野生水禽源ClassⅠ新城疫病毒对SPF鸡的致病性研究

杨少华，许传田，黄艳艳，张 琳，黄庆华，胡北侠，朱曼玲，张秀美

(山东省农业科学院畜牧兽医研究所 山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南 250100)

野生水禽源ClassⅠ新城疫病毒对SPF鸡的致病性研究

杨少华，许传田，黄艳艳，张 琳，黄庆华，胡北侠，朱曼玲，张秀美*

(山东省农业科学院畜牧兽医研究所 山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南 250100)

为了科学地了解新城疫病毒(NDV)的遗传进化规律，本研究对从鹭科候鸟分离的NDV毒株 SD22/13的生物学特性和致病特性进行了研究。通过致病性指数测定和交叉血凝抑制试验测定分离株SD22/13的毒力及与LaSota疫苗株、基因Ⅶ型NDV毒株的抗原相关性，同时设计引物对F基因进行克隆测序和遗传进化分析，并对其在SPF鸡上的致病性进行评价。生物学特性和遗传进化分析显示SD22/13属于ClassⅠ分支基因3型，与LaSota疫苗株的抗原相关性为56.1%，与基因Ⅶ型强毒株的抗原相关性低于50%。致病性试验结果表明该毒株可在鸡体内较好复制，并刺激机体产生较高水平血清抗体，鸡的免疫器官和肾虽均有轻微的病理损伤，但无发病死亡，对试验鸡致病性较低；SD22/13感染后30 d，再以基因Ⅶ型强毒株攻毒，在10 d观察期内SD22/13感染组鸡均健康，无发病死亡，而对照组鸡至第5天时全部死亡。本研究结果表明分离株SD22/13在生物学特性、抗原性和对SPF鸡致病性方面与基因Ⅶ型NDV存在明显差异；虽然SD22/13与基因Ⅶ强毒株抗原相关性较低，不能阻止其排毒，却能完全保护鸡抵抗强毒株的攻击。

新城疫病毒；野生水禽；致病性

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的感染多种禽类的一种急性、高度接触性传染病，是世界动物卫生组织(OIE)规定的法定报告疫病，给许多国家的养禽业造成巨大的经济损失[1]。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)又称为禽副黏病毒1型(avian paramyxovirus serotype 1，APMV-1)在分类上属于单链负股RNA病毒目(Mononegavirales)、副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)的禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)[2]。NDV都包含相同的6个开放阅读框，基因排列方式为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白，即核衣壳蛋白、磷蛋白、基质蛋白、融合蛋白、血凝素-神经氨酸酶蛋白和大分子蛋白[3]。NDV基因组全长有3种：15 186、15 192和15 198 bp，其中前2种属于ClassⅡ；后1种属于ClassⅠ[4-5]。ClassⅡ中强毒株主要来源于家禽，也有少数来自野鸟，而ClassⅠ和ClassⅡ中的低致病型毒株主要来源于水禽、野鸟和活禽交易市场[6]。

野生水禽被认为是NDV的天然存储库[7-8]，但是目前对于它的分布情况、遗传变异以及对鸡群的潜在威胁了解的甚少。为了更好地理解ClassⅠNDV的生物学特性及对不同宿主的致病性，本研究对从野生水禽上分离的一株ClassⅠ型NDV进行了生物学和遗传学特性鉴定，并对其在SPF鸡的致病性进行了评价，研究结果将为ND的防控提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 病毒、SPF鸡胚、SPF鸡

分离株SD22/13是2013年对江西九江鄱阳湖区野鸟NDV的流行病学调查中从鹭科健康野鸟采集的样品中分离，由吉林大学畜牧兽医学院鉴定并惠赠。SPF鸡胚、30日龄SPF鸡购自山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡研究中心。

1.2 分子生物学试剂

Trizol、RNase Inhibitor、RTase M-MLV、rTaq、dNTP等购自宝生物工程(大连)有限公司，琼脂糖购自上海生物工程有限公司。

1.3 病毒的生物学特性鉴定

按国际兽疫局(OIE)推荐的方法，测定病毒的最小致死量致死鸡胚的平均时间(MDT)、鸡脑内接种指数(ICPI)和鸡胚半数致死量(ELD50)。

1.4F基因的序列测定与遗传进化分析

按文献[9]方法扩增F基因，PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检查结果，阳性PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序。用于序列比较NDV参考株名称和GenBank序列登陆号如下：US(DE)/A100-2093/2000(EF564815)、US(MD)/03-62(EF564827)、US(DE)/401(EF564831)、JX07(JF893453)、J17-13(AB858995)、D-SD-24-05(FJ597593)、 US(TX)/02-25/2002(EF565030.1)、US(MD)/01-418(EF564829)、US(MD)/01-523(EF564830)、 duck/U.S./119535-1(AY626266)、mallard/US(MD)/02-336(EF564825)、9a5b(AB524406)、US(AK)/176/1998(EF564813)、US(OH)/87-78(EF564833)、US(LA)/88-71(EF565076)、US(DE)/2026(EF564819)、sw/CH/LHLJ/120608(KJ499462)、ndv10-062(HQ997385)、NDV09-051(HQ398808)、NDV08-004(FJ487637)、NDV10-089(HQ997397)、 fowl/HongKong/1368.3/2005(EF027151)、HongKong/1875/2004(EF027154)。利用DNAStar Lasergene 7.1和MEGA4.1软件进行序列比对和遗传进化分析。

1.5 交叉血凝抑制试验

按照常规方法将疫苗株LaSota和纯化的NDV分离株SD22/13、Duck/China/SD03/2009(GenBank登陆号JN400895，简写为SD03)、Chichen/China/SDLY01/2010(GenBank登陆号JN400897，简写为SDLY01)制备疫苗，其中分离株SD03和SDLY01分别为基因Ⅶ型鸭源和鸡源强毒分离株，由本室分离保存[9]。将上述4种疫苗分别免疫2月龄SPF鸡，制备抗血清。将4种NDV抗原和阳性血清分别进行交叉HI试验，HI抗原同源性的计算按免疫学方法进行：R=(r1×r2)1/2×100%，r1=异源血清效价1/同源血清效价1，r2=异源血清效价2/同源血清效价2。

1.6 NDV分离株致病性试验

1.6.1 试验分组与设计 50只21日龄SPF鸡分成2组，第一组35只以106.0EID50的SD22/13病毒尿囊液以滴鼻、点眼方式感染鸡；第二组15只为对照组，以PBS滴鼻点眼。分别于隔离罩中饲养，记录试验鸡临床症状和发病死亡情况。感染后7、14、21、30 d采血测血清抗体滴度，感染后3、7、14、21 d采集各组试验鸡喉头、泄殖腔棉拭子，接种10日龄的鸡胚，检测排毒情况；感染后第48、144、240小时每组取3只鸡，剖检，取心、肺、脾、腺胃、肠等内脏器官组织，做荧光定量PCR，测定组织中病毒载量；感染后第7、14天剖检，取脑、气管、肺、腺胃、小肠、肝、脾、肾、法氏囊于10%甲醛中固定，按常规方法做HE染色、观察。

1.6.2 SD22/13对基因Ⅶ型强毒攻毒保护试验 上述一、二组试验鸡隔离饲养观察至30 d，分别以106.0EID50的基因Ⅶ型强毒株SD03以滴鼻点眼的方式攻毒，攻毒后观察10 d，第2、7天分别采集喉头和泄殖腔棉拭子，接种10日龄鸡胚，死亡鸡胚收取尿囊液，进行血凝和血凝抑制试验检测病毒。

1.6.3 荧光定量PCR试验 根据SD22/13F基因序列设计引物，上游序列：5′-ATGCCCAAAGACAAAGAACA-3′，下游序列：5′-GGCTACACCTAATGCGACAC-3′，β-actin为参比基因，参照文献[10]设计，上游序列：5′-GAGAAATTGTGCGTGACATCA-3′，下游序列：5′-CCTGAACCTCTCATTGCCA-3′。制备10倍系列稀释的标准质粒制备标准曲线。称取0.1 g组织，于TroZol中匀浆，按常规方法提取RNA，测定浓度，用TaKaRa的M-MLV反转录酶将RNA翻译成cDNA。根据Roche Lightcycler 480 SYBR Green ⅠMaster荧光定量PCR试剂盒说明书加入各体系，反应体系为20 μL，包含Marster Mix10 μL，上下游引物各1 μL，水6 μL，样品cDNA或已知浓度的标准质粒2 μL，于Lightcycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪(Roche，Basel，Switzerland)上进行扩增。PCR反应条件：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，52 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40个循环。病毒含量的定量根据标准曲线计算获得。

2 结 果

2.1 分离株SD22/13的生物学特性

生物特性鉴定结果显示SD22/13的MDT>120 h，ICPI<0.2，根据国际兽疫局(OIE)推荐的毒力判定标准，SD22/13为低毒力株。

2.2 交叉血凝抑制试验

SD22/13与不同毒株间交叉HI结果表明，分离株SD22/13与疫苗株LaSota的抗原同源性为56.1%，与鸭源基因Ⅶ型毒株SD03的抗原同源性为43.7%，与鸡源基因Ⅶ型毒株SDLY01的抗原同源性为49.2% (表1)。

表1 SD22/13与不同NDV毒株间的HI同源性

Table 1 Correlations rate of HI among different NDV strains

病毒株VirusstrainSD22/13SD03SDLY01LaSotaSD22/13/43．7%49．2%56．1%SD0343．7%/94．9%82．5%SDLY0149．2%94．9%/89．4%LaSota56．1%82．5%89．4%/

2.3 病毒F基因序列与遗传进化分析

分离株SD22/13F基因长1 662 bp (GenBank登录号：KM669996)，编码553个氨基酸，其F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112E-R-Q-E-R-L117，符合弱毒株的序列特征。经分析F蛋白含有 6个潜在的糖基化位点(85—87、191—193、366—368、447—449、471—473和541—543 位)和12个半胱氨酸残基(76、199、338、347、362、370、394、399、401、424、514、523)。用MEGA4.1软件绘制F基因高变区(47—420 nt)核苷酸序列遗传进化树，发现SD22/13与J72-13(AB858995)等毒株同属于ClassⅠ基因3型(图1)。将F基因编码区的核苷酸序列与其他参考毒株进行比较，显示SD22/13与2013年从南昌斑嘴鸭上分离的毒株J72-13的相似性最高，为99.2%，其次为2012年的野天鹅分离株SW/CH/LHCJ/120608，相似性为98.9%，与香港分离株Hong Kong/1875/2004的相似性为93.9%。

2.4 试验鸡感染SD22/13后临床症状及病理变化

试验组鸡与对照组相比精神、采食量正常，无显著临床症状，在观察期内无发病死亡。试验组和对照组的鸡剖检，内脏组织器官均未发现眼观明显病变。通过对攻毒后第7和14天内脏组织器官的病理组织观察发现：攻毒后第7天内脏组织未发现明显病变；攻毒后第14天可见法氏囊淋巴细胞轻微减少，脾淋巴细胞明显减少，肾出血，有炎性细胞浸润(图2)。

图1 SD22/13 F基因可变区(47—420 bp)的系统进化分析Fig.1 Phylogenetic relationship of the nucleotide sequence of SD22/13 based on a variable portion (47-420 bp) of the F gene

A.法氏囊淋巴细胞轻微减少；B.脾淋巴细胞明显减少；C.肾出血，有炎性细胞浸润A.Lymphocyte slightly deceased in bursa at 14 dpi；B.Lymphocyte significantly deceased in spleen at 14 dpi；C.Kidney bleeding and inflammatory cells infiltration at 14 dpi图2 攻毒后SPF鸡内脏组织病理变化(HE染色，400×)Fig.2 Histopathological changes detected by HE staining in different organ of chicken experimentally infected with SD22/13 (HE staining，400×)

2.5 试验鸡感染后喉头和泄殖腔病毒检测

对各组试验鸡于感染后第3、7、14、21天采集喉头、泄殖腔棉拭子处理后接种9～10日龄鸡胚进行病毒分离，结果见表2。试验组鸡自攻毒后第7天从喉头和泄殖腔中可检出病毒，检测阳性率均为50%，至第21天从喉头和泄殖腔中仍可检测到病毒，但检测阳性率下降至16.7%，而对照组试验鸡喉头、泄殖腔均未检出病毒。

表2 试验鸡攻毒后不同时间喉头和泄殖腔棉拭子排毒检测结果

Table 2 Results of virus isolation from laryngeal and cloacal swabs of chickens on different day post inoculation

组别Group喉头棉拭子Laryngealswab泄殖腔棉拭子Cloacalswab第3天Day3第7天Day7第14天Day14第21天Day21第3天Day3第7天Day7第14天Day14第21天Day21试验组Experimentgroup0/63/63/61/60/63/62/61/6对照组Controlgroup0/60/60/60/60/60/60/60/6

2.6 感染后不同时间内脏器官病毒含量检测

对感染后第48、144、240小时试验组和对照组的鸡内脏组织病毒载量进行荧光定量PCR检测，结果见图3。从结果可知在感染后所检测各脏器均检出病毒，脾、肺、肠、腺胃的病毒含量在攻毒后第48小时时达最高值，之后呈逐渐下降的趋势；心、气管的病毒量在攻毒后缓慢上升，至第240小时时达到最高；在各脏器中肠的病毒载量最高，之后依次是脾、肺、脑、腺胃、气管，心的含毒量最低。

图3 感染后不同时间组织器官病毒载量变化Fig.3 Viral load change of organs in different time after infection

2.7 试验鸡感染后NDV抗体检测

各组试验鸡于感染后第7、14、21、30天每组随机取5只采血，进行NDV抗体检测，结果见图4。攻毒后第7天试验组抗体平均值为7.83 log2，至第14天时抗体滴度达到峰值，为8.67 log2，至第30天时试验组鸡抗体平均值为7.4 log2，而对照组血清抗体为0。

图4 试验鸡NDV HI抗体效价Fig.4 Antibody titre of chickens in Hemagglutination inhibition (HI) test

2.8 SD22/13对基因Ⅶ型强毒攻毒保护试验

30 d观察期结束后，试验组剩余的26只鸡和对照组的6只鸡均健康，用SD03强毒株以106.0EID50的剂量对其进行攻毒，于隔离罩中隔离饲养观察。SD22/13感染组鸡在10 d的观察期内精神、食欲正常，无发病死亡，而对照组鸡在攻毒后第2天死亡1只，第3天时5只全部死亡，SD22/13感染组鸡第7天的喉头拭子和泄殖腔拭子均检出病毒。

3 讨 论

野鸟和野生水禽被认为是 NDV的天然储库，从野鸟和野生水禽分离到的NDV多为ClassⅠ弱毒株[6,11-12]，从家养水禽中也有分离到ClassⅠNDV弱毒株的报道。刘秀梵(X.Liu)等于2002—2005 年间我国东部活禽交易市场家鸭中分离201株 NDV，其中14.9% 为ClassⅠ毒株[11]。L.M.Kim等在香港活禽市场健康活禽泄殖腔拭子中分离到NDV，其中ClassⅠ毒株占 91.3%[8]。本室曾于2007—2008年间从山东肉鸭场健康鸭泄殖腔拭子中分离到了 30株NDV，其中有4株为ClassⅠ[13]。可见ClassⅠNDV在我国健康禽群的带毒率很高[14]。

本研究所用毒株SD22/13是从江西野生鹭科水鸟分离，属于ClassⅠ分支基因3型，与近年来我国南方地区、香港活禽交易市场分离到的毒株遗传关系较近。SD22/13为弱毒株，对鸡无明显致病性，但SPF 鸡在感染后的第7天开始排毒，至第21天时仍可检测到，而内脏组织在第2天即检测出病毒；血清抗体水平在感染1周后达到8.67log2，至第30天时抗体滴度为7.4log2。表明SD22/13可于鸡体内以较高的滴度复制，并可刺激机体产生较强的体液免疫反应，这与赵晨辰的研究结果一致[14]。

交叉血凝抑制试验显示，SD22/13与疫苗株LaSota的抗原相关性为56.1%，与ClassⅡ分支中基因Ⅶ型毒株的抗原相关性低于50%。虽然SD22/13与ClassⅡ分支中毒株的抗原相关性较低，但SD22/13攻毒后30 d再以基因Ⅶ型强毒株攻毒，攻毒鸡无发病死亡，精神食欲正常，对照组鸡全部死亡，表明ClassⅠ弱毒株SD22/13对鸡起到了完全的保护，但喉头和泄殖腔棉拭子仍能检测出排毒。孟春春(C.C.Meng)等对ClassⅠ弱毒株JS10的动物实验研究发现注射JS10的SPF鸡35 d后再以基因Ⅶ型强毒株ZJ1攻毒，鸡无发病死亡，与注射LaSota的对照组相比，排毒时间减少，排毒量降低[15]。

目前ClassⅡ的基因Ⅶ型NDV仍是我国禽群中的主要流行毒株，但ClassⅠNDV在禽群中的高带毒率也应引起重视。虽然ClassⅠNDV对家禽无明显的致病性，在家禽中的带毒状态在一定程度上有利于提高家禽对ND的保护，但另一方面NDV毒株间的相互影响和作用增加了病毒变异的可能。目前虽然尚不清楚 ClassⅠ毒株在 NDV 演化过程中的作用，但在实验室条件下ClassⅠ型NDV可在体外传代过程中逐渐演变为强毒株[16]，ClassⅠ NDV毒株在野鸟和鸡群中循环，存在演变成强毒株的风险，因此，加强对NDV的分子流行病学监测，研究ClassⅠNDV的毒力演化局势及对禽群的影响对于预防和控制ND具有重要的意义。

4 结 论

SD22/13属于ClassⅠ基因3型弱毒株，能在鸡体内以较高的滴度复制，并能刺激机体产生高水平抗体。虽然与疫苗株LaSota和基因Ⅶ型NDV的抗原相关性较低，但SD22/13毒株能完全保护试验鸡抵抗基因Ⅶ型强毒株的攻击，但不能抑制其排毒。

[1] ALEXANDER D J，SAIF J M，BARNES H J，et al.Newcastle disease，other avian paramyxoviruses and pneumovirus infections[M]// SAIF Y M，BARNES H J，GLISSON J R，et al.Disease of Poultry.11 edition.Ames，IA：Iowa State University Press，2003:63-99.

[2] MAYO M A.Virus taxonomy-Houston 2002[J].ArchVirol，2002，147(5):1071-1076.

[3] KATTENBELT J A，STEVENS M P，GOUD A R.Sequence variation in the Newcastle disease virus genome[J].VirusRes，2006,116(1-2):168-184.

[4] HUANG Y，WAN H Q，LIU H Q，et al.Genomic sequence of an isolate of Newcastle disease virus isolated from an outbreak in geese：a novel six nucleotide insertion in the non-coding region of the nucleoprotein gene[J].ArchVirol，2004,149(7):1445-1457.

[5] ZOU J，SHAN S,YAO N，et al.Complete genome sequence and biological characterizations of a novel goose paramyxovirus-SF02 isolated in China[J].VirusGenes，2005，30(1):13-21.

[6] KIM L M，KING D J，CURRY P E，et al.Phylogenetic diversity among low-virulence newcastle disease viruses from waterfowl and shorebirds and comparison of genotype distributions to those of poultry-origin isolates[J].JVirol，2007，81(22):12641-12653.

[7] TAKAKUWA H，ITO T，TAKADA A，et al.Potentially virulent Newcastle disease viruses are maintained in migratory waterfowl populations[J].JpnJVetRes，1998，45(4)：207-215.

[8] KIM L M，KING D J，SUAREZ D L，et al.Characterization of class I Newcastle disease virus isolates from Hong Kong live bird markets and detection using real-time reverse transcription-PCR[J].JClinMicrobiol，2007，45(4)：1310-1314.

[9] 杨少华,胡北侠,许传田，等.三株新城疫病毒强毒株的生物学特性及全基因组序列分析[J].病毒学报，2012,28(2):143-150. YANG S H，HU B X，XU C T，et al.Biological characteristics of three Newcastle disease virus isolates and entire genome sequences analysis[J].ChineseJournalofVirology，2012，28(2):143-150.(in Chinese)

[10] YIN R，DING Z，LIU X，et al.Inhibition of Newcastle disease virus replication by RNA interference targeting the matrix protein gene in chicken embryo fibroblasts[J].JVirolMethods，2010，167(1):107-111.

[11] LIU X，WANG X，WU S，et al.Surveillance for avirulent Newcastle disease viruses in domestic ducks (AnasplatyrhynchosandCairinamoschata) at live bird markets in Eastern China and characterization of the viruses isolated[J].AvianPathol，2009，38(5)：377-391.

[12] ALEXANDER D J，CAMPBELL G，MANVELL R J，et al．Characterisation of an antigenically unusual virus responsible for two outbreaks of Newcastle disease in the Republic of Ireland in 1990[J].VetRec，1992，130(4)：65-68．

[13] HU B，HUANG Y，HE Y，et al.Avian influenza virus and Newcastle disease virus (NDV) surveillance in commercial breeding farm in China and the characterization of Class I NDV isolates[J].VetMicrobiol，2010，144(1-2):82-86.

[14] 赵晨辰.中国农业科学院中国部分地区2010～2012年新城疫病毒分子流行病学研究[D].哈尔滨:中国农业科学院，2013. ZHAO C C.Molecular epidemiology of Newcastle disease virus isolated in partial region of China during 2010-2012[D].Harbin：Chinese Academy of Agriculture Science，2013.(in Chinese)

[15] MENG C C，QIU X，JIN S，et al.Whole genome sequencing and biological characterization of Duck/JS/10，a new lentogenic class I Newcastle disease virus[J].ArchVirol，2012，157(5):869-880.

[16] SHENGQING Y，KISHIDA N，ITO H，et al.Generation of velogenic Newcastle disease viruses from a nonpathogenic waterfowl isolate by passaging in chickens[J].Virology，2002，301(2):206-211.

(编辑 白永平)

Research on Pathogenicity of SPF Chicken Infected with a Class Ⅰ NDV Isolated from Waterfowl

YANG Shao-hua，XU Chuan-tian，HUANG Yan-yan，ZHANG Lin，HUANG Qing-hua， HU Bei-xia，ZHU Man-ling，ZHANG Xiu-mei*

(ShandongKeyLabofAnimalDiseaseControlandBreeding，InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100,China)

A lentogenic Newcastle disease virus (NDV)，SD22/13，was isolated from heron.The biology and pathogenicity were characterized in order to understand the evolution of NDV better.Fgene of SD22/13 was sequenced and compared with that of reference strains.The antigenicity of the virus was compared with that of LaSota and other genotype Ⅶ virulent NDV strains via cross hemagglutination inhibition (HI).The pathogenicity of SD22/13 to SPF chicken was also conducted.The results indicated that SD22/13 was classified as a class Ⅰ genotype 3 NDV based on a partial sequence of theFgene.The antigenicity correlation between SD22/13 and LaSota was 56.1%，and the correlation of which with genotype Ⅶ NDV strains was less than 50%.Experiments on animals demonstrate that the isolate SD22/13 can replicate well in SPF chicken and induce a high immune antibody and had slight pathogenic to immune organ and kidney.Chickens inoculated with SD22/13 were challenged with genotype Ⅶ virulence NDV strain on 30dpi，and there had no death in chickens infected with SD22/13.The results demonstrated that SD22/13 stain had significant differences with genotypeⅦ NDV in biological characterization and pathogenic to chickens.Although the antigenic correlation was low between SD22/13 and genotype Ⅶ NDV，class I viruses can provide 100% protection rate，but it cannot block virus shedding upon challenge with genotypeⅦ virulent NDV.

Newcastle disease virus；wild waterfowl；pathogenicity

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.016

2014-12-06

公益性行业(农业)科研专项(201003012；201303033)；现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-42-Z12)

杨少华(1978-)，女，山东烟台人，硕士，助理研究员，主要从事禽病综合防控技术研究，Tel:0531-88622611，E-mail：ysh7865@163.com

*通信作者：张秀美(1956-)，女，江苏徐州人，研究员，主要从事禽病综合防控技术研究，E-mail：zxm820410@163.com

S852.659.5

A

0366-6964(2015)09-1606-07