鸡L-FABP启动子区C/EBPα结合位点的定点突变分析

贺 綦，孙婴宁，李 辉*，王启贵

(1.农业部鸡遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030； 2.黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室，哈尔滨 150030； 3.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030； 4.重庆市畜牧科学院，重庆 402460)

鸡L-FABP启动子区C/EBPα结合位点的定点突变分析

贺 綦1，2，3，孙婴宁1，2，3，李 辉1，2，3*，王启贵1，2，4*

(1.农业部鸡遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030； 2.黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室，哈尔滨 150030； 3.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030； 4.重庆市畜牧科学院，重庆 402460)

为进一步分析L-FABP启动子区域中的C/EBPα结合位点以确定其在L-FABP转录中的调控作用。本研究采用定点突变方法将L-FABP启动子区域中的C/EBPα结合位点进行有效突变。结果显示，C/EBPα外源过表达可以抑制L-FABP启动子活性，突变L-FABP启动子区域中C/EBPα结合位点后L-FABP的启动子活性明显升高。这些结果表明，鸡L-FABP基因受到C/EBPα基因负调控作用，且C/EBPα很可能通过与该位点结合参与L-FABP的转录调控，为进一步研究C/EBPα在L-FABP基因转录调控中的作用提供重要依据。

鸡；L-FABP基因；启动子；定点突变；C/EBPα基因

肝型脂肪酸结合蛋白(Liver-type fatty acid binding protein，L-FABP，FABP1)属于脂肪酸结合蛋白(Fatty acid binding protein，FABP)家族的成员之一，是一组低分子量(14～15 ku左右)可以结合长链脂肪酸的高保守性胞质蛋白。目前，对L-FABP的功能研究主要集中在人与小鼠上[1-2]。研究发现，L-FABP与不饱和脂肪酸的协同作用可有效促进细胞的生长和分化[2]。F.Schroeder等[3]研究发现，L-FABP基因的表达与胚胎干细胞的增殖分化密切相关。E.P.Newberry等[4]利用基因剔除模型研究显示，在长期禁食状态下，L-FABP基因剔除的小鼠肝对脂肪酸的摄入量少于野生型。

鸡L-FABP基因只在肝和小肠中表达[5]，与哺乳动物L-FABP蛋白结构相似[6]。已经研究证实，PPAR元件、甾族调节元件SRE、C/EBPα和AP1等是人L-FABP基因启动子的重要顺式作用元件[7]。C/EBPα基因是第1个被证明在脂肪细胞分化过程中起到重要作用的转录因子。通过在3T3-Ll前脂肪细胞中研究发现脂肪细胞的分化过程中必须要有C/EBPα。在小鼠体内将C/EBPα基因干扰，发现小鼠的白色脂肪组织发育停滞[8]。本研究前期对鸡L-FABP启动子进行鉴定与分析，推测其启动子区存在1个C/EBPα结合位点，受到C/EBPα基因负调控作用[9]。

为进一步分析L-FABP启动子区域中C/EBPα结合位点的真实性和确切位置，本研究采用定点突变的方法对L-FABP启动子区域中的C/EBPα结合位点进行分析，为阐明C/EBPα在L-FABP基因转录调控中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

DMEM高糖培养基、Opti-MEM 培养基、胎牛血清购自Gibco公司；荧光素酶报告基因检测试剂盒(Dual-Luciferase®Reporter Assay System)、萤光素酶报告基因载体(pGL3-basic vector)、海肾荧光素酶报告基因载体(pRL-TK vector)购自Promega公司；质粒回收试剂盒购自Omiga公司；转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；Fast Mutagenesis System购自北京全式金生物技术有限公司；C/EBPα真核表达载体和L-FABP(-2076/-20)质粒由本实验室保存；人肝癌细胞系(HEGP2)由东北农业大学生命学院惠赠。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析 采用Mulan和TFSEARCH 软件对L-FABP(-2 076/-20)启动子区进行转录因子结合位点的预测分析。

1.2.2 定点突变重组体的构建 根据生物信息学分析结果对L-FABP启动子区域的C/EBPα结合位点进行定点突变，设计C/EBPα结合位点突变引物并命名为L-FABP-F-mC/EBPα和L-FABP-R-mC/EBPα(表1)。以pGL3-L-FABP(-2 076/-20)质粒为模板构建突变重组体L-FABP-mC/EBPα。定点突变参照Fast Mutagenesis System试剂说明书操作。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；然后95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 3 min，28个循环；72 ℃延伸5 min。

1.2.3 人肝癌细胞系细胞(HEGP2)的培养与转染 人肝癌细胞系(HEPG2)用含有浓度为100 U·mL-1青霉素和链霉素、10%胎牛血清的DMEM高糖培养基；在37 ℃，5% CO2条件下培养；0.25%胰酶消化液消化；2 d传代一次；细胞的转染使用LipofectamineTM2000转染试剂，按照试剂说明书进行操作。

表1 构建启动子突变体所用引物序列

Table 1 Primers used for promoter mutation

引物名称Primername引物序列(5′⁃3′)SequencesofprimerL⁃FABP⁃F⁃mC/EBPαCTGAGATTTGTCCGCATGCTCCCAATTGL⁃FABP⁃R⁃mC/EBPαGCGGACAAATCTCAGATTAAAGGAGGAG

1.2.4 转录因子对鸡L-FABP基因启动子活性影响 HEGP2细胞接种于12孔板中，待细胞生长至70%汇合时，将C/EBPα真核表达载体分别与鸡pGL3-L-FABP(-2 076/-20)和突变重组体pGL3-L-FABP-mC/EBPα启动子报告基因载体共转染HEGP2细胞作为试验组；pCMV-HA载体分别与鸡pGL3-L-FABP(-2 076/-20)和突变重组体pGL3-L-FABP-mC/EBPα启动子报告基因载体共转染HEGP2细胞作为对照组。海肾荧光素酶报告基因为内源参照。每孔细胞转染1 μg质粒(表达载体∶启动子报告基载体质量比为3∶2)，0.01 μg的海肾对照质粒(PRL-PK)转染48 h，回收细胞，检测双报告基因荧光素酶活性。

1.2.5 数据分析 所有数据均为3次独立试验结果，采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析与t检验。P<0.05为差异显著，P<0.01差异极显著。

2 结 果

2.1L-FABP启动子区域的C/EBPα结合位点分析

利用Mulan(http：//mulan.dcode.org)和TFSEARCH(http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)网站分析鸡L-FABP(-2 076/-20)启动子序列上转录因子C/EBPα结合位点，设置Threshold：85.0 point。结果发现，在鸡L-FABP(-2 076/-20)启动子序列区间存在1个C/EBPα结合位点。结合在L-FABP翻译起始位点上游-1 854/-1 841，结合序列为agatttgtcAAtat。两个软件预测结果一致。

2.2 定点突变重组体的构建与鉴定

以L-FABP基因启动子(-2 076/-20)质粒为模板，利用L-FABP-F-mC/EBPα：5′-CTGAGA-TTTGTCCGCATGCTCCCAATTG-3′，L-FABP-R-mC/EBPα：5′-GCGGACAAATCTCAGATTAA-AGGAGGAG-3′为引物，进行PCR扩增。得到一条约6 874 bp的特异性条带(图1)，与预期的结果大小一致。菌液提交立菲公司进行测序(图2)。结果显示L-FABP-mC/EBPα启动子点突变载体构建成功。

2.3C/EBPα结合位点定点突变重组体的启动子活性分析

M.DNA相对分子质量标准；1.原质粒为模板点突变PCR产物；2.模板稀释10倍点突变PCR产物； 3.模板稀释100倍点突变PCR产物；4.模板稀释1 000倍点突变PCR产物M.Trans2K Plus П DNA marker(5 μL)；1-4.PCR products of site-directed mutagenesis，plasmid as templates respectively diluted 10，100，1 000 times图1 C/EBPα结合位点突变重组体质粒的琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of the C/EBPα binding sites mutant

为检测C/EBPα结合位点的突变是否影响L-FABP启动子的活性，将L-FABP启动子突变体与C/EBPα表达质粒共转染HEPG2细胞。48 h后分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。结果表明：1)C/EBPα的外源过表达可以抑制野生型L-FABP的启动子活性(P=0.028 0)。2)突变L-FABP的启动子区C/EBPα结合位点，C/EBPα外源过表达后L-FABP的启动子活性增强(P=0.019 2)。3)突变型L-FABP与野生型L-FABP相比突变型L-FABP的启动子活性高于野生型L-FABP启动子活性(P=0.003 5)。4)外源过表达C/EBPα，突变型L-FABP启动子活性高于野生型L-FABP启动子活性(P=0.002 2)(图3)。这些结果说明，C/EBPα结合位点得到有效突变，也暗示了C/EBPα对L-FABP启动子活性的抑制效应是通过该结合位点发挥作用的。

3 讨 论

L-FABP基因对细胞内脂肪酸的转运、代谢、脂质合成及长链脂肪酸依赖性基因的调控具有重要作用[10-11]。笔者前期通过对鸡L-FABP多态性的研究发现，L-FABP基因可能是影响鸡脂肪性状的重要候选基因[12]。利用生物信息学软件对L-FABP的启动子区域进行分析，发现L-FABP的启动子区域含有C/EBPα等转录因子结合位点[13]。鸡L-FABP基因受到C/EBPα基因负调控作用，且突变L-FABP启动子区C/EBPα结合位点后失去对L-FABP启动子的抑制作用。

目前，大量研究证实C/EBPα蛋白对基因的转录调控是多层次多因子的复杂精细调控。其与多种蛋白因子相互协调，在脂肪细胞增殖分化、脂肪沉积、胚胎发育、机体能量代谢、免疫反应及多种疾病过程中发挥重要作用[14-16]。C/EBP基因序列在人和鸡之间高度保守[8，17]。在不同物种间C/EBPs家族都是具有重要生物学作用的功能基因[18-19]。C/EBPα能与Ap2、SCD1、GluT4、leptin等脂肪细胞特征的启动子位点相结合并激活其表达，而突变这些基因启动子区的C/EBPα结合位点，则C/EBPα对其无激活效应[20]。本研究的结果显示，C/EBPα外源过表达可以抑制L-FABP启动子活性，与笔者前期研究结果一致[9]。采用定点突变方法将L-FABP启动子区域中C/EBPα结合位点进行突变后，L-FABP的启动子活性明显升高。L-FABP突变体启动子与C/EBPα共转染至人肝癌细胞中，L-FABP突变体启动子活性显著增强。通过生物信息学分析显示鸡L-FABP基因启动子区存在多个PPARγ结合位点。丁宁[21]研究显示，鸡C/EBPα基因表达蛋白能够结合于PPARγ基因启动子区，并显著激活其转录。有报道显示，adipophilin、L-FABP、RegIA、Gob-4 和NGAL这5个基因是由PPARγ直接调控的靶基因[22]，此外激活的PPARγ可诱导L-FABP的表达，从而有效地转运脂质并促进其代谢[23]。因此推测，这有可能是转染C/EBPα反而造成了L-FABP突变体启动子区域其它转录因子如PPARγ等的结合量相应升高进而促进了L-FABP突变体启动子活性，但该推测还需进一步研究验证。

下划线标示位置为预测C/EBPα结合序列，箭头标示位置为点突变位置，由AAT突变为CGCUnderline indicate the predicted C/EBPα sequence，arrow label position for the point mutation，by the AAT mutated into CGC图2 L-FABP启动子区点突变测序结果Fig.2 The sequencing of L-FABP promoter region site-directed mutagenesis

*表示差显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)*.Means differ significantly(P<0.05)；**.Means highly differ significantly(P<0.01)图3 定点突变技术分析鸡L-FABP基因启动子区C/EBPα结合位点对该基因转录调控的影响Fig.3 Mutation analysis of the function of C/EBPα binding site in the minimal L-FABP promoter region

L-FABP 是肝中唯一表达的脂肪酸结合蛋白，介导脂肪酸及多种疏水基团的转运。本研究使用人肝癌细胞系HEPG2作为试验材料探索L-FABP转录调控机制。由于L-FABP基因及转录因子C/EBPα在鸡和人肝中都有表达且L-FABP、C/EBPα基因氨基酸序列保守性很高，人肝组织中的环境与禽类肝所提供的环境相似，因此推测在人和鸡的L-FABP基因具有相同的调控机制，鸡L-FABP基因受到C/EBPα基因负调控作用，并且C/EBPα很可能通过与该位点结合参与L-FABP的转录调控。

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(编辑 郭云雁)

Site Directed Mutagenesis forC/EBPαBinding Sites in ChickenL-FABPPromoter

HE Qi1，2，3，SUN Ying-ning1，2，3，LI Hui1，2，3*，WANG Qi-gui1，2，4*

(1.KeyLaboratoryofChickenGeneticsandBreeding，MinistryofAgriculture，Harbin150030，China； 2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproduction，EducationDepartmentofHeilongjiangProvince，Harbin150030，China；3.CollegeofAnimalScienceandTechnology，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China；4.ChongqingAcademyofAnimalScience，Chongqing402460，China)

In order to further determine theC/EBPαbinding site ofL-FABPand analyze its role in the regulation ofL-FABPtranscription，theC/EBPαbinding site inL-FABPpromoter was effectively mutated using site-directed mutagenesis in the current study.The results showed that the expression ofL-FABPwas significantly repressed byC/EBPα，but theL-FABPpromoter activity was significantly promoted after the mutation ofC/EBPαbinding site.In a conclusion，the expression ofL-FABPwas significantly repressed byC/EBPα，andC/EBPαprobably involved in the regulation ofL-FABPexpression through this binding site.These results will provide a foundation for further research on the regulatory mechanism and function of chickenC/EBPαonL-FABPgene.

chicken；L-FABPgene；promoter；site-directed mutagenesis；C/EBPαgene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.003

2014-11-21

国家自然科学基金(30972087)；博士后研究人员落户黑龙江科研启动资助金(LBH-Q08131)；重庆市现代农业人才培育工程(14401)

贺 綦(1988-)，女，黑龙江哈尔滨人，硕士生，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：heqidongke@163.com

*通信作者：李 辉，博士，教授，主要从事动物遗传育种研究，E-mail：lihui@neau.edu.cn；王启贵，博士，教授，主要从事动物遗传育种研究，E-mail：wangqigui@hotmail.com

S831.2

A

0366-6964(2015)09-1496-06