PI3K／Akt抑制剂对鸡朊蛋白过表达DF-1细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

万学瑞，朱曼玲，杨润霞，刘桂林，刘 磊，吴 润

（甘肃农业大学动物医学院，兰州730070）

PI3K／Akt信号转导通路广泛存在于细胞中，Akt是此通路中的一个关键分子，活性主要由PI3K的产物调控。胞外信号可以通过激活受体酪氨酸激酶（RTK）或G蛋白偶联受体而激活PI3K，其产物使Akt磷酸化，p-Akt可在细胞质或细胞核内磷酸化多种蛋白质分子，通过改变下游分子的磷酸化状态参与细胞的生长、增殖和存活。PI3K／Akt信号转导通路是抑制细胞凋亡，促进细胞生长增殖的重要因素，使细胞维持周期运行［1］。渥曼青霉素（wortmannin，WM）是丝状真菌绳状青霉（Penicillium funiculosum）的代谢产物，可特异性、不可逆的抑制PI3K活性，阻断PI3K／Akt信号通路。

细胞型朊蛋白（cellular prion protein，Pr PC）是由细胞自身基因编码，普遍表达在真核细胞膜上的GPI锚定蛋白［2］。哺乳动物细胞型朊蛋白错误折叠形成异常痒病型朊蛋白（scrapie prion protein，Pr PSC）可致传染性海绵状脑病，但在非哺乳动物体内却未见发病［3］。多项研究已证明哺乳动物细胞型朊蛋白具有多种生理功能，参与调节细胞增殖、分化、凋亡、侵袭、黏附、信号转导、铜离子代谢和氧化应激等过程［4-10］，但具体机制还不清楚。本课题组前期的研究发现鸡细胞型朊蛋白（ChPr PC）表达及分布规律同哺乳动物Pr PC相似［11］，通过构建鸡细胞型朊蛋白过表达的鸡成纤维（DF-1）稳定细胞系（DF-1-PrP）证实其可促进DF-1细胞黏附、增殖和侵袭，抑制其凋亡［12］，进一步应用实时荧光定量PCR检测发现鸡细胞型朊蛋白过表达DF-1细胞的Akt基因表达量明显高于DF-1细胞，推测鸡细胞型朊蛋白可能参与Akt的激活，进而促进细胞生长与抑制细胞凋亡［13］。为了证实这一推测，本研究拟利用渥曼青霉素阻断PI3K／Akt信号通路，探讨其对鸡细胞型朊蛋白过表达DF-1细胞黏附、增殖、侵袭和凋亡的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 DF-1细胞、DF-1-Pr P细胞（Ch Pr PC过表达DF-1细胞）和DF-1-NC细胞（导入空表达载体pCDNA3.1的DF-1细胞），均由本实验室保存或构建。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清（FBS，Hy Clone公司），鼠尾胶原（杭州生友生物技术有限公司）；G418、DMEM、无血清培养基（GIBCO公司），渥曼青霉素（Alexis公司），噻唑蓝（MTT）、台盼蓝（上海酶联生化试剂有限公司），Annexin V-FICT／PI双染细胞凋亡检测试剂盒（上海贝博生物公司），Transwell小室（Costar公司），牛血清白蛋白（BSA，西安依科生物技术有限公司），其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 MyCyclerTMThermal Cycler EN-61010 PCR仪（美国BIO-RDA公司），Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪（美国Roche公司）；酶标仪680（美国BIO-RAD公司），FACSCalibur flow cytometer（美国BD公司）等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1细胞用含10%胎牛血清、青霉素（100 U·m L-1）和链霉素（100 U·m L-1）的DMEM培养基置于37℃、5%CO2培养箱培养，当培养瓶中的细胞覆盖率达到80%以上时，0.25%胰蛋白酶消化传代，传3代稳定后进行后续试验。

1.2.2 黏附试验 将鼠尾胶原用6 mmol·L-1无菌乙酸配制成6.25 mg·L-1的溶液，50 μL·孔-1加入96孔培养板，4℃过夜制备基底膜，吸出孔中残余液体，加入50μL无血清培养基37℃孵育30 min水化基底膜。将对数生长期的DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1细胞，胰蛋白酶消化后，用培养液重悬细胞，调整细胞数为1×105·m L-1，100 μL·孔-1分别接种于包被鼠尾胶原的孔中，再加入渥曼青霉素使其终浓度分别为0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，每组4个重复，37℃5%CO2环境下培养细胞，以包被牛血清白蛋白（BSA）为对照。细胞培养1 h后，用PBS溶液小心的洗细胞3次，按照MTT比色法测定培养板各孔的光吸收值（A值），试验重复3次。应用如下公式分别计算各组细胞的黏附率：黏附率（%）＝［（处理组A值／BSA对照组A值）-1］×100%。

1.2.3 侵袭试验 用6.25 mg·L-1鼠尾胶原溶液包被Transwell小室，4℃过夜风干，吸出残余液体，加入50μL无血清培养基，37℃孵育30 min。用0.25%的胰蛋白酶消化处于对数生长期的DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1细胞，无血清培养液重悬细胞（1×105·m L-1）。在下室中加入400μL按1∶1混合的完全培养液和条件培养液（DF-1细胞生长至80%以上融合，换无血清培养液培养24 h后收集培养上清液，过滤除菌），上室中加入100μL细胞悬液，再加入渥曼青霉素使其终浓度分别为0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，每组4个重复，37℃5%的CO2环境中培养24 h后，弃培养基，擦净上室细胞，取出Transwell用PBS洗2次，95%的乙醇溶液固定细胞15 min，风干；加4 g·L-1的台盼蓝溶液染色20 min，PBS洗3次，倒置显微镜下随机计数10个视野的细胞，取平均数，试验重复3次。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1细胞（1× 105·m L-1），100μL·孔-1接种96孔培养板中，加入渥曼青霉素使其终浓度分别为0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，以DMEM培养液为空白对照，每组3个重复。细胞培养12、24、36、48、60 h后，每孔加入20μL MTT（5 mg·m L-1）溶液，置于CO2培养箱中孵育4 h后吸出孔内液体，再加入150μL DMSO振荡10 min。用酶标仪检测，读取OD490nm处的吸光值。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 在对数生长期的DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1细胞中加入渥曼青霉素使其终浓度分别为0、10、20、50、100、200 nmol·L-1，作用24 h后，消化收集细胞（1× 107·m L-1），按Annexin V-FICT／PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，冷PBS洗细胞2次，加入200μL结合缓冲液重悬细胞，再加入10 μL Annexin V-FITC和5μL PI，轻摇混匀，孵育15 min；上述溶液中加入300μL结合缓冲液充分混匀，立即进行流式细胞仪检测。

1.2.6 不同渥曼青霉素浓度下PRNP基因的转录量检测 在对数生长期的DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1细胞中加入渥曼青霉素使其终浓度分别为0、10、20、50、100 nmol·L-1，作用24 h后，收集细胞提取总RNA。利用本实验室建立的鸡PrPC基因mRNA定量RT-PCR检测方法，检测PRNP基因mRNA表达量［13］。

1.2.7 统计学分析 采用SPSS17.0软件One-Way分析（Anova）或t检验进行统计学处理，数据以±s表示，P＜0.05，P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 渥曼青霉素以剂量依赖方式抑制DF-1-PrP细胞黏附

细胞黏附试验结果如表1所示，渥曼青霉素浓度为0 nmol·L-1时，各细胞黏附率均最高，且DF-1-Pr P细胞黏附率比DF-1-NC细胞和DF-1细胞分别高26.04%和26.18%，差异极显著（P＜0.01），随着渥曼青霉素浓度的升高，各细胞的黏附率均显著下降。渥曼青霉素浓度10～50 nmol·L-1时，DF-1-Pr P细胞黏附率极显著（P＜0.01）高于DF-1和DF-1-NC细胞；100 nmol·L-1时，DF-1-Pr P细胞黏附率显著（P＜0.05）高于DF-1和DF-1-NC细胞；渥曼青霉素浓度达到200 nmol·L-1时，DF-1-PrP、DF-1-NC和DF-1细胞的黏附率无显著差异；当渥曼青霉素浓度200 nmol·L-1时，3种细胞的黏附率分别被抑制了87.46%、72.65%和84.32%。

2.2 渥曼青霉素以剂量依赖方式抑制DF-1-Pr P细胞侵袭

细胞侵袭试验结果如表2所示，渥曼青霉素浓度为0 nmol·L-1时，各细胞的侵袭穿膜细胞数最多，其侵袭力最强，随着渥曼青霉素浓度的升高，细胞的侵袭力显著下降，但同一渥曼青霉素浓度下DF-1-Pr P细胞侵袭穿膜细胞数显著高于DF-1-NC和DF-1细胞（P＜0.05或P＜0.01）。当渥曼青霉素浓度高于100 nmol·L-1时，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1细胞均不见侵袭穿膜细胞。

表1 不同浓度渥曼青霉素对细胞黏附率的影响Table 1 Effects of different concentration wortmannin（WM）on cell adhesion rates %

表2 不同浓度渥曼青霉素对细胞侵袭（侵袭细胞数）的影响Table 2 Effects of different concentration wortmannin on cell invasion（Cell numbers of invasion）

2.3 渥曼青霉素以剂量和时间依赖方式抑制DF-1-Pr P细胞增殖

应用MTT法检测细胞的增殖，结果显示（图1），不加渥曼青霉素时，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1细胞增殖活性均高于其渥曼青霉素处理的增殖活性；随着渥曼青霉素浓度的增加和作用时间的延长，增殖抑制作用明显增强，呈现明显的时效和量效关系。同时在渥曼青霉素浓度低于50 nmol·L-1时，DF-1-Pr P细胞具有抗渥曼青霉素的能力，与DF-1-NC和DF-1细胞相比有统计学差异（P＜0.01）；而当渥曼青霉素浓度大于50 nmol·L-1时其几乎完全抑制了各细胞的增殖。

图1 不同渥曼青霉素浓度对细胞增殖的影响Fig.1 Effects of different concentration wortmannin on cell proliferation

2.4 渥曼青霉素以剂量依赖方式促进DF-1-Pr P细胞凋亡

细胞经Annexin-V-FITC／PI双染后流式细胞仪检测，结果显示（图2），在无渥曼青霉素处理时，DF-1-Pr P细胞总凋亡率（5.96%）低于DF-1-NC细胞（10.27%）和DF-1细胞（13.85%）。随着渥曼青霉素浓度的增加，各细胞的总凋亡率均升高，而且呈现一定的剂量效应关系；渥曼青霉素浓度低于20 nmol·L-1以下时，对各细胞的凋亡率影响较小，当渥曼青霉素浓度高于50 nmo·L-1时，渥曼青霉素浓度对各细胞的凋亡率影响非常大。在同一渥曼青霉素浓度下，DF-1-PrP细胞的凋亡率低于DF-1-NC和DF-1细胞；尤其渥曼青霉素浓度为100、200 nmol·L-1时，DF-1-NC和DF-1细胞几乎全部凋亡，但DF-1-Pr P细胞仍有56.63%和15.54%的细胞存活，具有抗渥曼青霉素的能力。

图2 不同浓度渥曼青霉素对细胞凋亡的影响Fig.2 Effects of different concentration wortmannin on cell apoptosis

2.5 不同渥曼青霉素浓度下PRNP基因的转录量分析

利用本实验室建立的鸡PRNP基因m RNA实时荧光定量RT-PCR检测方法，检测DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1细胞PRNP基因转录水平表达量，结果显示（图3），加入渥曼青霉素时各细胞PRNP基因的mRNA拷贝数均出现变化；随着渥曼青霉素浓度的增加，PRNP基因的mRNA拷贝数呈现出下降的趋势。在同一渥曼青霉素浓度下，DF-1-PrP细胞PRNP基因的mRNA拷贝数均显著高于DF-1-NC和DF-1细胞。

图3 不同浓度渥曼青霉素对PRNP基因mRNA拷贝数的影响Fig.3 Effects of different wortmannin concentration on mRNA copy number of PRNP

3 讨 论

Akt的活性与抗细胞凋亡以及细胞生长、增殖和能量代谢有关。在肿瘤细胞中Akt的表达量较正常细胞高，有加速白血病细胞增殖和抑制细胞程序性死亡的作用［14］，激活Akt还可改变细胞迁移和侵袭，提高卵巢肿瘤细胞的侵袭能力［15］。敲除小鼠的PrPC基因可明显降低p-Akt表达量，加剧脑缺血后的神经损伤［16］。Pr PC和p-Akt在胃癌组织中协同表达，p-Akt有可能在Pr PC介导的胃癌恶性表型中发挥作用［17］。但鸡细胞型朊蛋白的生理功能及其机制还未见报道，为此作者构建了Ch Pr PC过表达的鸡成纤维细胞系DF-1-Pr P及空载体细胞系DF-1-NC。本试验中，作者应用PI3K／Akt抑制剂渥曼青霉素阻断该信号通路，探讨其对Pr PC介导的细胞增殖、黏附、侵袭和凋亡过程的影响。结果显示，渥曼青霉素浓度为0 nmol·L-1时，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1细胞的增殖、黏附、侵袭能力均最高，总凋亡率均最低；且DF-1-Pr P细胞增殖、黏附、侵袭能力均高于DF-1-NC细胞和DF-1细胞，而总凋亡率却低于DF-1-NC细胞和DF-1细胞，差异显著（P＜0.05），说明ChPrPC的过量表达可促进DF-1-Pr P细胞增殖、黏附、侵袭，抑制其凋亡，这和PrPC在哺乳动物中的功能相似［7］。随着渥曼青霉素浓度的增加，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1细胞各自的PRNP基因mRNA表达量均减少，其增殖、黏附、侵袭能力相应下降，而总凋亡率均升高，且呈现一定的剂量效应关系，这证实了文献报道的PI3K／Akt信号转导通路是调节细胞存活最重要的途径之一［18］，ChPrPC至少部分是通过PI3K／Akt信号通路对DF-1细胞的增殖、黏附、侵袭和凋亡进行调节的。但在低于100 nmol·L-1的同一渥曼青霉素浓度下，DF-1-Pr P细胞增殖、黏附、侵袭能力始终高于DF-1-NC细胞和DF-1细胞，而总凋亡率均低于DF-1-NC细胞和DF-1细胞，差异显著（P＜0.05），说明ChPrPC的过量表达具有抗渥曼青霉素的能力。尤其在流式细胞术检测细胞凋亡的试验中，渥曼青霉素浓度为100和200 nmol·L-1时，DF-1-NC和DF-1细胞几乎全部凋亡，但DF-1-Pr P细胞仍有56.63%和15.54%的细胞存活，提示ChPrPC还可通过其他途径调节DF-1细胞的凋亡。

T.W.Poh等研究渥曼青霉素对PI3K／Akt信号通路的作用，结果表明渥曼青霉素能负调控PI3K／Akt信号通路中的多种分子，包括PI3K和m TOR，使Akt去磷酸化从而下调Akt激酶活性［18-19］。作者采用实时荧光定量RT-PCR法检测发现，随着渥曼青霉素浓度的增加，DF-1-Pr P、DF-1-NC和DF-1细胞中PRNP基因mRNA表达量均减少，而在同一渥曼青霉素浓度下，DF-1-Pr P细胞中PRNP基因mRNA表达量均高于DF-1-NC细胞和DF-1细胞，表明Akt基因表达量与PRNP基因表达量相关联，Akt对PrPC可能存在反馈调节，但其机制尚不明确。

总之，ChPrPC的过量表达可促进DF-1细胞增殖、黏附和侵袭，抑制其凋亡；渥曼青霉素以剂量依赖方式抑制DF-1细胞中PRNP基因mRNA表达及其细胞的增殖、黏附和侵袭，诱导其凋亡，表明PI3K／Akt信号通路可能在Ch Pr PC介导DF-1细胞增殖、黏附、侵袭和凋亡过程中具有重要的作用。Ch Pr PC的过量表达可抗渥曼青霉素引起的细胞凋亡，提示PI3K／Akt信号通路并不是ChPrPC调节细胞凋亡的唯一途径。本研究结果为进一步阐明ChPrPC生理功能的分子机制奠定基础。

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