CD8α在雄性牦牛主要免疫器官的分布

张 倩，杨 琨，黄玉风，潘阳阳，余四九，何俊峰，刘鹏刚，崔 燕

（甘肃农业大学动物医学院，兰州730070）

牦牛（Bos grunniens）被誉为高原之舟，生活在海拔3 km以上的青藏高原，高寒、缺氧及强辐射是高原地区最主要的应激因子，应对这些生态压力，牦牛机体免疫和健康状况发挥至关重要的作用。流行病学调查表明，牦牛疫病主要为细菌性传染病和寄生虫病，呈散发性发生，治疗后未形成流行［1-3］。牦牛具有较好的抗寒抗病能力，因此对其免疫器官研究具有特殊的意义和价值。胸腺为机体中枢免疫器官，是T淋巴细胞的发育、成熟的场所［4-5］。脾、淋巴结及血结为次级免疫器官，是T细胞免疫应答反应发生的场所［6-8］。本课题组前期对牦牛胸腺及脾的增龄性形态特征进行了初步研究［9-10］。有学者报道牦牛血结微细结构与脾更相似［11］，有关牦牛免疫器官内相关免疫活性分子及细胞仍未见报道。

CD8分子最初发现于鼠类［12］，是细胞毒性T细胞（CTL）重要的表面标记物，一般以二聚体形式：αα同型和αβ异型存在于细胞表面［13-14］。CD8分子通过α链可稳定CTL与靶细胞结合，参与CTL活化信号转导和胸腺细胞阳性选择过程，β链一般不直接参与CD8分子生物功能，而是辅助α链完成有效信号转导的发生［15］。CD8α＋CTL通过其TCR识别靶细胞表面抗原肽-MHCI类分子复合物，介导人和动物机体抗胞内寄生菌、病毒、某些真菌感染以及抗肿瘤，具有CTL表位的疫苗能诱导机体产生有效的保护性免疫应答［16-17］。对生理条件下，牦牛以CD8α＋T淋巴细胞为主的T细胞亚群进行组织分布研究及定量检测，将为揭示传染病的致病与免疫机理以及研制安全高效疫苗提供重要的理论指导和评价依据。CD8分子在免疫器官的数量及分布研究主要集中在牛［18-19］、羊［20］、兔［21］、猫［22］、袋鼠［23］等动物，有关牦牛CD8分子研究未见报道。

本研究采用RT-PCR法克隆牦牛CD8α基因序列，通过实时荧光定量PCR、Western blot及免疫组织化学SP法对成年牦牛胸腺、脾、肠系膜淋巴和血结内CD8αm RNA及蛋白的表达进行分析，初步了解成年雄性牦牛的机体免疫状态及其抵抗病原体（细菌、病毒及寄生虫）的主动防御能力，以期为适时免疫、致病机理和疾病防治等研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

2014年9月中旬在青海西宁屠宰场采集3岁成年健康雄性牦牛胸腺、脾、位于空肠的肠系膜淋巴结及血结，各5头份。部分放入4%中性多聚甲醛，用于石蜡切片免疫组化。部分迅速放入液氮中过夜，次日移至-80℃冰柜中保存，以备下一步提取组织中的RNA和蛋白质。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 牦牛CD8α基因测序引物（yak CD8α）根据GenBank登录的黄牛（Bos taurus，BC151259.1）、印度水牛（Bubalus bubalis，XM＿006074749.1）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii，XM＿005954881.1）、绵羊（Ovis aries，XM＿004007263.1），用Primer Premier 5.0软件设计，根据测序所得牦牛CD8α（KP030823.1）和牦牛β-actin（DQ838049）内参基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量引物，由TaKaRa公司合成（表1），序列分析使用NCBI中的BLAST［24］、MEGA5［25］和DNAman［26］软件。

1.2.2 mRNA的提取，反转录cDNA及PCR扩增按照TRIzol（Invitrogen）总RNA抽提试剂说明书提取各免疫器官总RNA。根据Invitrogen公司的Super Script TMⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒说明书反转录成cDNA。PCR反应体系为20μL（模板1μL，上下游引物各0.5μL，Taq PCR Master Mix 10μL，无菌去离子水8μL。反应结束后，取10μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，紫外灯下观察，凝胶成像系统采集图像。DNA胶回收试剂盒（TaKaRa）回收PCR产物片段，回收产物送华大基因公司测序。

表1 PCR扩增引物和荧光定量PCR引物Table 1 PCR primers used in the RT-PCR and real-time RT-PCR

1.2.3 实时荧光定量PCR检测免疫器官内CD8α mRNA表达 使用罗氏荧光定量PCR Lightcycler 480仪器进行。定量PCR反应体系：SYBR Premax Taq（TaKaRa）10μL、上下游引物各0.5 μL、c DNA样品1μL和灭菌超纯水8μL。定量PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，62℃退火10 s，72℃延伸15 s，共45个循环；95℃5 s，65℃1 min，40℃30 s。每个循环的退火及延伸阶段采集荧光信号数据。扩增结束后，立即进行熔解曲线分析，系统自动分析数据后生成熔解曲线，以确定样品扩增的特异性。根据荧光定量PCR给出的Ct值和标准曲线中的扩增效率计算出定量结果，所得结果采用定量分析软件进行分析，目的基因与内参基因扩增效率接近，为100%±5%，荧光定量PCR表达量用2-ΔΔCt法进行分析［27］。每管样品设4个重复。

1.2.4 Western blot方法检测免疫器官内CD8α蛋白水平表达 采取的胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结组织在液氮中研磨后，按1 m L RIPA＋10μL PMSF·（100 mg）-1（Solarbio）的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），匀浆约30 min。4℃1 200 g离心5 min，收集上清，用BCA法测定蛋白的含量。调整蛋白浓度，按比例加入4×SDS上样缓冲液（Solarbio），沸水煮约10 min，使蛋白变性。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样量为10 μL，当蛋白跑至分离胶，电压由80 V切换为100 V直至电泳结束。用300 m A的电流在4℃冰箱内电泳1～2 h，将蛋白转至PVDF（Solarbio）膜。再以5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入一抗小鼠Anti-CD8（1／200）（MCA837GA，Ab D Serotec）及小鼠Anti-Actin（I-19，Santa Cruz）4℃孵育过夜，PBS洗后分别加入二抗羊抗鼠（sp-0024，Bioss）37℃孵育2 h。加入ECL曝光液（碧云天）显色5～10 min观察结果，以β-actin为内参照。通过ImageJ软件分析WB条带的灰度值，进而得出蛋白的相对表达量。

1.2.5 免疫组化方法检测免疫器官内CD8α蛋白水平的表达 石蜡切片脱蜡至水，0.03%H2O2孵育10 min以封闭内源性过氧化物酶，按免疫组织化学SP法程序进行染色。一抗小鼠Anti-CD8（MCA837GA，Ab D Serotec）按1／50稀释，4℃冰箱孵育过夜，二抗室温孵育10 min，SABC复合物室温孵育10 min（Solarbio）。以上各步骤之间均用0.01 mol·L-1PBS，p H 7.3洗3 min×3次。AEC显色30 min，脱水，透明，中性树胶封片。应用Olympus-71型光学显微镜观察并照相。阴性对照用BSA取代一抗进行孵育，其余步骤、条件均相同。

1.2.6 统计分析 试验组数据采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。使用SPSS 21.0统计软件进行数据处理。全部数据均用“±SE”表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结 果

2.1 RT-PCR及实时荧光定量PCR

分别提取牦牛胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结组织总RNA。扩增得到包含CD8α编码区序列的PCR产物长度为970 bp提交至GenBank（KP030823.1），CD8α荧光定量引物扩增产物长度为213 bp，内参β-actin荧光定量引物扩增产物长度为207 bp（图1）。使用DNAman软件分析可知牦牛CD8αm RNA的编码区为13～741 bp，全长729 bp，编码243个氨基酸。将牦牛CD8α蛋白与其他物种CD8α的氨基酸序列进行多重比对，显示与黄牛（Bos taurus）同源性最高，为99.7%，与印度水牛（Bubalus bubalis）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii）、山羊（Capra hircus）、绵羊（Ovis aries）、宽吻海豚（Tursiops truncatus）、野猪（Sus scrofa）、单峰驼（Camelus dromedarius）的同源性分别为96.9%、94.1%、92.3%、86.8%、80.6%、72.5%和71.6%（图2，图3）。

实时荧光定量PCR结果显示：CD8αm RNA在牦牛胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结均有表达；且在胸腺相对表达量最高，分别是脾、血结及肠系膜淋巴结的6.13倍、8.23倍和40.71倍（P＜0.01）（图4A）。

图1 RT-PCR反应结果Fig.1 The results of RT-PCR

图2 独立元素法构建牦牛CD8α基因进化树Fig.2 The phylogenetic tree of yak CD8αwas constructed by independent element method

图3 牦牛CD8α蛋白与其他物种氨基酸序列的多重比对Fig.3 The multiple alignment of amino acid sequences of yak CD8αwith other species

2.2 Western blot结果

分别提取牦牛胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结总蛋白，调整各组蛋白浓度后进行Western blot。结果表明CD8蛋白在牦牛各淋巴组织均有表达，且在胸腺相对表达量最高，分别是脾、血结及肠系膜淋巴结的2.64倍、3.75倍和10.82倍（P＜0.01）（图4B，4C）。

2.3 组织结构观察及免疫组织化学结果

胸腺CD8＋细胞在皮质、髓质都有分布（图5A）；脾CD8＋细胞主要分布在动脉周围淋巴鞘和红髓，脾小结周边及内部也有部分阳性细胞（图5B）；肠系膜淋巴结内，CD8＋细胞主要分布在淋巴小结周边及髓质，淋巴小结内部有少量分布（图5C）；血结内分布情况与肠系膜淋巴结类似，CD8＋细胞主要分布在淋巴小结周边及髓质，淋巴小结内部有少量分布（图5D）。

3 讨 论

对牦牛CD8α序列测序结果显示其编码区全长为729 bp，编码243个氨基酸。将所得序列与Gen-Bank中其他物种氨基酸序列进行多重比对，显示牦牛与黄牛氨基酸序列同源性最高，其次为印度水牛、藏羚羊、山羊、绵羊、宽吻海豚、野猪，与单峰驼同源性最低。结果表明CD8α在同属种动物间同源性较高，牦牛其他免疫蛋白是否也存在相似的同源性有待研究。

图4 CD8αmRNA及蛋白在牦牛免疫器官的表达Fig.4 The expression of CD8αmRNA and protein in yak immune organs

实时荧光定量PCR结果和Western blot结果显示，在牦牛胸腺、脾、肠系膜淋巴结及血结内，均有CD8αmRNA和蛋白的表达，说明在正常生理条件下，CD8α基因和蛋白广泛表达于牦牛各免疫器官；CD8αm RNA和蛋白的相对表达量在牦牛胸腺中最高，脾、血结次之，肠系膜淋巴结最低，表明CD8α基因和蛋白的表达在牦牛各组织器官中存在差异，这与W.Zhang等［19］对周边免疫器官研究结果相符，即CD8蛋白在脾表达量高于血结，肠系膜淋巴结最低。推测这种差异性可能由于胸腺是负责T淋巴细胞分化和成熟的中枢免疫器官，CD4-CD8-前T细胞从骨髓或肝脏进入胸腺皮质，进行阴性和阳性选择，之后转化为CD4＋CD8＋表型，最后约5%T细胞经过受体重排，转化为成熟CD4＋或CD8＋T细胞，向血液及其他淋巴组织（如淋巴结、脾及黏膜相关淋巴组织）迁移［28］。因此，大量不成熟 的双阳性CD4＋CD8＋及成熟单阳性CD8＋T淋巴细胞的共同存在，使胸腺细胞CD8表达量较高。另外，本研究结果显示CD8αmRNA和蛋白在血结与脾表达量高于肠系膜淋巴结，这与前人对牛［19，29］、羊［30］的研究结果相似。这种差异可能由于脾和血结是分布在血液循环通路上的免疫器官，而淋巴结分布在淋巴循环通路上，T淋巴细胞表达不同的趋化因子及其受体。CD8αmRNA和蛋白在血结的表达量与脾极为相似，但显著高于肠系膜淋巴结，另外，W.Zhang等学者研究表明，在血结内免疫分子CD4及MHC II的表达量均高于脾［19］，提示血结可能与脾和肠系膜淋巴结一样，在细胞免疫方面发挥重要作用。

免疫组化试验结果表明，在正常生理条件下，胸腺CD8＋细胞在皮质、髓质都有分布，这与前人的研究结果类似［18，23］。另外，在脾CD8＋细胞主要分布在动脉周围淋巴鞘和红髓髓索；肠系膜淋巴结内分布情况与血结类似，CD8＋细胞主要分布在淋巴小结周边及髓质。这与前人对不同动物CD8＋细胞在次级免疫器官分布的研究结果相似［18，21，23］，即阳性细胞主要分布在T细胞依赖区：动脉周围淋巴鞘及红髓、淋巴结小结周边及淋巴索。推测这些位置可能是抗原捕获发生的主要部位，CD8＋T细胞主要在此执行杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞的特异性杀伤效应。另外，本研究还发现，少量CD8＋细胞分布在脾、肠系膜淋巴结及血结的生发中心，这与 W.Zhang［19］等及B.H.Thorp等［20］结论不一致，他们认为次级免疫器官的生发中心无CD8阳性表达，这个有争议的结果可能与抗体特异性相关，也可能由于动物机体在应对不同外来抗原（寄生虫、细菌及病毒）时所处的免疫状态有差异而致。另外资料显示，次级淋巴器官的淋巴滤泡内分布有一定数量树突细胞，并且这种树突细胞表面携带CD8标记物［31］，这与本研究的结果相似。

4 结 论

本研究结果显示，CD8αm RNA及蛋白在雄性牦牛各免疫器官中均有表达，且在胸腺表达量最高，脾、血结次之，肠系膜淋巴结表达量最低（P＜0.01）。免疫组织化学结果显示，CD8＋T细胞在胸腺皮质、髓质均有分布；在脾主要分布在动脉周围淋巴鞘和红髓髓索；在肠系膜淋巴结及血结内，则主要分布在淋巴小结周边及髓索。以上结果提示，牦牛胸腺为CD8＋T细胞主要的输出器官，其输出量可能影响次级淋巴器官内T细胞含量；血结可能与淋巴结及脾一样，在细胞免疫发挥同等重要的作用。这些数据将为牦牛免疫遗传学和免疫生物学等相关研究奠定基础。

图5 CD8在牦牛免疫器官表达的免疫组织化学结果200×Fig.5 Immunohistochemistry of CD8 in yak immune organs 200×

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