacilluspleuropneumoniae[J].ChineseJournalofVeterinaryScience，2008，28(4)：359-362.(in Chinese)

[3] 李树清，易建平，李 健，等.胸膜肺炎放线杆菌的实时荧光PCR检测[J].畜牧兽医学报，2005，36(9)：969-973. LI S Q，YI J P，LI J，et al.The detection ofActinobacilluspleuropneumoniaeby real-time PCR[J]，ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2005，36(9)：969-973.(in Chinese)

[4] 吴建祥，刘成科，洪 健，等.百合无症病毒单克隆抗体的制备及检测应用[J].微生物学报，2005，45(4)：580-583. WU J X，LIU C K，HONG J，et al.Production of monoclonal antibodies toLilysymptomlessvirusand application in lily virus detection[J].ActaMicrobiologicaSinica，2005，45(4)：580-583.(in Chinese)

[5] 吴建祥，林福呈，李德葆，等.稻瘟病菌单克隆抗体的研制及其对稻瘟病菌附着胞形成的影响[J].微生物学报，2000，40(6)：638-645. WU J X，LIN F C，LI D B，et al.Studies on monoclonal antibodies of Magnaporthe Grisea and its interfering effect on appressorium formation[J].ActaMicrobiologicaSinica，2000，40(6)：638-645.(in Chinese)

[6] HyCult Biotech.Mouse Mab Isotying test kit HL2010[EB/OL].[2015-02-23].http：//www.biomart.cn/infosupply/2322982.htm.2014

[7] 杜 平.医用实验病毒学[M].北京：人民军医出版社，1985：223-227. DU P.Medical experimental virology[M].Beijing：People’s Military Medical Press，1985：223-227.(in Chinese)

[8] 韩文瑜，何昭阳，刘玉斌，等.病原细菌检验技术[M].长春：吉林科学技术出社，1992：204. HAN W Y，HE Z Y，LIU Y B，et al.The diagnostic techniques of pathogenic bacteria[M].Changchun：Jilin Science and Technology Press，1992：204.(in Chinese)

[9] 杜 军，张 强，李树清，等.双夹心ELISA检测猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体方法的建立[J].新疆农业大学学报，2009，32(6)：46-50. DU J，ZHANG Q，LI S Q，et al.Establishment of the double sandwich ELISA method detecting antibodies ofActinobacilluspleuropneumoniaeserotype 2[J].JournalofXinjiangAgriculturalUniversity，2009，32(6)：46-50.(in Chinese)

[10] OIE-World Organisation for Animal Health.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2014，Chapter 1.1.5[M/OL].[2015-02-23].http：//www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf.

[11] Biovet.Actinobacillus pleuropneumoniae 4-5-7 Antibody Test Kit(ELISA)[EB/OL].[2015-02-23].http：//www.biovet.ca/en/app/.2013

[12] IDvet.ID Screen APP 4-7 Indirect[EB/OL].[2015-02-23].http：//www.greencoral.com/chinese/product/id_vet/procine.html

[13] LEBRUN A，LACOUTURE S，CTÉ D，et al.Identification ofActinobacilluspleuropneumoniaestrains of serotypes 7 and 4 using monoclonal antibodies：demonstration of common LPS O-chain epitopes withActinobacilluslignieresii[J].VetMicrobiol，1999，65(4)：271-282.

[14] 王巧全，李树清，张 强，等.SN/T1447-2011猪传染性胸膜肺炎检疫技术规范[S].北京：中国标准出版社，2011. WANG Q Q，LI S Q，ZHANG Q，et al.SN/T1447-2011 Quarantine protocol for infectious pleuropneumonia of swine[S].Beijing：Standards Press of China，2011.(in Chinese)

[15] IDEXX.Actinobacillus pleuropneumoniae(APP)Antibody Test Kit[EB/OL].[2015-02-23].https：//www.idexx.com/livestock-poultry/swine/actinobacillus-pleuropneumoniae.html.

[16] 贾 凡，胡军勇，王建银，等.猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA鉴别诊断试剂盒的研制与应用[J].农业生物技术学报，2007，15(6)：911-917. JIA F，HU J Y，WANG J Y et al.Development and application of ApxⅣ-ELISA differentiating diagnostic kit forActinobacilluspleuropneumoniae[J].JournalofAgriculturalBiotechnology，2007，15(6)：911-917.(in Chinese)

[17] LSI.CIVTEST SUIS APP[EB/OL].[2015-02-23].http：//mall.foodmate.net/goods-1035.html.

[18] OPRIESSNIG T，HEMANN M，JOHNSON J K，et al.Evaluation of diagnostic assays for the serological detection ofActinobacilluspleuropneumoniaeon samples of known or unknown exposure[J].JVetDiagnInvest，2013，25(1)：61-71.

(编辑 白永平)

Development and Application of Competitive ELISA for Detecting Antibody againstActinobacilluspleuropneumoniaeSerotype 7

LI Shu-qing1，CHEN Zhi-fei1，ZHANG Qiang1，WU Jian-xiang2，LIU Yu-xiao3，WANG Qiao-quan1， LIN Ying-zheng1，SONG Qing1，TANG Zhi-fang1，LU Cheng-ping4*

(1.ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureauofthePeople′sRepublicofChina，Shanghai200135，China；2.ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China； 3.SchoolofAgricultureandBiology，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200240，China； 4.NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

The study was conducted to develop the specific method for detecting antibody againstActinobacilluspleuropneumoniae(App) serotype 7(S7)，the most prevalent serotype all over the world，and apply to the inspection and quarantine for antibodies of imported and exported pigs.Hybridoma cell line secreting monoclonal antibody(McAb) against App S7 was screened，and the McAb was purified from mouse ascitic fluid and labeled with HRP.The competitive ELISA(cELISA)was developed and its specificity and stability were tested.The sera collected from pigs immunized with reference strain of App S7 or field samples were assayed by this cELISA and other commercial ELISA kits parallelly.The McAb，characterized as IgM，can react specifically with reference strain of App S7，and no cross-reaction with other serotype strains and 27 other strains.The developed cELISA was also specific for detecting antibody against App S7.The antibody against App S7 from the immunized pig can be detected by this method at 14 days post injection，the antibody titer reached and kept at the peak from 35 to 143 days post immunization.The data detected from the samples of 260 clinical sera and the immunized swines，showed that the cELISA have 97.2% coincidence with IDvet test kit and 97.9%-98.2% consistent with Biovet test kit.This cELISA can be used to detect antibody againstActinobacilluspleuropneumoniaeserotype 7 with high specificity.

Actinobacilluspleuropneumoniaeserotype 7；antibody detection；competitive ELISA

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.016

2015-01-26

上海出入境检验检疫局科研专项(HK004-2008)

李树清(1964-)，女，四川眉山人，研究员，硕士，从事进出口动物检疫工作，Tel：021-38620591, E-mail：lisq@shciq.gov.cn

*通信作者：陆承平， E-mail: lucp@njau.edu.cn

S852.619

A

0366-6964(2015)10-1829-09