不同毒力结核分枝杆菌对THP-1细胞凋亡及细胞因子表达的影响

张 妍，宋纪伟，曾范利，时 坤，李健明，刘 杨，刘 菲，孙凡婷，杜 锐，4*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.吉林市人民医院，吉林 132001；3.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；4.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，长春 130118)

不同毒力结核分枝杆菌对THP-1细胞凋亡及细胞因子表达的影响

张 妍1，宋纪伟2，曾范利3，时 坤3，李健明3，刘 杨1，刘 菲1，孙凡婷1，杜 锐3，4*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.吉林市人民医院，吉林 132001；3.吉林农业大学中药材学院，长春 130118；4.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，长春 130118)

为探讨不同毒力结核分枝杆菌(MTB)感染巨噬细胞后不同时间点细胞凋亡情况与其分泌的几种主要细胞因子转录与表达之间的关系，建立THP-1体外巨噬细胞模型，用不同毒力MTB(强毒株H37Rv、弱毒株BCG)感染细胞，应用流式细胞术检测巨噬细胞在六个时间点的凋亡情况，应用荧光定量PCR检测细胞因子TNF-α、IL-10、IL-6的转录水平，应用ELISA方法检测细胞上清液中三种细胞因子的分泌量。结果显示：BCG组和H37Rv组的早期凋亡率均显著高于对照组(P<0.05)。巨噬细胞细胞因子TNF-α、IL-6的转录水平与分泌水平相符，弱毒菌株巨噬细胞凋亡情况随时间延长成上升趋势，其分泌的细胞因子TNF-α表现为相同趋势，IL-6表现为相反趋势。强毒株巨噬细胞凋亡情况低于弱毒株，细胞因子分泌情况复杂，一般表现为一种先增强后抑制的情况。本试验通过对不同时间点细胞因子与凋亡情况关系的研究为结核分枝杆菌对巨噬细胞凋亡机制提供新思路。

不同毒力结核分枝杆菌；THP-1细胞；凋亡；细胞因子

结核病(Tuberculosis，TB)是一种慢性消耗性人畜共患传染病。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染后通常表现为慢性症状，并且感染后的潜伏期较长，潜伏期的动物具有传染性[1]。病畜尤其是具有开放性结核的病畜是人类结核病的主要传染源[2]。由于结核分枝杆菌是典型的胞内寄生菌，主要在宿主巨噬细胞等免疫系统内存活和繁殖，并已证实巨噬细胞在结核分枝杆菌免疫逃逸情况中占有重要作用[3]。在小鼠模型中也证实，除了巨噬细胞外，位于肺实质内的一些不成熟的单核细胞可以在其分化为巨噬细胞前进入感染部位并被感染[4]。不同毒力的结核分枝杆菌引起巨噬细胞凋亡水平不同，其逃逸机制与多种因素相关，其中细胞因子对巨噬细胞凋亡有重要的调控作用。TNF-α一般认为可由巨噬细胞内源性分泌，具有促进细胞凋亡的作用[5]。有报道称，结核分枝杆菌可以强化细胞内的一种生存蛋白(EIS)，通过JNK依赖性产生RIO从而抑制TNF-α的产生，防止巨噬细胞活化、炎症和自体吞噬等反应[6-8]。IL-10被认为是细胞因子合成的抑制因子，能够抑制多种促炎性细胞因子的分泌[9]。人医认为IL-10的水平与结核分枝杆菌的存活成正相关[10]。在动物中也有IL-10能够诱导结核分枝杆菌再活化的报道[11]。IL-6在新近的报道中证明可以抑制由结核分枝杆菌感染引起的巨噬细胞自噬。IL-6的分泌增加有利于结核分枝杆菌抑制机体先天性免疫应答[12]。本研究通过对不同毒力结核分枝杆菌感染细胞后细胞凋亡情况和其分泌的三种主要细胞因子的分析，对结核分枝杆菌引起的细胞凋亡及抑制细胞凋亡的机制进行深层探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

THP-1细胞购自中国科学院上海细胞库；强毒结核分枝杆菌H37Rv由吉林大学孙长江老师赠予；弱毒结核分枝杆菌BCG由本实验室保存；EDTA(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；β-巯基乙醇(Amresco公司)；1640培养基(Hyclone公司)；二甲基亚砜(Sigma公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；佛波酯phorbol 12-myristste13-acetate，PMA(Sigma公司)；FITC Annexin V-PI调亡检测试剂盒(美国BD公司)；细胞因子酶联免疫试剂盒(RD分装)；DEPC(Amresco公司)； TRIzol(大连宝生物公司)；SYBR®Premix EX TaqTMⅡ(大连宝生物公司)；Primescript®RT reagent Kit With gDNA Erase(大连宝生物公司)；其他常规化学试剂均为分析纯试剂。

1.2 THP-1细胞培养

THP-1人单核细胞为悬浮细胞，正常情况下为亮圆形，采用含10%血清、1%双抗的1640细胞培养液于含50 mL·L-1CO2的37 ℃的细胞培养箱中培养。换液时需要1 000 r·min-1离心5 min，计数调整其浓度为5×105·mL-1，用100 ng·mL-1的PMA诱导24 h使悬浮细胞贴壁，于12孔板中继续培养。

1.3 结核分枝杆菌培养

实验室罗氏培养基上保存的结核分枝杆菌成簇生长为乳黄色块状物，卡介苗表面成菜花样，结核分枝杆菌表面光滑，将其刮下接种于7H9液体培养基培养3～5 d，可见液体浑浊，内有白色颗粒，有菌膜挂壁。将菌液进行倍比稀释涂板进行菌落计数，离心用PBS稀释使其终浓度为5×106·mL-1，备用。

1.4 结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型建立

结核分枝杆菌感染12孔板中生长12 h以上贴壁良好的THP-1细胞，于CO2的37 ℃细胞培养箱中孵育4 h(此时使用的营养液不含血清不含双抗)。吸出营养液重新加入含血清不含双抗的营养液继续培养1、2、4、12、24、48 h。

1.5 THP-1细胞凋亡检测

用不含EDTA的胰酶对细胞进行消化，用含血清不含双抗的1640终止消化，用1 mL冷PBS悬浮细胞，洗涤细胞两次并计数使其终细胞数为1×105个，加入100 μL Buffer，3 μL FITC，3 μL PI染料，避光25 °C孵育15 min，最后加入200 μL Buffer。在1 h内进行流式检测。

1.6 细胞因子转录水平检测

提取RNA并进行反转录，按说明书进行操作。荧光定量PCR，反应体系：SYBR®Premix ExTaqII 12.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL(表1)，模板 2 μL，ddH2O 8.5 μL，反应条件： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，不同退火温度(60～64 ℃)30 s，72 ℃延伸30 s，共进行40个循环；采集荧光信号得出扩增产物的解链曲线。

表1 荧光定量PCR引物及退火温度

Table 1 Quantitative PCR primers and annealing temperature

引物名称Primername序列(5′⁃3′)Sequence最适退火温度/℃AnnealingtemperatureIL⁃6⁃FIL⁃6⁃RGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTCAGCAGGCTGGCATTTG62IL⁃10⁃FIL⁃10⁃RGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGAAAGGCTTGGCAACCCAGGTA64TNF⁃α⁃FTNF⁃α⁃RTGCTTGTTCCTCAGCCTCTTCAGAGGGCTGATTAGAGAGAGGT60β⁃actin⁃Fβ⁃actin⁃RGGACTTCGAGCAGGAGATGGTGAAGGTGGTCTCGTGGATG62

1.7 细胞因子ELISA检测

收集细胞上清液及给定标准品按ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪在450 nm处测得OD值。

2 结 果

2.1 不同时间点细胞凋亡

流式细胞术FITC/PI双染试剂盒结果FITC阳性，PI阴性表示细胞早期凋亡；FITC和PI均阳性表示细胞晚期凋亡或有损伤的死细胞。BCG组和H37Rv组的早期凋亡率均高于对照组，并且其差异具有统计学意义(P<0.05)，其中BCG组的早期凋亡率随时间的延长在逐步增加，H37Rv组的早期凋亡率在4 h时较低，在12 h后趋于稳定(图1)。值得注意的是通过分析其晚期凋亡和死细胞结果发现，在感染24 h后，强毒标准菌H37Rv组的凋亡率大幅下降，甚至低于对照组(图2)。

图1 结核分枝杆菌感染THP-1细胞6个时间点早期凋亡情况Fig.1 Early apoptosis of Mycobacterium tuberculosis infection in THP-1 cells at six time points

图2 THP-1细胞未感染组和H37Rv感染组5个时间点流式结果Fig.2 Streaming chart of THP-1 cells of uninfected group and H37Rv infection group at five time points

2.2 不同时间点细胞因子转录水平

对荧光定量PCR 结果用2-ΔΔCt法进行分析。通过引入管家基因，消除由于收集细胞、反转录及加样过程中产生的操作误差。用0 h 表示未经感染的对照组细胞，其表达量为1。与对照组相比各时间点差异均显著(P<0.05)，结果有统计学意义。

对于TNF-α转录水平，H37Rv组整体低于BCG组，在12 h达到最大值。BCG组的转录水平在4、12、24 h时高出对照组十倍以上(图3)。

对于IL-6转录水平，H37Rv组整体高于BCG组，在12 h达到最大值并高出对照组18.2倍。BCG组在4 h达到最大值，在1、12、24、48 h其转录水平低于对照组(图3)。

对于IL-10，相比对照组，其转录水平变化不大，H37Rv组在各时间点转录水平均高于对照组，而BCG组只有在2、4 h时其转录水平高于对照组(图3)。

2.3 不同时间点细胞因子表达结果

根据标准品浓度和OD值应用ELISAcalc软件计算标准曲线回归方程，代入测定的结果得出TNF-α、IL-10、IL-6在不同时间点上清液中分泌的细胞因子浓度。

对于TNF-α，其H37Rv组和BCG组的分泌量均显著高于对照组(P<0.05)。BCG组呈上升趋势，H37Rv组在12 h分泌量最低。

对于IL-6，其H37Rv组和BCG组的分泌量均极显著高于对照组(P<0.01)。H37Rv组在12 h达到最大值116.2 ng·L-1，BCG组在2 h后分泌量开始下降，但总体变化不大。

对于IL-10其H37Rv组和BCG组的分泌量均显著高于对照组(P<0.05)。BCG组在4 h达到最大值116.5 ng·L-1，H37Rv组呈波动变化，两者差异不显著(图3)。

3 讨 论

在结核分枝杆菌与巨噬细胞的相互作用过程中，巨噬细胞在行使免疫细胞功能杀灭结核分枝杆菌的同时，结核分枝杆菌也同时在逃逸巨噬细胞的免疫，这就造成了结核的慢性症状，使其具有潜伏性和传染性，给诊断和治疗带来了巨大困难[13-14]。研究发现，不同毒力的结核分枝杆菌感染巨噬细胞后，诱导巨噬细胞凋亡水平不同[15]。M.K.Balcewicz-Sablinska等分别用结核分枝杆菌强毒标准株H37Rv株和结核分枝杆菌减毒株H37Ra株感染肺泡巨噬细胞，结果显示，对比与对照组巨噬细胞的凋亡率均有显著增高，相比于弱毒组H37Rv组的凋亡情况明显受到抑制[16]。本研究采用FITC/PI双染试剂盒可以准确定量出不同时间点发生早期凋亡和晚期凋亡坏死的细胞。BCG组和H37Rv组的早期凋亡率均高于对照组，并且其差异具有统计学意义(P<0.05)。通过掌握不同毒力的结核分枝杆菌感染巨噬细胞的动态凋亡情况，分析巨噬细胞分泌的三种主要细胞因子对细胞凋亡产生的作用。

图3 结核分枝杆菌感染巨噬细胞6个时间点细胞因子变化情况Fig.3 Cytokine changes at six time points of Mycobacterium tuberculosis infection in macrophages

通过对荧光定量和ELISA结果分析得出BCG组TNF-α的转录水平与其逐步升高的分泌量关系相符，IL-6转录水平在12 h后被抑制与其4 h后逐步下降的分泌量关系相符，IL-10的分泌量有波动并不与其转录水平相符，分析可能还受其他因素影响。在48 h内，BCG诱导的巨噬细胞凋亡情况与TNF-α分泌量呈正相关，与IL-6的分泌量呈负相关。H37Rv组TNF-α的转录水平低于BCG组并在4、12 h时高于对照组，在24 h后被抑制。其分泌量在2 h时远高于BCG组，后逐步降低，分析在感染初期结核分枝杆菌强毒株比弱毒株更能刺激TNF-α分泌，但于感染后24 h被抑制。IL-6在12 h前的转录水平与其逐步升高的分泌量关系相符，24 h后转录水平和分泌量均下降。对比与对照组分析，可能是IL-6的分泌主要集中在前24 h，后期分泌量自然下降。IL-10的转录情况较复杂，其分泌量在4 h最高而后下降并与BCG组呈相反的趋势。在12 h后强毒株H37Rv诱导的巨噬细胞早期凋亡情况已经趋于稳定，而晚期凋亡和坏死的细胞在减少，这与12～24 h时间段内细胞因子的变化情况相符。分析此时间段是结核分枝杆菌发挥逃逸作用的关键时期。本研究通过对不同毒力结核分枝杆菌感染巨噬细胞后凋亡情况监控和其三种主要细胞因子的转录水平和分泌水平的分析，将对不同毒力结核分枝杆菌引起及抑制细胞凋亡的机制有更深层的理解。

4 结 论

BCG和H37Rv感染THP-1细胞的早期凋亡率均高于对照组，并且H37Rv组有抑制趋势。这与细胞因子TNF-α、IL-6的转录水平和分泌水平有一定相关性。通过对巨噬细胞凋亡机制的研究将有助于阐明结核病的发病机制，为结核病的防治提供新的思路。

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(编辑 白永平)

Effect of Different VirulenceMycobacteriumtuberculosison Cytokine Expression and Apoptosis of THP-1 Cells

ZHANG Yan1，SONG Ji-wei2，ZENG Fan-li3，SHI Kun3，LI Jian-ming3，LIU Yang1， LIU Fei1，SUN Fan-ting1，DU Rui3，4*

(1CollegeofAnimalScience&Technology，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China； 2.JilinPeople′sHospital，Jilin132001，China；3.CollegeofChineseMedicineMaterials，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China；4.KeyLaboratoryofAnimalProduction，ProductQualityandSecurityofMinistryofEducationofthePeople′sRepublicofChina，LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince，Changchun130118，China)

In order to investigate the relationship between apoptosis and transcription and expression of several major cytokines duringMycobacteriumtuberculosis(MTB)infection，THP-1 derived macrophage was selected to establishinvitromodel.Infected cells with different virulence MTB (H37Rv，BCG)，flow cytometry was used to detect macrophage apoptosis at six time points，quantitative PCR was used to detect transcription level of cytokines TNF-α，IL-10，IL-6，ELISA was used to detect the secretion of cell supernatants of three cytokines.The results showed：the early apoptotic rate of BCG and H37Rv group were both higher than control group and the difference was statistically significant (P<0.05).Transcription levels of cytokines，TNF-α，IL-6 were consistent with the level of secretion.There was an increase with time on apoptosis of low virulent strain，and there is a same trend on secretion of TNF-α，an opposite tendency on secretion of IL-6.Apoptosis of virulent strains was less than attenuated vaccine strain.Secretion of virulent strains was complex，like increase first and then suppression.The relationship between cytokines and apoptosis of cells at different time points may provide new ideas for study of macrophage apoptosis mechanisms.

Mycobacteriumtuberculosis；THP-1 cells；apoptosis；cytokine

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.015

2014-12-23

国家自然科学基金(31372436)；吉林省科技厅科技成果转化促进计划(20140309018YY)；吉林省科技厅科技成果转化促进计划(20140412009XH)；吉林省科技厅科技创新人才培育计划(20130521023JH)

张 妍(1989-)，女，辽宁大连人，硕士生，主要从事经济动物疫病研究，E-mail：811285453@qq.com

*通信作者：杜 锐，教授，博导，主要从事经济动物疫病研究，E-mail：durui71@126.com，Tel：0431-84510946

S852.618

A

0366-6964(2015)09-1600-06