金钱草组方对犬草酸钙尿结石形成的影响

何钉玲，胡芳芳，苏永康，邱先帅，肖熹玉，潘家强

(华南农业大学兽医学院，广州 510642)

金钱草组方对犬草酸钙尿结石形成的影响

何钉玲，胡芳芳，苏永康，邱先帅，肖熹玉，潘家强*

(华南农业大学兽医学院，广州 510642)

研究金钱草组方汤剂对试验性犬草酸钙尿结石形成的影响，初步探讨其作用机制。12只雄性中华田园犬随机分为3组，分别为对照组、模型组和治疗组。对照组饲喂基础日粮，模型组和治疗组在饲喂基础日粮的基础上，饮食中添加乙二醇、氯化铵、碳酸钙和维生素D。待试验犬尿液沉渣在显微镜检视野下出现80%的草酸钙结晶后，给治疗组犬灌服金钱草组方汤剂。试验过程中检测试验犬尿液中微量白蛋白(mAlb)含量、N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)活力、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT酶)活力；检测血清中肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、丙二醛(MDA)含量和乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果显示：与模型组相比，金钱草组方汤剂能显著降低治疗组犬尿液中NAG酶和γ-GT酶活力；降低治疗组犬血清中UA、MDA含量和LDH酶活力，提高SOD酶活力。金钱草组方汤剂能有效降低草酸钙结石形成过程对肾功能的损伤，提高血液的抗氧化酶活性，即能有效修复肾细胞损伤，保证肾的作用，防止犬草酸钙尿结石的形成。

犬；金钱草组方；肾功能；草酸钙尿结石；抗氧化

犬尿石症是指犬尿路中无机盐或有机盐类结晶的凝集物，如结石、积石或多量结晶，刺激尿路黏膜而引起泌尿道炎症、阻塞和出血的一种泌尿系统疾病[1～2]。该病是临床高发疾病之一，且复发率较高。近年来，据美国明尼苏达州尿结石中心统计，犬的草酸钙尿结石在所有结石种类中的比例从1981年的5%逐渐上升到2005年的41%，与磷酸铵镁结石(2005年占比为38%)并列成为犬最常见的结石种类[3]。草酸钙肾结石的形成机制复杂，目前认为，结石的形成是尿液不断饱和，由此形成的结晶再经成核、生长、聚集、黏附上皮表面、滞留肾内、晶体—细胞间反应等一系列复杂的步骤。近年来发现，草酸、草酸钙晶体可导致肾上皮和肾间质损伤，而肾上皮损伤在肾结石的形成过程中起着十分重要的作用[4-5]，而间质损伤则是慢性肾病发展和最终肾功能衰竭最重要的危险因素之一。

中药治疗以其无创伤、毒副作用低的特点，在人医临床上被人们广泛接受，临床资料证明以金钱草为主的中药制剂在治疗尿结石疾病方面取得了良好的成效。现代药理研究表明，金钱草化学成分主要有黄酮类化合物、三萜醇配糖体、生物碱、多糖、鞣质、氨基酸及氯化钾等[6]，其中黄酮类化合物为主要成分。近年来发现，黄酮类化合物具有优良的抗氧化性和清除自由基的能力[7]。目前动物试验及体外试验证明氧自由基破坏肾小管及影响肾小管功能是草酸钙结石形成的关键环节[8]，这也是寻找抗氧自由基药物用于防治草酸钙结石的理论依据。本试验研究以金钱草为主的中药复方汤剂对草酸钙尿结石形成的影响，并从减轻肾损伤和抗氧自由基的作用方面初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 中药

金钱草、海金沙、鸡内金、石韦、郁金、金银花、冬葵子、滑石、瞿麦、车前子、徐长卿、乌药、牛膝、益母草、甘草15种中药(购于广州同仁堂药房)。其中按金钱草∶海金沙∶鸡内金∶石韦∶郁金∶金银花∶冬葵子∶滑石∶瞿麦∶车前子∶徐长卿∶乌药∶牛膝∶益母草∶甘草=9∶9∶9∶6∶5∶5∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶1∶2的比例配方。

1.2 试剂

乙二醇、氯化铵和碳酸钙(国产分析纯)，维生素D为饲料级(500万IU·g-1)，均由Kermel公司生产；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、γ-谷氨酰胺转移酶(γ-GT)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；微量白蛋白(mAlb)测定试剂盒，购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3 试验动物

中华田园犬，购于广州市某犬场。

1.4 金钱草组方汤剂质量浓度和剂量的确定

通过小白鼠急性毒性试验，摸索出小白鼠死亡率最低的最大适宜给药质量浓度为2.96 g·mL-1。根据动物之间体表面积换算公式[3]，计算出犬的最佳给药剂量，即对于10 kg的犬，药物质量浓度为2 g·mL-1，应灌胃16 mL·d-1。

1.5 试验犬的分组与饲喂管理

12只1岁左右的雄性中华田园犬(体重约10 kg)，经驱虫、三联疫苗和狂犬疫苗免疫，随机分成3组，分别为模型组、治疗组和对照组，单笼饲养。对照组饲喂基础日粮，基础日粮为依据NRC-1994标准自制的含水量为75%的湿粮，主要成分有新鲜鸡肝、粳米、玉米淀粉、预混料等，主要营养水平如下：粗蛋白质21.5%，代谢能18.34 kJ·g-1，实测含钙1.1%，磷0.5%，镁0.06%，钾0.3%。 模型组和治疗组在基础日粮的基础上，饮食中添加乙二醇0.2 mL·kg-1·d-1、氯化铵0.25 g·kg-1·d-1、维生素D 1 300 U·kg-1·d-1、碳酸钙0.45 g·kg-1·d-1。所有试验犬均按60 g·kg-1·d-1的量分2次饲喂相应的日粮，按15 mL·kg-1·d-1的量分2次饮用清洁水(犬每天的正常需水量为20～70 mL·kg-1[4]，每天从饲料中摄入的水量约为50 mL)，每天均在上午10点和下午5点饲喂犬粮及清洁水。待试验犬尿液沉渣在显微镜检下，视野的80%都出现结晶时，给治疗组犬灌服金钱草组方汤剂(16 mL·d-1，2 g·mL-1)，连续6周。

1.6 样品采集及处理

每天记录犬进食、饮水及排尿情况，观察试验犬的排尿表现及临床症状，每隔7 d分别采集血液和尿液样品。血液置于非抗凝离心管中，3 000 r·min-1离心10 min，分离血清，-20 ℃保存备用。采用自制接尿器收集尿液，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上清，立即测定各项生化指标。

1.7 样品的测定方法

尿液上清mAlb含量、γ-GT酶活力、NAG酶活力和血清SOD酶活性、MDA含量、LDH酶活性、BUN含量、 Crea 含量、UA含量均采用相应的试剂盒进行测定，按试剂盒说明书操作。

1.8 X射线、B超检查

在试验进行的第49天开始，每隔两周进行一次X射线、B超检查(采用华南农业大学动物医院X射线、B超检测仪)。

1.9 尿结石成分分析

将手术取出的结石，用蒸馏水冲洗后晾干，将结石样本喷铂金后，在中山大学测试中心用Quanta 400F 热场环境SCM FEI(美国)进行电镜扫描。

1.10 数据处理

2 结 果

2.1 金钱草组方汤剂对试验犬尿液上清中mAlb含量、NAG酶和γ-GT酶活力的影响

由表1可以看出，试验开始的第0天，各组间尿液上清中mAlb含量、NAG酶和γ-GT酶活力差异均不显著。第21天后，与对照组比较，模型组尿上清mAlb含量、NAG酶和γ-GT酶活力显著增加(P<0.05)，提示模型组犬的肾出现了早期损伤；治疗组尿上清mAlb含量从第28天起、NAG酶和γ-GT酶活力从第35天起，显著低于模型组(P<0.05)，提示该金钱草组方汤剂对肾损伤有一定程度的修复效果。

2.2 金钱草组方汤剂对试验犬血清中LDH酶活力的影响

由表2可以看出，试验开始第0天，各组间血清中LDH酶活力差异不显著。第21天后，与对照组比较，模型组血清中LDH酶活力显著增加，提示模型组引起了肾的早期损伤；治疗组血清中LDH酶活力在第28天及之后均显著低于模型组，且到第56天时，与对照组相比无显著性差异，提示该金钱草组方汤剂对肾损伤有一定程度的修复效果。

2.3 金钱草组方汤剂对试验犬血清中Crea、BUN与UA含量的影响

由表3可知，试验开始第0—21天，各组间血清中UA含量差异不显著。与对照组相比，模型组血清中UA含量在试验第28天及之后显著增加，但维持在正常范围内；治疗组血清中UA含量在试验第35天及之后显著低于模型组，提示金钱草组方汤剂能维持血清中UA含量在正常参考范围内。模型组和治疗组血清中Crea、BUN含量均在正常范围内(44.2～132.6umol·L-1、3.567～9.996mmol·L-1)波动，与对照组相比差异不显著(数据略)。

2.4 金钱草组方汤剂对试验犬血清中SOD活力和MDA含量的影响

由表4可知，试验开始第0天，各组之间血清中SOD活力和MDA含量差异均不显著。第21天后，与对照组比较，模型组血清中SOD活性显著降低，MDA含量显著增加，提示模型组抗氧化能力降低；金钱草复方有效提高了血清中SOD活性，降低了血清中MDA含量，治疗组SOD活性在第28天及之后比模型组显著升高，MDA含量第28天及之后比模型组显著降低，提示该金钱草组方汤剂能提高血清中抗氧化酶活性，保护肾免受损伤。

2.5 各组草酸钙尿结石的发病情况

试验第84天时，模型组犬只经B超检查，有2只试验犬的肾中发现有直径约为3.5mm的结石影像，其中1只犬膀胱中还发现有直径约为1.7mm的结石影像，而对照组和中药治疗组未见结石影像(图1、2)。

2.6 结石扫描电镜

从扫描电镜结果可以看出，结石表面呈典型的锥状突起，与草酸钙结石形貌相符(图3)。

图1 试验第84天模型组犬肾B超图，可见在肾盂有直径约3.5 mm的结石影像Fig.1 The model group picture of canine kidney by B ultrasonic in the day of 84.It has a diameter of 3.5 mm stone in the renal pelvis

图2 试验第84天模型组犬膀胱B超图，可见膀胱内有直径约1.7 mm的结石影像Fig.2 The model group picture of canine bladder by B ultrasonic in the day of 84.It has a diameter of 1.7 mm stone in the bladder

图3 结石扫描电镜观察 800×Fig.3 The picture of stones scanning electron microscopy 800×

3 讨 论

本研究证实，饮食中添加乙二醇、氯化铵、碳酸钙和维生素D能够诱发草酸钙尿结石。试验结果显示，模型动物发生肾损伤，反映肾早期损伤的指标(尿液上清中mAlb含量、NAG酶活性、γ-GT酶活性和血清中LDH酶活性)自第21天后呈逐渐上升趋势，并显著高于对照组；反映肾机能障碍的指标(血清Crea、BUN、UA含量)随着试验的进行，UA含量自第28天后呈逐渐上升趋势，并显著高于对照组，但Crea、BUN、UA含量均基本维持在正常范围内，说明由于试验时间的限制，试验犬并没有出现明显的机能障碍；反映机体抗氧化能力的指标MDA含量和SOD活力，自第21天开始分别高于和低于对照组。给予中药复方汤剂的治疗组，随着试验进行，反映肾早期损伤和肾机能障碍的相关指标逐渐降低，显著低于模型组，说明该中药复方汤剂能降低肾损伤水平，对肾功能损伤具有一定的修复作用，并进而阻止了草酸钙尿结石的形成。中药复方亦有效提高血清中SOD活性，降低血清中MDA含量。说明该金钱草组方汤剂能提高机体的抗氧化酶活性和抗氧化能力，可能对肾的损伤有一定的保护作用。

肾是重要的排泄脏器，一般情况下，当血浆蛋白的相对分子质量<4万时可透过肾小球滤过膜，因此肾小球的滤液中往往含有微量尿蛋白。而在早期肾损伤中，虽然尿常规检测呈阴性，而实际上尿液中的蛋白质含量已经开始升高[9]，臧芝栋等[10]研究证实，肾早期损伤最显著临床指标为尿蛋白含量升高。NAG酶是一种高分子糖蛋白，在肾单位近曲小管细胞内含量最丰富。大量研究已证实[11-12]，NAG酶对肾小管损伤诊断的敏感性和特异性较高。γ-GT是主要存在于动物组织内的一种糖蛋白，在肾中的含量最高，且由于相对分子质量较大，难以滤过肾小球；主要分布于近曲肾小管边缘，因此尿液中的γ-GT主要是由肾小球上皮细胞分泌产生的。周永忠等[13]报道显示，肾病综合征、肾小球肾炎患者尿液γ-GT含量显著高于健康人群。LDH酶广泛存在于各种生物体中，在临床上，患急性肾小管坏死、慢性肾盂肾炎、慢性肾小球肾炎等时，血清中LDH酶均可增高。

血清中Crea的含量反映肾小球的过滤速率，也就是肾的机能，当肾发生严重病变时，Crea排泄受阻，血液中Crea含量升高，其含量越高，肾的功能障碍越大，但只有在肾有严重障碍时才会大幅提高，故不能作为早期肾病的指标。BUN是肾功能主要指标之一，通常肾为排泄尿素的主要器官，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，和血Crea一样，在肾功能损害早期，血BUN可在正常范围，而发生各种肾实质性病变时，血BUN增高。同时，在肾功能减退时，常伴有血清尿酸的增高。

SOD是机体内唯一能特异性清除超氧阴离子自由基的酶类，因此测定SOD的活性可间接反映机体清除自由基的能力，SOD对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子(O2-·)保护细胞免受损伤[14]。MDA是生物膜发生脂质过氧化的重要产物之一，反映了体内脂质过氧化的氧化程度及细胞受自由基攻击的程度，MDA含量越低，表明机体抗氧化能力越强。

有研究表明，金钱草黄酮提取物能抑制试验性高草酸尿症大鼠肾草酸钙尿晶体的形成[16]，但要进一步阐明金钱草组方对草酸钙尿结石的防治机制，还需更深入、广泛的研究。

4 结 论

灌服该金钱草组方汤剂，能明显减轻草酸钙尿结石模型试验犬的肾功能损伤指标，对肾损伤有较好的修复功能；能提高机体的抗氧化酶活性，减轻机体的氧化损伤；同时，该中药复方有利尿作用，通过增加尿量，达到利尿排石的效果，防止草酸钙结石的聚集，从而达到预防结石形成的效果。

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(编辑 白永平)

Effect of Jinqiancao Compound Potion on the Formation of Calcium Oxalate Stones in the Urine of Canine

HE Ding-ling，HU Fang-fang，SU Yong-kang，QIU Xian-shuai，XIAO Xi-yu，PAN Jia-qiang*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

The experiment was designed to preliminary study on the effect of Jinqiancao compound potion to the formation of calcium oxalate stones in the urine of canine.Twelve healthy maleCanisLupusfamiliariswere randomly divided into 3 groups，which were the control group，the model group and the treatment group.The dogs in control group were fed with basal diet.The dogs in model group and treatment group were fed with basal diet plus glycol，ammonium chloride，calcium carbonate and vitamin D.Once 80% of the microscope view appeared calcium oxalate crystals in the urine of the experimental dogs，the Jinqiancao compound potion was orally administrated to the dogs of treatment group.During the experiment，the urine index(including the content of microalbumin，the enzymatic activity of N-acetyl-β-D-Glucosaminidase and γ-glutamyltransferase) and the serum index(including the content of creatinine，blood urea nitrogen，uric acid and malondialdehyde，the enzymatic activity of lactate dehydrogenase and superoxide dismutase) were detected.Results were as follows：compared with model group，by treating Jinqiancao compound potion，the treatment group appeared lower activity of N-acetyl-β-D-Glucosaminidase，lower activity of γ-glutamyltransferase，lower concent of serum uric acid，lower malondialdehyde，lower activity of lactate dehydrogenase and higher activity of serum superoxide dismutase than that of modle group.Our study demonstrates that Jinqiancao compound can effectively reduce the damage to renal during the formation of calcium oxalate calculus，improve the enzyme activity of blood antioxidant.In other words，kidney cells were effectively repaired to ensure the function of kidney by the Jinqiancao compound，which to prevent the formation of calcium oxalate calculus in the urine of canine.

canine；the Jinqiancao compound；function of renal；calcium oxalate calculus；antioxidant effect

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.021

2015-01-21

广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室开放课题(2013A061401013)

何钉玲(1989-)，女，湖南邵阳人，硕士生，主要从事临床内科学方面的研究，E-mail：756424826@qq.com

*通信作者：潘家强，E-mail：panjq@scau.edu.cn

S856.59

A

0366-6964(2015)10-1867-08