BPI蛋白对感染绵羊肺炎支原体的盘羊杂交羊细胞因子水平的影响

郭海英，沈 文，陈冬梅，陈凯丽，张晓丽，高宝德，孙延鸣＊

（1.石河子大学动物科技学院，石河子832003；2.石河子大学生命科学学院，石河子832003）

新疆天山地带的野生盘羊是国家二级保护动物，巴什拜羊也是新疆特有的地方优良品种，二者都具有很强的适应性和抗病能力。长期调查发现，其幼龄的杂交后代羊的抗病力却大大降低，非常易感呼吸道疾病［1-2］，研究表明主要与绵羊肺炎支原体感染有关［3］。盘羊的杂交后代可能存在先天性免疫能力下降，其可能与羊的疾病抗性基因变异有关［4］。

杀菌通透性增加蛋白基因（bactericidal／permeability-increasing protein gene，BPI）属于抗菌肽或蛋白类基因，其编码产物有杀灭革兰阴性菌、中和内毒素、对中性粒细胞的调理作用等活性，在动物机体先天免疫中起重要的作用，被很多学者作为猪牛等的抗病候选基因［5-6］。有学者发现BPI有抑制促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL-8等的作用，促进抗炎因子如IL-10的表达，减轻炎症反应［7-8］。研究表明肺炎支原体感染可以诱导多种细胞因子产生，有学者建立小鼠支原体肺炎模型检测其细胞因子表达水平，表明IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-r等参与其致病过程，在肺部防御与炎症中起重要的作用［9-10］。前期研究中，作者发现巴什拜羊和盘羊杂交羊的BPI基因N端活性区域有3处核苷酸差异，并导致3处氨基酸改变。为进一步研究BPI蛋白的免疫调节功能，本试验建立了MO的盘羊杂交羊疾病模型，利用真核表达的重组BPI蛋白（r BPI）进行治疗试验，测定外周血中IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γ变化规律，并对其肺组织的病理切片进行病理评分，为研究BPI基因在MO的致病机制研究及治疗提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和实验动物

绵羊肺炎支原体菌株（Mycoplasma Ovipneumoniae，MO）（由石河子大学动物科技学院预防兽医实验室王静梅高级实验师提供，与Y-98标准株的相似性为98%）；12只盘羊杂交羊（盘羊♂×巴什拜羊♀）及6只巴什拜羊由塔城裕民县提供，均为2～3月龄，体重为10～15 kg，MO ELISA抗体检测均为阴性。

1.2 主要试剂

绵羊肺炎支原体专用培养基（兰州兽医研究所储岳峰研究员赠予）；MO ELISA诊断试剂盒（美国ADL公司）；r BPI为巴什拜羊重组BPI蛋白（石河子大学动物科技学院生化实验室制备）［11］；绵羊IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γELISA试剂盒（上海蓝基（Blue Gene）公司）。

1.3 试验设计

1.3.1 试验羊分组、感染及r BPI注射 培养绵羊肺炎支原体，人工感染按参考文献［12］的方法采用气管内注射。感染时所使用的MO浓度为CCU＝106·m L-1，2 m L·只-1，试验全程中饲喂均不添加抗生素。在感染MO后的第4天开始，C组羊每天注射rBPI 150 mg·只-1（真核表达的rBPI，浓缩后浓度为74.54 mg·m L-1），A、B组羊注射同剂量的生理盐水。在感染的第0、2、5、7、14、21天，颈静脉采血分离血清，试验结束后宰杀绵羊进行剖检。试验羊分组、感染及重组蛋白质注射的具体情况见表1。

表1 试验设计Table 1 The experimental design

1.3.2 临床观察与病原鉴定 每天定点测量记录体温，并观察临床症状，直至试验结束。试验结束后宰杀所有试验羊，检查肺部病变。在感染前和感染2周后，采血分离血清，使用MO ELISA诊断试剂盒检测抗体水平，按试剂盒说明书操作。同时从每组随机抽取2只个体，采用无菌棉拭子鼻腔采样，接种于支原体专用培养基培养，在5%CO237℃培养4 d，培养基由粉红转为黄色为阳性，并进行葡萄糖发酵试验、洋地黄皂苷试验等理化特性鉴定［13］。

1.3.3 人工感染前后血清细胞因子的ELISA检测在感染前（第0天）及感染后第2、5、7、14及21天，用普通采血管采集所有羊的静脉血，37℃倾斜放置2 h后3 000 r·min-1离心15 min，取上清，-20℃保存备用。参照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γ的浓度。

1.3.4 标本的固定染色及组织病理学评分 各组羊宰杀之后，取每只羊的左右肺组织常规制备石蜡切片、HE染色，光镜下观察组织学变化，参照张慧等对急性支原体肺炎动物模型的组织病理学评分系统［14］，以0～26分的组织病理学评分来确定肺部的炎症反应程度，评分包括支气管／细支气管周围浸润部位的百分比、支气管／细支气管管腔炎性细胞浸润的多少、支气管／细支气管管腔炎性渗出的严重程度、血管周围炎性细胞浸润的百分比、实质性肺炎严重程度五方面。每一侧肺的评分相加之后除以2而构成每只动物的评分。

1.3.5 数据处理分析 采用SPSS 17.0软件分析比较不同组羊细胞因子IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γ表达水平差异，以及每组病理评分的差异，结果以“±s”表示。

2 结 果

2.1 临床观察与病原鉴定

A组巴什拜羊在感染后2～3 d表现为食欲减退、体温一过性升高（40～41℃），呼吸啰音，之后体温恢复正常，无死亡病例，剖检后肺表面有轻微出血点（图2A）；B组杂交羊体温升高（40～41℃）并持续不下，有咳嗽、流浆液性鼻涕、严重呼吸啰音及腹泻症状，死亡率为33%，剖检胸膜有黄白色纤维素层附着，肺表面有不同程度的粉色肉变和肝变，有出血点、出血斑及表面凸出结节（图2B）。C组杂交羊起初体温升高、食欲减退、咳嗽症状，剖检肺表面有出血点和出血斑（图2C）。感染前后血清MO抗体ELISA检测结果见图1，测定OD值（与阴性对照OD值（NC）比较，＞2NC＋0.06为阳性）结果显示阴性对照OD值为0.12，所以可得临界值为0.3，人工感染前均为阴性，感染后血清MO抗体均呈阳性（图1）。将鼻腔采集的棉拭子接种于培养基中，由粉红转为黄色，取培养物涂片姬姆萨染色镜检，可见球形及多形性支原体，接种于固体培养基，4 d后在显微镜下观察呈典型支原体菌落，同时经生化鉴定（表2），结果为MO，表明感染成功。

2.2 肺部组织病理学评分

A组巴什拜羊表现为轻度病变，肺组织结构清晰，局部视野肺间质增宽，其间有淋巴细胞、巨噬细胞及淡粉色渗出液浸润。细支气管上皮排列尚规则，管腔的周围有少量炎症细胞浸润（图3A）。B组杂交羊均表现重度病变，其病变范围广泛，大部分视野可见肺间质明显变宽，压迫肺间质致使连成片，肺泡腔消失，间隔内有大量淋巴细胞浸润，细支气管上皮破坏、脱落，管腔内有明显渗出，肺间质毛细血管、支气管旁小静脉淤血突出（图3B）。C组杂交羊表现为中度病变，肺泡间隔增宽较明显，间隔内有较多淋巴细胞、巨噬细胞浸润，肺泡结构部分破坏，细支气管上皮增生，小血管周围淋巴细胞浸润（图3C）。对3组绵羊肺部病理评分后，A组平均分为9.4，B组平均分19.9，C组平均分为12.8，三组评分结果差异见图3D，B组评分与A、C组差异显著（P＜0.05、P＜0.05）。

图1 感染前后MO抗体水平检测Fig.1 Serum anti-MO antibody levels after 2 weeks of infection

图2 各组肺的肉眼病变观察Fig.2 Lesion observation of lung in each group

表2 生化鉴定结果Table 2 Biochemical identification results in the three groups

2.3 IL-8检测

人工感染前后各组羊的IL-8含量如表3所示，在感染后3个组的IL-8浓度均逐渐升高。在感染后第7天，C组IL-8浓度显著低于A组（P＜0.05）；在第14—21天，B组极显著高于A组（P＜0.01）。B组IL-8呈持续增高，说明了炎症程度严重，与其对应的病理反应存在相关性。

图3 各组肺组织病变（HE 100×）及病理评分Fig.3 Pathological changes of lung（HE 100×）and histopathological scores in the three groups

表3 注射r BPI蛋白前后各组羊IL-8的浓度（±s）Table 3 Concentration of IL-8 of each group at pre-and post-injecting rBPI pg·mL-1

表3 注射r BPI蛋白前后各组羊IL-8的浓度（±s）Table 3 Concentration of IL-8 of each group at pre-and post-injecting rBPI pg·mL-1

同一行中，不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）；不同大写字母表示差异极显著（P＜0.01）。下同In the same line，different lowercase letter superscripts indicate significantly different（P＜0.05）；different uppercase letters indicate the highly significant difference（P＜0.01）.The same as below

时间Time A组（BS、生理盐水）Group A（BS，Saline）B组（AHS、生理盐水）Group B（AHS，Saline）C组（AHS，r BPI蛋白）Group C（AHS，r BPI protein）第0天Day 0 131.14±12.18 124.52±11.04 118.68±7.11第2天Day 2 139.65±34.51 150.85±23.65 137.03±13.71第5天Day 5 184.67±8.38 178.30±14.18 171.68±16.44第7天Day 7 267.11±17.77a 248.22±10.40ab 220.60±13.46b第14天Day 14 218.64±19.33B 283.22±23.99A 250.35±34.69AB第21天Day 21 191.57±30.62B 297.54±23.87A 224.79±30.47B

2.4 IL-10检测

IL-10含量如表4所示。在感染后第2—5天，3个组的IL-10含量升高；在第5天，C组显著高于A组（P＜0.05），极显著低于B组（P＜0.01）；在感染后的第14天，C组IL-10极显著低于A组（P＜0.01），显著高于B组（P＜0.05）；在第21天，C组显著低于A组（P＜0.05），极显著高于B组（P＜ 0.01）。A、C组后期都趋向正常水平，利于机体恢复。

2.5 IFN-γ检测

如表5所示，在感染MO后3个组的IFN-γ含量均逐渐升高（除A、C组第21天）。第14天，C组IFN-γ含量显著高于A组（P＜0.05）；在第21天，C组显著低于B组（P＜0.05），但极显著高于A组（P＜0.01）。

表4 注射r BPI蛋白前后各组羊IL-10的浓度（±s）Table 4 Concentration of IL-10 of each group at pre-and post-injecting r BPI pg·m L-1

表4 注射r BPI蛋白前后各组羊IL-10的浓度（±s）Table 4 Concentration of IL-10 of each group at pre-and post-injecting r BPI pg·m L-1

时间Time A组（BS、生理盐水）Group A（BS，Saline）B组（AHS、生理盐水）Group B（AHS，Saline）C组（AHS，r BPI蛋白）Group C（AHS，rBPI protein）第0天Day 0 325.82±23.24 338.51±14.31 312.25±14.41第2天Day 2 353.05±20.12 348.68±19.98 334.95±26.73第5天Day 5 402.21±21.64Bb 502.41±20.16A 445.21±27.16Ba第7天Day 7 257.60±13.94 267.69±10.78 273.89±15.34第14天Day 14 285.82±14.49A 203.19±17.32Bb 236.96±21.91Ba第21天Day 21 306.15±22.09Aa 168.79±31.27Bc 263.03±29.36 Ab

表5 注射rBPI蛋白前后各组羊IFN-γ的浓度（±s）Table 5 Concentration of IFN-γof each group at pre-and post-injecting r BPI pg·m L-1

表5 注射rBPI蛋白前后各组羊IFN-γ的浓度（±s）Table 5 Concentration of IFN-γof each group at pre-and post-injecting r BPI pg·m L-1

时间Time A组（BS、生理盐水）Group A（BS，Saline）B组（AHS、生理盐水）Group B（AHS，Saline）C组（AHS，r BPI蛋白）Group C（AHS，rBPI protein）第0天Day 0 47.31±6.07 54.09±10.90 45.16±5.64第2天Day 2 57.85±3.55 61.11±11.17 56.86±4.24第5天Day 5 87.52±8.50 85.90±14.41 85.71±8.65第7天Day 7 97.34±10.91 105.74±8.60 100.08±10.43第14天Day 14 81.98±10.55b 130.42±13.89a 106.88±15.41a第21天Day 21 65.11±9.93B 136.06±23.32Aa 93.25±13.02Ab

2.6 TNF-α检测结果

如表6所示，在感染MO后TNF-α含量逐渐升高，在感染第14天，C组TNF-α显著低于B组（P＜0.05），但显著高于A组（P＜0.05）；在第21天，C组的TNF-α显著低于B组（P＜0.05），但极显著高于A组（P＜0.01）。B组持续增高，说明炎症程度较高，感染严重，相反A、C组后期逐渐降低说明利于机体恢复。

表6 注射r BPI蛋白前后各组羊TNF-α的浓度（±s）Table 6 Concentration of TNF-αof each group at pre-and post-injecting rBPI pg·mL-1

表6 注射r BPI蛋白前后各组羊TNF-α的浓度（±s）Table 6 Concentration of TNF-αof each group at pre-and post-injecting rBPI pg·mL-1

时间Time A组（BS、生理盐水）Group A（BS，Saline）B组（AHS、生理盐水）Group B（AHS，Saline）C组（AHS，r BPI蛋白）Group C（AHS，r BPI protein）第0天Day 0 152.02±13.53 162.52±8.71 146.19±13.36第2天Day 2 178.60±7.84 177.35±4.31 169.37±6.89第5天Day 5 196.37±11.73 203.96±22.25 194.17±8.51第7天Day 7 239.05±17.80 242.95±8.54 235.60±12.55第14天Day 14 223.13±8.33c 273.55±16.34a 240.52±17.67b第21天Day 21 182.58±6.71B 304.88±23.34Aa 265.29±18.16 Ab

3 讨 论

近年来，BPI作为先天免疫中的一种免疫防御分子在感染性疾病中的作用倍受关注。BPI具有杀灭革兰阴性菌、结合内毒素，并能形成内毒素中和分子和抗革兰阴性细菌感染（GNB）的药物，因此，被誉为“超级抗生素”［15-16］，此外BPI还有促进补体活化调理功能、抑制血管生成、抑制炎性介质释放、抗原虫等作用［17-18］。前期研究已得到杂交羊和巴什拜羊的BPI序列有差异。为进一步研究BPI对绵羊肺炎支原体的作用，本试验以支原体肺炎的绵羊为疾病模型，选择对MO不易感的巴什拜羊的r BPI蛋白来注射绵羊，动态检测绵羊外周血中4种细胞因子变化，初步证实BPI对绵羊肺炎支原体有一定的治疗作用。

人工感染巴什拜羊和杂交羊的试验中，均能从3组羊血清中检测到MO抗体，说明MO人工感染成功。A组巴什拜羊出现体温一过性升高、咳嗽和流鼻液等较轻症状，剖检症状不典型。而B组杂交羊有体温升高且持续较久，咳嗽、流浆液性鼻涕、严重呼吸啰音及腹泻症状，剖检出现出血点、肉变和肝变。两种羊临床症状严重程度不同，可能是巴什拜羊较杂交羊对MO有抗性［8］，与姜方配等［6］同时对巴什拜羊和杂交羊攻毒MO的症状相符。而这些羊的体温表现差异较大，这与流行病学调查时基层兽医反映许多发病羊在测体温时体温不高的情况相一致［19］。

研究表明，肺炎支原体感染后，是通过细胞因子的诱导作用，激活内皮细胞和粒细胞，继而调节黏附因子的合成及其在细胞表面的表达，从而导致炎症的发生，并认为这些细胞因子可能是支原体肺炎感染的发病机制之一［20］。IL-8作为C-X-C趋化因子家族之一，人肺炎支原体感染时，巨噬细胞、内皮细胞及人肺上皮A549细胞能分泌IL-8，引起胸膜渗出和肺的纤维素病变［4，21］。有研究表明，急性期支原体肺炎患儿的IL-8水平明显升高，恢复期则降至正常水平［22］。本试验中感染MO的杂交羊，在BPI治疗后期IL-8有降低趋势，浓度逐渐趋向正常水平，与其研究结果相一致。

IFN-γ为TH1型促炎细胞因子，能抑制病毒复制、增强巨噬细胞吞噬作用。在支原体肺炎病人中可以检测到IFN-γ水平升高［23］，我们的研究结果也与其相一致。在感染初期，3个组IFN-γ浓度都随时间延长而浓度升高，其中对照组杂交羊（B组）在整个21 d的试验期内都是升高的。BPI治疗后，C组杂交羊在第14天后开始有降低趋势，且与不治疗的B组差异极显著。说明BPI可能调节IFN-γ，使其恢复到正常水平，促使机体向有利方面发展，这与高伟［24］观察到感染支原体肺炎的大鼠在感染初期IFN-γ升高在恢复期降低的是一致的。

TNF-α是由活化的巨噬细胞和T细胞分泌的细胞因子，有诱导中性粒细胞的趋化作用和局部浸润、吞噬和杀伤病原体，从而启动炎症反应。有研究表明，感染支原体肺炎后TNF-α浓度升高，且与支原体肺炎的严重程度成正相关［25-27］。本研究结果表明，感染MO前期巴什拜羊和杂交羊血清中TNF-α浓度都升高，说明疾病发生严重。在BPI治疗后期的杂交羊的TNF-α浓度降低，且明显低于不治疗的杂交羊，暗示治疗组杂交羊症状减轻。而且治疗后的病理评分低于不治疗的，也说明治疗后的杂交羊处于恢复期症状减轻。

IL-10是抗炎细胞因子，由TH2型细胞分泌，可作用于巨噬细胞抑制其分泌细胞因子，间接抑制TH1型细胞因子如IL-6、TNF-α等的过表达。有研究表明IL-10的分泌缺乏将导致各种炎症过程，某些情况下其缺乏还将导致炎症持续和不可逆的组织损伤［28］。本研究也证明了这点，感染MO后三组羊的IL-10含量降低，且B组杂交羊呈现持续降低趋势，加上B组的病理评分分数显著高于其他两组，表明肺部损伤严重。但是BPI治疗后C组杂交羊在14 d之后IL-10逐渐升高，相应的病理评分也低于B组，这些数据可能暗示机体将向有利于机体的方面发展，这与马庆庆等［22］在肺炎支原体患儿血清IL-10降低，而在恢复期虽然升高但仍低于正常值的结果相似。

4 结 论

注射r BPI蛋白后盘羊杂交羊的细胞因子水平与未注射的杂交羊相比有明显差异，说明r BPI蛋白对易感的盘羊杂交羊具有一定的免疫调节及治疗效果，为绵羊支原体肺炎的临床治疗和新药的研发提供新的理论依据。

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