柔嫩艾美耳球虫Cathepsin B基因的克隆表达及活性研究

刘任强，蔡建平，汪 明＊

（1.中国农业大学动物医学院国家原虫实验室，北京100193；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，兰州730046）

鸡球虫病是由顶复合门艾美尔属球虫引起的一种寄生虫病，可对养禽业造成重大的经济损失。目前对鸡球虫病的控制措施主要依赖于化学药物预防，但目前抗药性和药物残留日趋严重，急需开发新药或找到新的药物靶点。

组织蛋白酶B（cathespin B）是一类半胱氨酸类蛋白酶，属于木瓜蛋白家族，研究表明在寄生虫的生存、与宿主细胞的相互作用、致病性以及逃逸诸多过程中都发挥了重要的作用［1］。在与球虫相似的其他顶复合门的寄生虫中，已经发现并克隆了类组织蛋白酶B蛋白，他们在虫体入侵和入侵相关蛋白质的成熟加工中发挥着重要的作用［2-4］。

顶复门原虫作为专性胞内寄生虫，游离的虫体在宿主胞外不能长时间存活。其入侵过程一般在很短时间内完成，组织蛋白酶对于胞外的虫体快速入侵宿主细胞有重要作用。入侵相关蛋白质的成熟以及在形成纳虫空泡后从宿主细胞膜上分离的过程中都涉及大量蛋白酶的参与［5-7］。一旦完成入侵，寄生虫将利用宿主蛋白质进行新陈代谢，合成自身生长繁殖所需营养物质。这一过程也涉及多种蛋白酶的参与，由于虫体与宿主细胞的代谢过程不尽相同，因此在抗寄生虫药物筛选中，这些蛋白酶作为潜在目标被广泛研究。寄生虫的蛋白酶在维持虫体蛋白质稳态、蛋白质运输以及重塑宿主细胞等方面也均发挥作用，因而具有药物靶点的潜在价值［8-9］。可见，组织蛋白酶对寄生虫完成其生活史具有重要作用，因此抑制这些蛋白酶活性可在感染过程的不同阶段抑制寄生虫发育。

半胱氨酸蛋白酶对于许多寄生虫疾病都是重要的免疫优势抗原，能刺激宿主产生较好的细胞和体液免疫。该类蛋白质还存在种属特异性，因此作为一种较好的候选诊断抗原也有重要意义。同时，由于蛋白酶的酶活性位点与小分子物质可发生相互作用，蛋白酶作为药物开发的靶位点，开发多种小分子蛋白酶抑制剂，越来越受人们关注。随着寄生虫的半胱氨酸蛋白酶研究的深入，半胱氨酸蛋白酶日益瞩目，相关领域的研究不仅揭示了寄生虫与宿主相互作用的具体机制，也为寄生虫病的诊断与防治开辟了新的思路。

1 材料与方法

1.1 卵囊的分离与纯化

E.tenella Houghton株未孢子化卵囊的分离、纯化：用1.0×104E.tenella Houghton株卵囊感染鸡后，在感染的第7天收集盲肠，用组织匀浆器捣碎后100目网过滤，然后用饱和盐水漂浮，洗涤后再用10%次氯酸钠处理，离心沉淀后回收，加1 mmol·L-1亚硫酸氢钠，置于4℃备用。

1.2 总RNA的提取和反转录

E.tenella Honghton株未孢子化卵囊总RNA的提取：取5×107冻存的卵囊块加入研磨器液氮充分研磨，加入1 m L Trizol（Invitrogen）中，室温静置5 min，提取总RNA。反转录采用TransScript反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），cDNA存于-20℃。

1.3 引物的设计

利用弓形虫中报道的Cathepsin B的序列，与E.tenella的数据库（http：／／www.genedb.org／Homepage／Etenella）进行Blast P比对，在数据库中找到序列（Supcontig＿23）可编码具有cathepsin B类蛋白特征的开放阅读框（ORF）。用Primer premier 5.0软件设计1对引物，F1：5′-ATGAGGATGGGGAAGCTGTGGGCC-3′；R1：5′-TCATAGGTCCTGCGCTGACGGCAG-3′。

1.4 Etcat B基因序列克隆及分析

以cDNA为模板，扩增条件：95℃预变性5 min；94℃20 s，60℃30 s，72℃100 s，35个循环；72℃延伸10 min。将Etcathepsin B（Etcat B）PCR产物连接到T载体（北京全式金生物技术有限公司），以PCR及序列测定筛选阳性克隆（pEASTT1-Etcat B），用DNAMAN进行序列分析。

1.5 Etcat B的原核表达

利用SignalIP2.0对序列进行分析，去除信号肽，用Primer premier 5.0软件设计1对引物，F2：5′-ATGCCCTCCGATGATTTGGGCGGCGCT-3′；R2：5′-TCATAGGT-CCTGCGCTGACGGCAG-3′。将PCR产物连接到表达载体（北京全式金生物技术有限公司），PCR及序列测定筛选阳性克隆（p EAST-E1-Etcat B）。取阳性表达菌接种到LB（含Amp）中，37℃200 r·min-1扩大培养，菌液浓度增至OD值0.6，1 mmol·L-1IPTG诱导，SDSPAGE分析，确定表达条件。使用Ni-NTA柱（Qiagen）进行纯化。

1.6 Etcat B的活性检测

将蛋白质加入等量非变性SDS电泳上样缓冲液中（2%SDS，0.125 mol·L-1Tris-HCl，p H 6.8，10%甘油，0.001%溴酚蓝），经含0.1%明胶的10% SDS-PAGE电泳终止后，凝胶置于漂洗液中（含50 mmol·L-1乙酸钠，10 mmol·L-1半胱氨酸，100 mmol·L-1NaCl，2.5%Triton X-100）漂洗1 h，蒸馏水洗3遍，孵育于底物缓冲液（50 mmol·L-1乙酸钠、1.212 g半胱氨酸、0.5 mmol·L-1EDTA），37℃孵育24 h，1%考马斯亮蓝染色，脱色后可见具明胶酶活性处为清晰透明条带。

1.7 Etcat B多克隆抗体的制备

首免将纯化好的Etcat B重组蛋白质与等体积的弗氏完全佐剂混匀后（0.5 mg·kg-1）对成年健康家兔进行背部多点皮下及肌肉注射，2周后再用Etcat B重组蛋白质与等体积弗氏不完全佐剂混匀（2 mg·kg-1）背部多点皮下及肌肉注射，此后每隔1周用蛋白质样品（2 mg·kg-1）皮下及肌肉注射。四免后采集血液，用间接ELISA测定抗体效价。用Etcat B蛋白（10μg·m L-1）包被ELISA板，每孔100μL。4℃过夜后弃液体，PBST（0.05%）洗涤3次。在用5%（m／v）脱脂奶粉进行封闭，37℃1 h；PBST洗涤后分别加入不同稀释度的抗血清，同时以免疫前血清作为阴性对照，37℃孵育1 h；PBST洗涤3次后加入1∶4 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；加底物TMB 37℃显色15 min，终止反应后，读取450 nm吸光值。

1.8 Western blot和Real-time PCR检测

取107个E.tenella的子孢子、裂殖子、配子体分别加入1 m L TRIzol中充分混匀，室温作用5 min，取107个未孢子化卵囊和孢子化不同时间卵囊于液氮中研磨，研磨好的样品加入1 m L TRIzol中充分混匀，室温作用15 min并提取RNA，剩余油相用异丙醇沉淀蛋白质。每使用1 m L TRIzol加1.5 m L异丙醇，室温放置10 min，4℃12 000×g离心10 min弃上清。用含0.3 mol·L-1盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀，每使用1 m L TRIzol加2 m L洗涤液，室温放置20 min，2～8℃7 500×g离心5 min，弃上清，共洗2次。用2 mL无水乙醇同样方法再洗一次。真空抽干蛋白质沉淀10 min，用1%SDS溶解蛋白质，反复吸打，50℃温浴使其完全溶解。

SDS-PAGE蛋白电泳后，选用PVDF膜，用Bio-Rad湿转装置，60 v电转2 h。把PVDF膜浸入5%脱脂奶粉，37℃封闭1 h；PBST（0.05%）洗涤后分别加入1∶2 000的一抗，37℃孵育1 h；加入1∶2 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBST洗涤5次后，用ECL-plus来检测蛋白质。

Real-time PCR使用的引物为FcatB（5′-CTGGGGAAGCCGGCCAGCTGTTAGC-3′）、RcatB（5′-CGTTCCAGCTGTTCACAGCTAGCCAG-3′）；选用的内参为β-actin，引物为Factin（5′-CACCACCgCCg Ag AAAg A-3′）和Ractin（5′-g AACAACATTgCCg TAg Agg-3′）

反应体系：cDNA模板2μL，Power SYBR Green PCR Master Mix 10μL，上／下游引物（25 μmol·L-1）各0.5μL，H2O 7μL，总体积20μL。

反应程序：95℃10 min；95℃15 s；50℃30 s；72℃40 s（读板），共45个循环。

利用Graph Pad Prism 5软件对数据进行分析和绘图。利用SPSS软件采用Duncan’s multiple range test进行各组数据显著性分析。

2 结 果

2.1 Etcat B基因扩增及序列分析

琼脂糖凝胶电泳（图1）显示有1条约1 500 bp条带，与预计大小一致。测序结果显示基因大小为1 539 bp，与sanger上所得的序列（Supcontig＿23）完全一致。序列分析得知Etcat B编码区（CDS）编码512个氨基酸，其蛋白质相对分子质量为56.86 ku，理论pI为5.82。氨基端含有21个氨基酸构成的信号肽，羧基端有典型的cathepsin B的结构特征。与弓形虫报道的cathepsin B相似性为57%。

2.2 Etcat B原核表达载体的构建和表达条件优化

SDS-PAGE电泳结果显示，在1 mmol·L-1IPTG条件下，与对照组相比，诱导组均表达了57 ku大小的特异带（图2，泳道3、4和5），与预测的相对分子质量相符（图2）。表达结果显示，37℃诱导4 h，该蛋白质主要以包涵体的形式表达；4℃过夜诱导转为可溶性表达。

2.3 重组Etcat B活性检测

明胶酶谱法试验结果（图3）显示，在不同质量浓度的酶作用下，均能不同程度的降解明胶，57和35 ku出现特异性透明条带，且蛋白质质量浓度越高，降解越彻底，条带越明显。

图1 Etcat B基因的克隆Fig.1 Cloning of Etcat B gene

图2 Etcat B原核表达SDS-PAGE电泳分析Fig.2 Analysis of expressed protein by SDS-PAGE

2.4 多克隆抗体制备和Western blot及Real-time PCR检测

图3 采用SDS-PAGE明胶酶谱法检测重组蛋白酶活性Fig.3 Activities of recombinant protein by SDS-PAGE gelatin zymography

间接EILSA显示兔抗Etcat B血清效价在107以上，表明重组蛋白质具有良好的免疫原性。以E. tenella Houghton株配子体、未孢子化卵囊、子孢子和裂殖子cDNA为模板，同时检测Etcat B和参照基因（β-actin）的表达，计算各阶段Etcat B基因表达的相对水平，结果显示Etcat B mRNA水平在配子体和裂殖体要高于未孢子化卵囊和子孢子阶段（图4）。分别以上述E.tenella四种不同阶段总蛋白质为模板，同时检测Etcat B和参照蛋白质（tubulin）的表达，结果显示Etcat B以未成熟和成熟两种形式均在，蛋白质大小分别为57和35 ku，Etcat B在配子体和裂子体时期表达较高，未孢子化和子孢子阶段表达相对较低（图5）。以孢子化不同阶段（0、6、12、18、24和48 h）cDNA为模板，同时检测Etcat B和参照基因（β-actin）的表达，计算孢子化不同阶段Etcat B基因表达的相对水平，结果显示Etcat B mRNA水平在孢子化过程中，基本保持一致（图6）。以孢子化不同阶段（3、6、12、18、24和48 h）总蛋白为模板，同时检测Etcat B和参照蛋白（tubulin）的表达，结果显示Etcat B在孢子化过程中，未成熟蛋白质和成熟蛋白质的水平略有上升趋势（图7）。

图4 E.tenella Houghton株各发育阶段Etcat B mRNA水平Fig.4 The mRNA levels of Etcat B in E.tenella Houghton strain in difference life stage

图5 E.tenella Houghton株各发育阶段Etcat B Western blot结果Fig.5 The result of Western blot of Etcat B in E.tenella Houghton strain in difference life stage

图6 E.tenella Houghton株孢子化不同阶段Etcat B mRNA水平Fig.6 The mRNA levels of Etcat B in E.tenella Houghton strain during sporulation

图7 E.tenella Houghton株孢子化不同阶段Etcat B Western blot结果Fig.7 The result of Western blot of Etcat B in E.tenella Houghton strain during sporulation

3 讨 论

蛋白酶是寄生虫的一种重要的毒力因子，它们在感染宿主的过程中起了关键作用，可作为预防和治疗寄生虫的新型药物靶点，因此越来越受到大家的重视。研究表明，在S.mansoni中，组织蛋白酶B可分泌到肠腔中，帮助虫体降解血红蛋白［10］。G.lamblia含有3个组织蛋白酶B，在虫体的脱囊和成囊过程中发挥作用［11］。T.brucei的组织蛋白酶B参与对吞噬的宿主蛋白的降解，且为生存所必需的蛋白质［12-13］。有研究表明在艾美尔球虫的生活史中，蛋白酶参与了诸如宿主细胞入侵［14］和卵囊壁形成等重要的生理过程［15］。但组织蛋白酶B在其中具体参与了何种生理过程及对球虫防控的影响尚不明确。

本课题组通过RT-PCR手段与国外两家实验室［16-17］几乎同时克隆并表达柔嫩艾美尔球虫的组织蛋白酶B，通过p BLAST比较发现，柔嫩艾美耳球虫的组织蛋白酶B（Etcat B）与T.gondii（Ac.No.EPR63374.1）相似性最高，可达49%，与其相似性较高的寄生虫还有E.siliculosus（Ac.No.CBN78981.1）、T.spiralis（Ac.No.XP＿003379650.1）、S.mansoni（Ac.No.XP＿002574974.1），相似性分别是43%、40%、39%。与禽类相比（Ac.No.AAA87075.1），尽管在保守区域相似性较高（可达40%），但Etcat B全长含有512个氨基酸，而鸡的cathepsin B仅含有340个氨基酸，两者对比发现，在组成结构上，特别是N端起调节作用的结构域上区别很大，研究表明，cathepsin B的这一结构域不仅在蛋白质加工折叠中起作用，也可以抑制蛋白酶的活性［18］。由此可见，二者的亲缘关系较远，这为以其作为设计药物治疗或者免疫预防奠定了基础。

本试验中，利用大肠杆菌原核表达系统成功表达重组蛋白质Etcat B。该蛋白质在37℃诱导6 h条件下以包涵体的形式存在，虽然包涵体对表达产物纯化和表达产量提高非常有利，但难以获得活性良好的包涵体蛋白，为了后期进行蛋白质活性检测，试验中对表达条件进行了优化，发现在16℃过夜诱导的条件下蛋白质可以部分以上清的形式表达。通过明胶酶谱法我们确定所得蛋白质有一定的活性，结果显示不仅在57和35 ku有两条特异性条带，推测分别是Etcat B未成熟和成熟形式。

作者对重组蛋白质进行酶动力学研究，通过荧光ELISA的方法，利用Z-Phe-Phe-AMC检测低浓度的Etcat B活性，结果显示原核表达的重组蛋白质的活性较低，这一结果和M.Schaeffer等［19］的结果一致。M.Schaeffer通过试验表明，酵母系统表达所得产物具有较好的蛋白酶活性，说明Etcat B蛋白结构的适度糖基化和修饰对其发挥活性至关重要。

2012年，M.Katrib等［20］首次利用半定量的方式对Etcat B不同时期的表达进行了初步分析，2013年，A.Rieux等［16］用测定酶活的方法进一步确定了Etcat B孢子化过程中的表达水平。随后M.Matsubayashi等［17］用半定量法分析了Etcat B在孢子化过程中的表达，并用Western blot的方法检测了不同发育阶段的表达情况。本试验中，作者利用Real-time PCR和Western blot的方法进一步检测了Etcat B在球虫发育不同阶段和孢子化不同阶段的表达水平，结果显示Etcat B在配子体和裂子体时期表达较高，子孢子和未孢子化阶段表达相对较低，孢子化过程中变化不明显。本研究为探讨Etcat B在球虫的发育和入侵中的功能及寻找与其互作蛋白质，并为寻找其合适的特异性抑制药物等奠定了基础。

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