黄芪多糖和甲砜霉素影响ALV-J对SPF鸡致病性的分析

王广文，吕 林，王 超，张振东，程子龙，屈亚锦，刘思当＊

（1.山东农业大学动物科技学院，泰安271018；2.泰安出入境检验检疫局，泰安271018）

禽白血病／肉瘤（avian leukosis，AL）是由反转录病毒科禽白血病／肉瘤病毒群（ALV／SV）引起禽类多种肿瘤性疾病的总称［1］。其中对我国养禽业危害最严重的是由J亚群白血病病毒（ALV-J）引起的多种肿瘤性疾病。目前，对该病尚无可用的商品化疫苗，也无特效防治药物，只能通过种鸡群的净化来防控。崔治中等［2］研究表明我国从2011年起对蛋用型祖代鸡场进行净化，使得ALV-J在商品代蛋鸡中的感染率和发病死亡率迅速下降，但我国选育的黄羽肉种鸡的J亚群白血病日趋严峻，更严重的是该病又进一步向我国地方品种鸡群［3-6］蔓延。若对感染发病率较高的地方品种鸡群采用严格检疫淘汰程序，大多数公司经济实力可能无法承受净化的成本和代价，若能寻求一种减轻感染的辅助方法（如药物预防），协助鸡群的净化，将对地方品系鸡群的净化具有莫大帮助。

黄芪多糖是一种中药提取剂，具有多种生物学功能。黄芪多糖在动物肿瘤模型防治研究中表现出很好的抗肿瘤活性，如小鼠乳腺癌［7］、H22肝癌小鼠移植瘤［8］等，且在人医临床用于癌症患者的治疗中也收到了满意的效果［9-10］。我们前期试验研究表明黄芪多糖在0.003 9～0.062 5 mg·m L-1安全浓度范围内，在DF1细胞上能明显抑制ALV-J P27的表达［11］，但其在鸡体内抗禽白血病致瘤作用未见报道。

甲砜霉素是第二代氯霉素类药物，在临床上被广泛用于育雏鸡沙门菌病、大肠杆菌病及支原体病的防治。有研究表明氯霉素能抑制造血功能，体外试验能诱导白血病细胞系凋亡，有人将氯霉素用于人白血病的防治，并取得良好疗效［12］。另外，尽管甲砜霉素不像氯霉素能产生再生障碍性贫血。但甲砜霉素具有与氯霉素相同的不良反应，即抑制造血、免疫功能［13］。甲砜霉素对ALV-J的致瘤作用是抑制还是促进，有待于试验验证。本研究拟验证育雏期应用上述两种药物对雏鸡先天感染ALV-J致肿瘤发生的影响，以寻求净化该病的辅助性防制药物并考量肿瘤诱发因素的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

ALV-J NX0101株由崔治中教授惠赠；禽白血病P27抗原ELISA检测试剂盒购自IDEXX公司；批号：99-09254-FH050、99-09254-AJ999；DMEM培养基购自Invitrogen公司，新生牛血清购自北京元亨金马生物技术开发有限公司；黄芪多糖溶液（含量106.3 mg·g-1）由生泰尔公司提供，甲砜霉素（含量99.1%）由浙江润康药业有限公司提供；SPF鸡胚购自济南SPF鸡场。

1.2 动物试验

将1 000 TCID50ALV-J NX0101毒株接种6日龄SPF鸡胚，100μL·胚-1，SPF鸡出壳后，随机分为3组，每组35只，在隔离罩内饲养，全价颗粒饲料由泰安六和公司提供。3组试验鸡于16日龄时滴鼻免疫新城疫弱毒疫苗。

1.3 用药程序

第1、2组于1～5、11～15、21～25 d，在雏鸡饮水中分别加入黄芪多糖（100 mg·L-1）、甲砜霉素（100 mg·L-1），连用3个疗程。第3组：饮水中不加入任何药物，作为对照。

1.4 检测指标

分别于6、16、26、42、60、90、120 d，每组取15只，称重，采集泄殖腔棉拭子，用IDEXX试剂盒检测ALV-J P27抗原，采促凝血和抗凝血分别检测ALV-J抗体、新城疫抗体以及病毒血症。然后每组取3只，剖检，观察眼观病变。取骨髓、心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、胸腺等器官组织，于10%福尔马林溶液固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察病理组织学病变。

分别于6、26、42、60、120 d，每组取5只，采集抗凝血做血常规检测。

于42 d时，每组分别剖杀5只鸡，称量脾和法氏囊的重量，计算免疫器官指数。

2 结 果

2.1 ALV-J接种SPF鸡胚出壳率

分别于第5天通过卵黄囊接种1 000 TCID50ALV-J，每胚0.1 m L，共计200枚鸡胚。21 d后出壳率达60%左右，但是雏鸡不易出壳，体质较弱，许多雏鸡能啄壳，但出不了壳，需要人工辅助出壳，最后孵出健康雏鸡105只，每组35只。

2.2 药物对雏鸡先天性感染ALV-J新城疫抗体的影响

在16 d滴鼻免疫新城疫弱毒疫苗，于免疫后的第8、16、24、42及74天采集血清样品进行新城疫抗体检测，对各日龄所得抗体效价结果进行单因素方差分析后发现，在免疫后第8—42天各组间抗体水平差异不显著（P＞0.05），后期抗体水平均逐渐下降，到免疫后74天，各组新城疫抗体滴度均降至0（图1）。

2.3 药物对雏鸡先天性感染ALV-J泄殖腔排毒规律的影响

从图2中可以看出，三组泄殖腔排毒呈现不同的变化规律。黄芪多糖组在第三次用药后（26 d）出现突然性的下降，阳性率为45%（9／20），均低于甲砜霉素组和病毒对照组，但在之后检测中发现，泄殖腔排毒又维持在较高的水平，阳性率最高时可达100%（14／14）。甲砜霉素组泄殖腔排毒规律呈现“波浪型”模式，整个试验过程中阳性率均高于55%，基本上维持在70%～85%。病毒对照组刚开始时泄殖腔排毒率较低（35%）。在整个试验过程中排毒规律呈现上升的趋势，到后期时各组排毒规律基本一致。

图1 两种药物对雏鸡先天性感染ALV-J NDV HI抗体滴度的影响Fig.1 The influence of two drugs on the ND HI antibody level of SPF chicken with ALV-J congenital infection

图2 两种药物对雏鸡先天性感染ALV-J泄殖腔排毒规律的影响Fig.2 The influence of two drugs on cloaca detoxification of SPF chicken with ALV-J congenital infection

2.4 药物对雏鸡先天性感染ALV-J病毒血症以及抗体水平的影响

黄芪多糖组、甲砜霉素组和病毒对照组在整个试验过程中病毒血症基本上全为阳性。ALV-J抗体阳性鸡只最早在42日龄出现在病毒对照组（1／15），在随后检测时间点各组均出现1～2只ALV-J抗体阳性鸡（表1）。

2.5 药物对雏鸡先天性感染ALV-J免疫器官的影响

在6周龄时对三组鸡进行称重，采样后剖杀，分别采集脾和法氏囊，并计算免疫器官指数，统计学分析表明：甲砜霉素组脾和法氏囊器官指数均低于黄芪多糖组和病毒对照组，以法氏囊器官指数的降低尤其明显（图3），差异极显著（P＜0.01）。

表1 两种药物对雏鸡先天性感染ALV-J的病毒血症及ALV-J抗体的影响Table 1 The influence of two drugs on viremia and ALV-J Ab of SPF chicken with ALV-J congenital infection

图3 两种药物对雏鸡先天性感染ALV-J免疫器官发育的影响Fig.3 The influence of two drugs on immune organs of SPF chicken with ALV-J congenital infection

2.6 药物对雏鸡先天性感染ALV-J体重的影响

分别在6、16、26、42、60、90、120 d对各组鸡进行称重，数据统计分析。甲砜霉素组的体重在16 d时高于黄芪多糖组和病毒对照组，差异显著（P＜0.05），在26 d时体重也高于另外两组，但是差异不显著（P＞0.05），后期低于其他两组，但只在60日龄时差异显著（P＜0.05）。而病毒对照组和黄芪多糖组在整个试验过程中体重差异不显著（P＞0.05）（表2）。

2.7 药物对雏鸡先天性感染ALV-J致肿瘤的影响

试验鸡经定期剖杀剖检和病理组织学检测诊断，肿瘤病变最早见于52日龄黄芪多糖组，其他组均见于60日龄之后，肿瘤发生统计结果表明，甲砜霉素组肿瘤发生率最高，达28.57%（10／35），其次是病毒对照组20%（7／35），黄芪多糖组最低11.43%（4／35）（表3）。另外，甲砜霉素组出现的肿瘤类型最多，有血管瘤（图5，A1、A2、A3）、髓样细胞瘤（图5，B1、B2、B3）、纤维肉瘤和腺癌（图5，C1、C2、C3）、淋巴肉瘤（图5，D1、D2、D3），并且该组患鸡病程进展快，病变程度重。在各组中最常见的肿瘤类型是淋巴肉瘤（表3）。

表2 两种药物对雏鸡先天性感染ALV-J体重的影响（±s）Table 2 The influence of two drugs on weight of SPF chicken with ALV-J congenital infection（±s）

表2 两种药物对雏鸡先天性感染ALV-J体重的影响（±s）Table 2 The influence of two drugs on weight of SPF chicken with ALV-J congenital infection（±s）

同列数据后所标字母相异表示差异显著（P＜0.05），所标字母相同表示差异不显著（P＞0.05）Different letters in the same list means significant difference between the treatments（P＜0.05），same letter in the same row means not significant difference between treatments（P＞0.05）

组别Groups日龄／d Days 8 16 26 42 60 90 120黄芪多糖组Astragalan 0.048±0.005a 0.088±0.014a 0.16±0.03a 0.27±0.08a 0.55±0.12a 0.85±0.20a 0.97±0.19a甲砜霉素组Thiamphenicol 0.050±0.008a 0.099±0.012b 0.18±0.03a 0.30±0.05a 0.46±0.10b 0.82±0.20a 0.86±0.14a病毒对照组Virus 0.050±0.009a 0.089±0.018a 0.17±0.04a 0.30±0.08a 0.54±0.16a 0.85±0.25a 0.94±0.20a

表3 两种药物对雏鸡先天性感染ALV-J致瘤性影响Table 3 The tumorigenicity of SPF chicken with ALV-J congenital infection

图4 黄芪多糖组肝肿瘤病变Fig.4 The liver lesion of autopsy and histopathological examination in the astragalan group

图5 甲砜霉素组肿瘤病变Fig.5 The lesion of autopsy and histopathological examination in the thiamphenicol group

2.8 药物对雏鸡先天性感染ALV-J血细胞指标的影响

在1到5日龄连续用药5 d后，黄芪多糖组的白细胞总数和淋巴细胞总数均比另外两组高，而甲砜霉素组的白细胞总数和淋巴细胞总数显著低于另两组，在第三次用完药后，各组之间白细胞总数和淋巴细胞总数差异不明显（图7）。

3 讨 论

自J亚群白血病被发现以来，国内外众多学者对该病进行了大量研究，包括该病的病原学［14］、流行病学［15-16］、致瘤机制［17］和诊断方法［18-19］等方面，但是目前尚无有效防制该病的疫苗或药物，只能通过种群净化。鉴于我国鸡的养殖数量大，品种多，该病感染重，短期内难以实现全部净化，寻找净化辅助药物具有特殊意义。黄芪多糖提取于中药材黄芪，能增强机体的细胞及体液免疫，促进免疫器官的发育［20-21］，还具有直接协助机体抗肿瘤作用［7-10］。前期体外试验［11］结果表明0.003 9～0.062 5 mg·m L-1的黄芪多糖可以抑制ALV-J在DF1细胞内的复制。本试验中，黄芪多糖组早期白细胞总数和淋巴细胞总数均比另外两组高，虽然黄芪多糖组在体重和新城疫抗体水平与病毒对照组无显著差异，但是该组的肿瘤发生率（4／35）比病毒对照组（7／35）低，说明黄芪多糖虽然不能完全抑制ALV-J导致的肿瘤发生，但对ALV-J的致瘤作用具有一定的防制效果。可以用于育雏鸡的保健，尤其是用于白血病未净化鸡群的保健。

图6 病毒感染对照组肿瘤病变Fig.6 The lesion of autopsy and histopathological examination in the positive group

图7 血常规中白细胞（A）和淋巴细胞（B）数检测结果Fig.7 The results of leukocyte detection（A）and lymphocyte detection（B）

甲砜霉素是第二代氯霉素类抗生素，虽然已消除氯霉素所导致的再生障碍性贫血（白血病）。但仍具有与氯霉素相同的不良反应，即免疫抑制及影响造血功能［13］。在1～5日龄连续用药5 d后，与另外两组相比，该药能显著降低血液中的白细胞和淋巴细胞的含量。42日龄时免疫器官（脾和法氏囊）指数显著降低，尤其是对法氏囊的抑制作用极为明显。甲砜霉素组前期体重比另外两组高，这可能与甲砜霉素作为抗生素具有抑制大肠杆菌等病原菌感染及促生长作用有关，但是60 d之后甲砜霉素组的平均体重则显著低于黄芪多糖组和病毒对照组，这可能与甲砜霉素的免疫抑制作用，造成雏鸡抵抗力下降，肿瘤发生率显著升高有关。甲砜霉素组的肿瘤发生率（10／35）明显高于另外两组，肿瘤类型多，可见血管瘤、髓样细胞瘤、淋巴肉瘤、纤维肉瘤和腺癌。另外，该组肿瘤病程进展快，病变程度也更加严重，这些都充分说明甲砜霉素对ALV-J的致瘤作用具有明显的促进作用。该试验也进一步说明尽管白血病的发生主要与ALV感染有关，但许多诱发因素对肿瘤的发生也具有重大影响。鉴于在生产中甲砜霉素被广泛应用于育雏鸡的保健，以防治鸡沙门菌、大肠杆菌及支原体感染，因此，该药带来的副作用应引起人们的高度重视，建议2周龄以内的雏鸡不要应用甲砜霉素。

4 结 论

育雏早期应用甲砜霉素会导致雏鸡免疫抑制，促进ALV-J的致瘤作用，患病鸡肿瘤呈多样化。黄芪多糖对ALV-J致肿瘤具有一定的抑制作用，但未发现对病毒血症的影响。

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