蒲公英水提物对猪链球菌生物被膜体外干预作用

于文会，许 晶，魏庆微，姜晓文，单安山

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨150030；2.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨150030）

猪链球菌（Streptocccus suis，S.suis）是一种革兰阳性细菌，不仅引起猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎等一系列疾病，而且感染相关的从业人员，是一种人兽共患病［1］。在感染的起始阶段，细菌能否定植在宿主组织，取决于细菌被胞外基质（extracellular matrix）包裹的生物被膜形成与否。形成生物被膜的胞外基质来源于环境和细菌的代谢产物。细菌形成生物被膜有利于细菌的持续性定植，抵抗宿主免疫系统的清除，增强细菌的耐药性，增加细菌和细菌间遗传物质的交换［2］。蒲公英（dandelion）是一种多年生菊科植物，在我国各地均有分布，来源广泛，价格低廉。蒲公英作为一种药用植物，具有利胆、利尿、抗风湿、抗糖尿病及抗炎特性。蒲公英不同部位的提取物具有不同的药理活性。蒲公英根的水提物可以缓解酒精诱导的氧化应激反应；蒲公英叶的提取物可以缓解高脂肪食物诱导的非酒精性脂肪肝；蒲公英花的提取物具有抗菌活性［3］。然而，蒲公英的全草类提取物干预细菌生物被膜形成的研究，未见国内外文献报道。蒲公英主要抗菌活性成分为绿原酸，且含量较高，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、免疫调节、降糖等多种作用［4］。绿原酸对铜绿假单胞菌生物被膜［5］、葡萄球菌生物被膜［6］、口腔中多种细菌的生物被膜［7］的形成均有抑制作用，但绿原酸对猪链球菌生物被膜形成影响的研究，国内外文献未见报道。为开发蒲公英在防治猪链球菌病的应用，采用蒲公英水提物对体外猪链球菌生物被膜的形成进行干预，探讨蒲公英抗猪链球菌的机制，为今后蒲公英防治猪链球菌病的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：猪链球菌分离株，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供并鉴定；蒲公英饮片，购自中国药材集团黑龙江省药材公司；卡尔加里生物被膜培养装置，购自加拿大Innovotech有限公司；THB（Todd-Hewitt broth）培养基，购自中国青岛高科园海博生物技术有限公司；绿原酸对照品，购自中国药品生物制品检定所；乙腈和甲醇为色谱纯。

1.2 主要仪器

酶标仪（SN239591，美国Epoch），扫描电镜（S-3400N，日本），日本岛津10 AVP高效液相色谱仪，紫外检测器，CWS30色谱工作站。

1.3 方法

1.3.1 蒲公英水提物制备和绿原酸含量检测称取蒲公英200 g于烧杯中，粉碎后加蒸馏水1.6 L，室温浸泡过夜。煎煮30 min，12层纱布过滤，取滤液。再向滤渣内加入蒸馏水1.2 L煎煮30 min，同样用12层纱布过滤，合并滤液。滤液以3 000 r·min-1，离心10 min，取上清液，用旋转蒸发仪浓缩至100 m L，再利用真空冷冻干燥机冻干至粉末［8］。准确称量蒲公英冻干粉末1 g，用2 m L双蒸水溶解，用0.22μm滤膜过滤，保存在-20℃备用。

参照中国兽药典蒲公英的鉴定方法［8］，以绿原酸作为标准品，高效液相色谱法测得蒲公英水提物中绿原酸含量。

1.3.2 蒲公英水提物和绿原酸对猪链球菌最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）测定MIC的测定参照I.Wiegand等［9］微量肉汤稀释法进行。将猪链球菌菌株接种于THB琼脂平板，37℃培养过夜。取单个菌落接种于THB培养基中，37℃培养12～16 h。比浊法将菌液浓度先调整为0.5麦氏菌悬液（1.0×108cfu·m L-1），然后用THB培养基稀释为约1.0×106cfu·m L-1。依次向无菌96孔细胞培养板加入THB培养基，除第1孔加入160μL THB培养基外，其余每管加入100 μL THB，在第1孔加入蒲公英水提物40μL混匀，然后吸取100μL至第2孔，混匀后再吸取100μL至第3孔，如此连续倍比稀释至第11孔，并从第11孔中吸取100μL弃去，第12孔为不含药物的生长对照。然后在每孔内加入上述制备好的菌液100 μL，使每孔最终菌液浓度约为5×105cfu·m L-1，混匀后盖好，于37℃孵育24 h。以肉眼观察，无细菌生长的药物最低浓度孔，即为各蒲公英水提物对S.suis的MIC。

从MIC终点孔到第1孔中分别吸取50μL液体接种于THB平板上，37℃温箱中孵育24 h。观察结果，接种平板中未见菌体生长的最低药物浓度为MBC。

1.3.3 猪链球菌生物膜形成能力测定 参照周永辉等［10］方法，首先将猪链球菌菌株于无菌条件下在THB琼脂平板上传代2代进行分离，从THB琼脂平板上挑取单个菌落，接种于无菌THB液体试管中，37℃恒温培养箱中培养18 h后，比浊法将菌液浓度先调整为0.5麦氏菌悬液（1.0×108cfu·m L-1），再用THB液体培养基稀释，使菌液浓度约为1×106cfu·m L-1。每孔200μL菌液加到卡尔加里装置底部板内，只含THB液体培养基的孔为对照组，37℃，50 r·min-1摇床上培养72 h。设置空白对照组（THB培养基）和阳性对照组（1／2环丙沙星）。参照S.Stepanovic等的方法［11］分别用空白对照组（THB培养基）、阳性对照组（1／2MIC环丙沙星）、阴性对照组（猪链球菌菌液）共同培养72 h后染色，酶标仪595 nm处测定OD值。判断猪链球菌生物被膜的形成能力。

1.3.4 不同浓度蒲公英水提物及不同浓度绿原酸对链球菌生物被膜干预作用 将浊度为0.5麦氏菌悬液稀释到1.0×106cfu·m L-1，向卡尔加里生物被膜装置每孔中加菌液和蒲公英水提物共200 μL（浓度分别为1／2MIC、1／4MIC、1／8MIC、1／16MIC、1／32MIC），另设空白对照孔（只加培养基）和阴性对照孔（只加菌液），每个样品5个重复。37℃，50 r·min-1摇床上孵育72 h，PBS清洗2次，固定，染色，酶标仪595 nm处测定OD值。

1.3.5 蒲公英水提物及绿原酸对链球菌生物被膜干预作用形态学观察 从卡尔加里被膜装置中取出所需观察的桩钉，并使用灭菌PBS（p H7.2）轻轻洗涤3次以去除游离菌。用p H 7.2戊二醛在4℃冰箱中固定1 h。依次用p H 7.2 PBS冲洗2次，每次均为10 min。用50%、70%、90%乙醇各脱水一次，每次10 min；再用100%乙醇脱水2次，每次10 min，最后用100%乙醇与叔丁醇（1∶1）混合液和纯叔丁醇各脱水一次后，每次15 min。然后将样品送电镜中心进行扫描电子显微镜下观察。

1.3.6 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对相关数据进行统计分析，结果用±s表示，统计资料的比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 蒲公英水提物中绿原酸含量

测定绿原酸标准品和蒲公英水提物最大吸收峰的波长为327 nm，蒲公英水提物出现最大吸收峰的波长与标准品的波长和时间均一致。经HPLC分离检测，蒲公英水提物在5 min左右检测到的物质为绿原酸（图1、图2）。以绿原酸标准品的系列质量浓度x（μg·m L-1）为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：y＝70 223x＋4.7× 105，R2＝0.999 9，结果表明绿原酸进样量在0.02～0.12μg范围内线性关系良好。按中华人民共和国兽药典第二部［8］方法制备供试品溶液，进样20μL，在5 min时测得其峰面积为2 099 255，供试品溶液测得蒲公英水提物中绿原酸的含量为5.833 mg·m L-1（图3）。

图1 绿原酸Fig.1 Chlorogenic acid

图2 蒲公英水提物Fig.2 Dandelion aqueous extract

图3 绿原酸标准曲线Fig.3 Chlorogenic acid standard curve

2.2 蒲公英水提物对猪链球菌的MIC和MBC

通过微量稀释法测定了蒲公英水提物对猪链球菌的MIC和MBC分别为和62.5和250 mg·m L-1。绿原酸对猪链球菌的MIC和MBC分别为和2.5和10 mg·m L-1。

2.3 猪链球菌生物被膜形成能力

空白对照组OD595nm值（0.199 0±0.017 7）明显低于阴性对照组OD595nm值（0.582 0±0.025 9），且差异极显著（P＜0.01）。阳性对照组OD595nm值（0.194 0±0.020 7）明显低于阴性对照组OD595nm值，差异极显著（P＜0.01）。猪链球菌形成生物被膜能力较强。试验结果见图4。

2.4 亚MIC对猪链球菌生物被膜的干预作用

2.4.1 蒲公英水提物亚MIC对猪链球菌生物被膜的干预作用 1／2MIC蒲公英水提物组OD595nm值（0.226 8±0.031 6）、1／4MIC蒲公英水提物组OD595nm值（0.262 4±0.034 4）、1／8MIC蒲公英水提物组OD595nm值（0.346 0±0.040 4）、1／16MIC蒲公英水提物组OD595nm值（0.460 0±0.037 4）、阳性对照组OD595nm值（0.194 0±0.020 7）均显著低于阴性对照组OD595nm值（0.582 0±0.025 9），差异极显著（P＜0.01）。1／32MIC蒲公英水提物组OD595nm值（0.568 0±0.026 8），低于阴性对照组OD595nm值（0.582 0±0.025 9），差异显著（P＜0.05）。蒲公英水提物对猪链球菌有干预作用，呈剂量依赖性。试验结果见图5。

图4 猪链球菌生物被膜形成能力（n＝5，±s）Fig.4 The ability of biofilm formation of Streptococcus suis（n＝5，±s）

图5 蒲公英水提物对猪链球菌生物被膜干预作用（n＝5，±s）Fig.5 The water extract of dandelion on Streptococcus suis biofilm intervention role（n＝5，±s）

2.4.2 绿原酸亚MIC对猪链球菌生物被膜的干预作用 1／2MIC绿原酸组OD595nm值（0.226 8± 0.011 6），1／4MIC绿原酸组OD595nm值（0.262 4± 0.054 4），1／8MIC绿原酸组OD595nm值（0.346 0± 0.025 4），1／16MIC绿原酸组OD595nm值（0.460 5± 0.039 2），阳性对照组OD595nm值（0.193 7± 0.021 7），均明显低于阴性对照组OD595nm值（0.599 2±0.024 1），差异极显著（P＜0.01）。1／32MIC绿原酸组OD595nm值（0.578 2±0.029 9）低于阴性对照组OD595nm值（0.582 8±0.023 7），差异显著（P＜0.05）。绿原酸对猪链球菌有干预作用，呈剂量依赖性。试验结果见图6。

2.5 蒲公英水提物及绿原酸对猪链球菌干预作用的形态学观察

扫描电镜观察，阴性对照组细菌镶嵌于生物被膜中，细菌周围有厚厚的黏液层，而蒲公英水提物和绿原酸均能够使细菌生物被膜发生明显变化，细菌数减少，未见有黏液成分和胞外基质，蒲公英水提物和绿原酸的抑制生物被膜形成与剂量相关，呈剂量的依赖性，见图7、8。

图6 绿原酸对猪链球菌生物被膜干预作用（n＝5，±s）Fig.6 Chlorogenic acid of Streptococcus suis biofilm intervention role（n＝5，±s）

图7 扫描电镜（8 000×）下不同浓度蒲公英水提物对猪链球菌生物被膜的形态学影响Fig.7 Different concentrations of aqueous extract of dandelion on biofilm morphology of Streptococcus suis were observed under scanningelectron microscope（8 000×）

3 讨 论

已有报道绿原酸为蒲公英中主要药效活性成分，含量较高［12-13］，但为了确证蒲公英水提物中绿原酸的含量，作者利用高效液相色谱对其进行分析，结果表明蒲公英水提物中绿原酸含量为5.833 mg·m L-1，含量较高，这与报道的相一致。为了明确蒲公英水提物对猪链球菌抑菌和杀菌作用的主要药效成分是否为绿原酸，试验分别测定蒲公英水提物和绿原酸对猪链球菌的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），从测得的结果看，绿原酸的MIC和MBC均低于蒲公英水提物的浓度，而且二者相差数十倍，表明绿原酸为蒲公英水提物中抗菌的主要药效成分。

图8 扫描电镜（8 000×）下不同浓度绿原酸对猪链球菌生被物膜的形态学影响Fig.8 Different concentration of chlorogenic acid on the morphology of Streptococcus suis biofilm were observed under scanning electron microscope（8 000×）

猪链球菌在体内定植常以生物被膜形式生存，生物被膜可以阻止和抑制巨噬细胞、白细胞、抗体及抗生素进入生物被膜中清除或杀灭细菌，导致链球菌反复感染，难以控制［14］。生物被膜一旦形成，膜内细菌比浮游细菌耐药性增加100～1 000倍以上，是细菌毒力增强的重要因素。因此，筛选一种能够抑制猪链球菌生物被膜形成药物，是治疗猪链球菌病的关键。已有研究报道绿原酸对铜绿假单胞菌生物被膜［5］、葡萄球菌生物被膜［6］、口腔中多种细菌的生物被膜［7］等均有抑制作用，但绿原酸干预猪链球菌生物被膜形成是否具有抑制作用，国内外文献未见报道。作者采用1／2MIC、1／4MIC、1／8MIC、1／16MIC蒲公英水提物及1／2MIC、1／4MIC、1／8MIC、1／16MIC绿原酸对猪链球菌生物被膜形成进行干预，结果表明蒲公英水提物及绿原酸对猪链球菌生物被膜均有明显的抑制作用，并呈剂量依赖性；电镜观察可见阴性对照组细菌镶嵌于生物被膜中，细菌周围有厚厚的黏液层，而蒲公英水提物和绿原酸均能使细菌生物被膜中的细菌数量和生物被膜的形态发生明显变化，细菌数量明显减少，未见有黏液成分和胞外基质分泌，二者对生物被膜的抑制作用均呈剂量依赖性。

蒲公英水提物中含有多种成分，本试验只对蒲公英水提物中的绿原酸进行考察，通过蒲公英水提物和绿原酸对猪链球菌生物被膜的形成抑制作用进行比较，表明蒲公英水提物中抑制猪链球菌生物被膜形成的主要活性成分为绿原酸，但蒲公英水提物中的其他成分对猪链球菌生物被膜形成的抑制作用如何，有待今后进一步研究。

试验结果已经证明蒲公英水提物对体外猪链球菌生物被膜的形成具有抑制作用，但对猪链球菌病是否具有治疗与预防作用，还有待于今后对猪链球菌病进行临床试验研究。

4 结 论

蒲公英水提物对体外猪链球菌生物被膜形成具有抑制作用，并呈剂量依赖性；蒲公英水提物对体外猪链球菌生物被膜形成抑制作用的主要活性成分为绿原酸。

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