禽呼肠孤病毒蛋白质启动PI3K/Akt信号通路的分析

谢丽基，谢芝勋，黄　莉，谢志勤，邓显文，刘加波，罗思思，黄娇玲， 曾婷婷，张艳芳，王　盛

(广西壮族自治区兽医研究所 广西畜禽疫苗新技术重点实验室， 南宁 530001)

禽呼肠孤病毒蛋白质启动PI3K/Akt信号通路的分析

谢丽基，谢芝勋*，黄莉，谢志勤，邓显文，刘加波，罗思思，黄娇玲， 曾婷婷，张艳芳，王盛

(广西壮族自治区兽医研究所 广西畜禽疫苗新技术重点实验室， 南宁 530001)

旨在找出激活PI3K/Akt信号通路的禽呼肠孤病毒(ARV)蛋白质。选取ARV中潜在具有激活PI3K/Akt信号通路活性的σA、σNS、μA、μB和μNS蛋白作为研究对象，将这5个基因克隆到真核表达载体pcAGEN，成功构建重组质粒σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN。将构建的重组质粒转染Vero细胞，采用间接免疫荧光和Western blot检测目的蛋白质的表达，并通过流式细胞术和Western blot，检测转染后Vero细胞磷酸化Akt(P-Akt)的表达量。结果显示，5个目的蛋白质均得到表达。转染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN的Vero细胞，P-Akt的表达量明显升高，而使用PI3K特异性抑制剂LY294002则能抑制P-Akt的表达量明显升高。结果表明，ARV的σA蛋白和σNS蛋白能激活细胞的PI3K/Akt信号通路。

禽呼肠孤病毒；PI3K/Akt信号通路；蛋白质

真核细胞内存在多条信号转导通路，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路在众多信号通路中发挥十分重要的作用，可通过其下游效应分子蛋白激酶B(Akt)来调控多种细胞功能，如细胞增殖与分化、抑制细胞凋亡等，病毒感染通常会干扰该信号通路。PI3K是由催化亚基p110和调节亚基p85所组成的二聚体蛋白，具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性[1]。研究表明，病毒蛋白质或细胞蛋白质通过PXXP(P为脯氨酸，X为任意氨基酸)或YXXXM/YXXM(Y为酪氨酸，X为任意氨基酸，M为蛋氨酸)基序与p85结合，从而激活PI3K/Akt信号通路，使磷酸化的Akt(P-Akt)表达量升高，实现抑制细胞凋亡的发生[2-7]。

L.Labrada等[8]和W.L.Shih等[9]的研究表明，禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV)引起感染细胞出现细胞凋亡是发生在其感染的中后期。P.Y.Lin等[10]使用ARV感染Vero细胞后，通过Western blot检测P-Akt的表达量，从病毒的角度证实ARV感染的早期激活PI3K/Akt信号通路，从而抑制感染细胞的凋亡，以有利于ARV完成其复制周期。ARV有10个结构蛋白(λA、λB、λC、μA、μB、μBc、μBN、σA、σB、σC)和5个非结构蛋白(μNSC、μNS、σNS、和P10、P17)[11-12]， ARV是通过哪一个蛋白质来启动PI3K/Akt信号通路，实现抑制感染细胞的凋亡，目前还不清楚。

本研究对ARV 15个蛋白质的氨基酸序列进行了分析，表明其中σA、σNS、μA、μB和μNS共5个蛋白质具有PXXP和YXXXM/YXXM基序(即这5个蛋白质具有潜在激活PI3K/Akt信号通路的活性)，并且这些氨基酸序列在ARV不同毒株之间都是保守的。因此本课题选取这5个蛋白质作为研究对象，构建了重组质粒σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN，转染Vero细胞后，分析Vero细胞P-Akt表达量的差异，旨在找出能激活PI3K/Akt信号通路的ARV蛋白，从细胞信号转导的角度揭示ARV的分子致病机制，为寻找抗ARV药物作用靶点提供新的思路。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1毒株、质粒和细胞禽呼肠孤病毒S1133标准强毒株(ARV-S1133)购自中国兽医药品监察所；真核表达载体pcAGEN由美国南达科他州大学Xiu-qing Wang教授惠赠；Vero细胞由本实验室保存。1.1.2试剂及仪器TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)、pMD18-T载体、限制性内切酶(XhoⅠ与NotⅠ)和T4连接酶购自宝生物工程(大连) 有限公司；Easy pure viral DNA/RNA kit、胶回收试剂盒、无内毒素质粒大量提取试剂盒购自北京TransGen Biotech公司； Lipofectamin2000购自Invitrogen公司；Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY、Alexa fluor标记的羊抗兔IgG 、HRP标记的羊抗鸡IgG、HRP标记的羊抗兔IgG和Phospho-Akt 单克隆抗体购自CST公司；DMEM培养基购自GIBCO公司；胎牛血清购自Hyclone公司；Cytofix固定/破膜试剂盒购自BD公司；PI3K特异性抑制剂LY294002购自CST公司；ARV阳性血清由本实验室保存。贝克曼Navios 流式细胞仪；Invitrogen IblotTM干式Western blotting转印仪；BioRad成像系统。

1.2引物的设计与合成

根据ARV的σA、σNS、μA、μB和μNS基因序列，设计了5对引物(表1)，斜体标记为酶切位点(XhoⅠ与NotⅠ)，下划线处为Kozak序列。

1.3核酸提取与目的基因扩增

参照Easy pure viral DNA/RNA kit说明书，抽提ARV的RNA，使用试剂盒TaKaRa RNA LA PCR Kit进行反转录和PCR反应。

PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，32个循环；72 ℃ 10 min。

1.4与pMD18-T载体的连接及转化

使用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，回收产物与pMD18-T于16 ℃连接过夜，转化到DH5α感受态细胞中。得到的阳性质粒分别命名为σA-pMD18-T、σNS-pMD18-T、μA-pMD18-T、μB-pMD18-T和μNS-pMD18-T。

1.5重组质粒的构建

使用质粒提取试剂盒提取质粒pcAGEN、σA-pMD18-T、σNS-pMD18-T、μA-pMD18-T、μB-pMD18-T和μNS-pMD18-T。 将真核表达载体pcAGEN质粒和含有目的基因的pMD18-T质粒分别用XhoⅠ与NotⅠ进行双酶切，切胶回收，使用T4连接酶连接过夜，转化到DH5α感受态细胞中。阳性克隆分别命名为σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN。阳性重组质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。

表1引物序列

Table 1Primer sequence

扩增基因Gene引物名称Primername引物序列(5′⁃3′)Sequence(5′⁃3′)目的片段/bpTargetfragmentsizeσAσA⁃FσA⁃RGATGATCTCGAGGCCACCATGGCGCGTGCCATATACGACATCGCGGCCGCTTAGGCGGTAAAAGTGGCTAGAAC1248σNSσNS⁃FσNS⁃RGATGATCTCGAGGCCACCATGGACAACACCGTGCGTGTTATCGCGGCCGCTTACGCCATCCTAGCTGGAGAGAC1101μAμA⁃FμA⁃RGATGATCTCGAGGCCACCATGGCCTATCTAGCCACACCTATCGCGGCCGCTTAGTGCTCGCCTCCAACCGTCGA2196μBμB⁃FμB⁃RGATGATCTCGAGGCCACCATGGGAAACGCAACGTCTGTCATCGCGGCCGCTTACGATGGTTTGAACAACGTCTG2028μNSμNS⁃FμNS⁃RGATGATCTCGAGGCCACCATGGCGTCAACCAAGTGGGGAATCGCGGCCGCTTACAGATCATCCACCAACTCTTC1905

1.6转染细胞

参照无内毒素质粒大量提取试剂盒说明书大量提取质粒(pcAGEN、σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN)，-20 ℃保存备用。

参照脂质体转染试剂盒LipofectamineTM2000的使用说明，将质粒分别转染长成单层的Vero细胞(6孔板)，同时设立阴性细胞对照组。

1.7间接免疫荧光、Western blot检测目的蛋白质的表达

转染Vero 细胞2、4、6、12和24 h后，用PBST洗涤3次，用置于-20 ℃保存的冷丙酮(丙酮∶乙醇=2∶3)进行固定，500 μL·孔-1，室温作用10 min。用PBST洗涤3次，加入1∶100倍稀释的ARV阳性血清200 μL·孔-1，37 ℃作用1 h。用PBST洗涤3次，加入1∶500稀释的Alexa fluor标记的羊抗鸡IgY，200 μL·孔-1，37 ℃作用1 h。用PBST洗涤3次，加甘油缓冲液(甘油∶PBS=1∶1)100 μL·孔-1。倒置荧光显微镜下观察。

同时，收集转染后的Vero细胞，参照Z.Xie等[13]的方法，对目的蛋白质σA、σNS、μA、μB和μNS进行Western blot检测。

1.8流式细胞术和Western blot检测P-Akt的表达

由于ARV激活P-Akt是发生在ARV感染的早期，并且根据1.7的检测结果，选择转染4、6和12 h后的Vero细胞，进行流式细胞术和Western blot的检测。收集的Vero细胞，用Cytofix固定/破膜试剂盒固定细胞20 min，FACS洗涤2次，加入1∶100稀释的Phospho-Akt 单克隆抗体作用30 min，FACS洗涤2次，加入1∶500稀释的Alexa fluor标记的羊抗兔IgG 作用30 min，FACS洗涤1次，加入300 μL FACS重悬浮细胞，上流式细胞仪检测P-Akt的表达量，记录分析数据。

同时，收集转染后的Vero细胞，参照X.Wang等[14]的方法，对Vero细胞中的P-Akt进行Western blot检测。重复整个试验3次。

1.9依赖于PI3K途径的检测

按照1.6的步骤进行转染，设立σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、LY294002+σA-pcAGEN、LY294002+σNS-pcAGEN、pcAGEN和空白细胞对照组。转染前1 h，LY294002+σA-pcAGEN和LY294002+σNS-pcAGEN组，加入PI3K特异性抑制剂LY294002，并使终浓度为20 μmol·L-1。然后按照1.8的步骤检测P-Akt的表达。分析检测转染σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN后，细胞P-Akt表达的升高是否依赖于PI3K的激活。

2　结　果

2.1目的基因的扩增

扩增的σA、σNS、μA、μB和μNS编码基因片段大小与预期相符(图1)。

2.2重组质粒的体外瞬时表达

间接免疫荧光和Western blot检测结果显示，转染6 h后，目的蛋白质σA、σNS、μA、μB和μNS均得到了较好的表达，而空载体pcAGEN组和阴性细胞对照组均为阴性。其中，转染6 h的间接免疫荧光检测结果见图2，Western blot检测结果见图3。

M.DL2500 bp ladder DNA marker；1.σA；2.σNS；3.μA；4.μB；5.μNS图1　σA、σNS、μA、μB和μNS编码基因的PCR扩增产物Fig.1　PCR amplified products of σA，σNS，μA，μB and μNS encoding gene

2.3流式细胞术和Western blot检测P-Akt的表达

流式细胞术和Western blot检测发现，σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN在转染细胞4、6和12 h后，阳性率均高于阴性对照组和pcAGEN空载体组(P<0.01)，表明转染σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN的Vero细胞P-Akt的表达量，明显高于阴性对照组和pcAGEN空载体组(表2)。而μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN转染细胞后，阳性率与阴性对照组和pcAGEN空载体组差异不大(P>0.05)，表明P-Akt的表达量未产生明显变化。在σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN转染的不同时间里(4、6和12 h)，Vero细胞P-Akt的表达量差异不大。转染6 h的流式细胞术检测结果见图4，Western blot检测结果见图5。

A.阴性对照；B.pcAGEN；C.σA-pcAGEN；D.σNS-pcAGEN；E.μA-pcAGEN；F.μB-pcAGEN；G.μNS-pcAGENA.Negative control；B.pcAGEN；C.σA-pcAGEN；D.σNS-pcAGEN；E.μA-pcAGEN；F.μB-pcAGEN；G.μNS-pcAGEN图2　重组质粒转染Vero细胞后的瞬时表达(6 h)Fig.2　Expression of recombined plasmid on the transfected Vero cells (6 h)

1.阴性对照；2.pcAGEN；3.σA-pcAGEN；4.σNS-pcAGEN；5.μA-pcAGEN；6.μB-pcAGEN；7.μNS-pcAGEN1.Negative control；2.pcAGEN；3.σA-pcAGEN；4.σNS-pcAGEN；5.μA-pcAGEN；6.μB-pcAGEN；7.μNS-pcAGEN图3　Western blot 检测目的蛋白质的表达 (6 h)Fig.3　Western blot analysis of the expression of the proteins(6 h)

使用流式细胞术和Western blot方法，检测转染σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN后，细胞P-Akt表达的升高是否依赖于PI3K的激活。流式细胞术检测结果显示，转染LY294002+σA-pcAGEN和LY294002+σNS-pcAGEN的细胞，P-Akt的表达量明显少于转染σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN的细胞(P<0.05)，而与pcAGEN和空白细胞对照组差异不大(P>0.05)，说明细胞P-Akt表达的升高，依赖于σA-pcAGEN和σNS-pcAGEN对PI3K激活。Western blot的检测结果与流式细胞术检测结果一致。

Table 2　FCM analysis of the P-Akt expression levels (±s) %

同一行中相同字母代表差异不显著(P>0.05)，不同字母代表差异极显著(P<0.01)

Different letters in the same row means extremely significant difference between the treatments (P<0.01)，same letters in the same row means no significant difference between treatments (P>0.05)

A.阴性对照；B.pcAGEN；C.σA-pcAGEN；D.σNS-pcAGEN；E.μA-pcAGEN；F.μB-pcAGEN；G.μNS-pcAGENA.Negative control；B.pcAGEN；C.σA-pcAGEN；D.σNS-pcAGEN；E.μA-pcAGEN；F.μB-pcAGEN；G.μNS-pcAGEN图4　流式细胞术检测P-Akt的表达Fig.4　FCM analysis of the P-Akt expression levels

1.阴性对照；2.pcAGEN；3.σA-pcAGEN；4.σNS-pcAGEN；5.μA-pcAGEN；6.μB-pcAGEN；7.μNS-pcAGEN1.Negative control；2.pcAGEN；3.σA-pcAGEN；4.σNS-pcAGEN；5.μA-pcAGEN；6.μB-pcAGEN；7.μNS-pcAGEN图5　Western blot 检测P-Akt的表达Fig.5　Western blot analysis of the P-Akt expression levels

3　讨　论

大量的研究资料表明，当病毒侵入宿主细胞后，被感染的细胞能被宿主的免疫系统识别，并通过诱导细胞凋亡而对感染了病毒的细胞加以清除，从而限制病毒在细胞内的复制及传播[15-17]。但是在选择压力的作用下，许多病毒已经进化出某些可以逃避细胞凋亡的机制，使得病毒在宿主细胞死亡之前能完成其复制周期，这些对抗措施通常是由病毒蛋白质来介导的[6，15-17]。许多病毒通过自身的某些蛋白质与PI3K的 P85调节亚基结合，进而激活PI3K/Akt信号通路，促进P-Akt的转录表达。P-Akt 表达量的升高，可磷酸化许多信号蛋白，并通过这些蛋白质调节与细胞生存、增殖、迁移、分化和凋亡有关的多条下游信号转导通路，如通过抑制促凋亡蛋白质的活性，从而抑制凋亡刺激信号诱发的细胞凋亡，还可通过控制凋亡调节基因的表达而抑制细胞凋亡[2-7，18-19]。

目前，还未见有相关研究报道指出，ARV是通过哪一个病毒蛋白质来激活PI3K/Akt信号通路的。本研究选取ARV中潜在具有激活PI3K/Akt信号通路的σA、σNS、μA、μB和μNS蛋白作为研究对象，将这5个ARV蛋白质的编码基因克隆到真核表达载pcAGEN，成功构建了重组质粒σA-pcAGEN、σNS-pcAGEN、μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN。将构建的5种重组质粒分别转染Vero细胞，通过流式细胞术和Western blot，检测转染后Vero细胞P-Akt的表达量，发现转染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN的Vero 细胞，P-Akt 的表达量明显升高。而转染σA-pcAGEN或σNS-pcAGEN前在细胞培养液中加入PI3K特异性抑制剂LY294002，结果显示检测到的P-Akt并没有升高，说明Akt磷酸化依赖于PI3K的激活，首次证实了ARV的σA蛋白和σNS蛋白能激活细胞内的PI3K/Akt信号通路。

PI3K/Akt信号转导通路的激活可抑制宿主细胞的凋亡，以有利于病毒的复制[2-7，14，18-19]。与许多病毒相似，PI3K/Akt信号转导通路的激活与ARV的复制有密切关系[10]，因此，有望通过控制ARV σA蛋白和σNS蛋白的表达，来调节PI3K/Akt信号转导通路进而抑制ARV的复制，从而发现新的药物靶点，为ARV的治疗提供新的方向和思路。同时，本研究从细胞信号转导的角度，揭示了ARV的分子致病机制，也为进一步探索针对ARV的有效防治措施提供理论依据。

Y.Shin等[6]对甲型流感病NS1蛋白的研究表明，NS1蛋白同时通过PXXP和YXXXM位点与p85结合，从而激活了PI3K/Akt信号途径。人乳头瘤病毒则通过YXXM位点来激活PI3K/Akt信号途径[7]。ARV的σA和σNS蛋白是否与这些病毒一样，是通过PXXP或YXXXM/YXXM基序与P85结合，从而激活PI3K/Akt信号通路，使磷酸化的Akt(P-Akt)表达量升高，实现抑制细胞凋亡的，还有待进一步的研究。

本研究将构建的μA-pcAGEN、μB-pcAGEN和μNS-pcAGEN重组质粒，转染Vero细胞后，采用间接免疫荧光和Western blot检测，证实μA、μB和μNS这3个目的蛋白质，与σA和σNS一样均得到了很好的表达，但在转染后的检测中却发现，其转染的细胞P-Akt的表达量并没有明显改变，推测这3个蛋白质与PI3K/Akt信号通路之间并没有直接的激活作用。μA、μB和μNS这3个蛋白质以及ARV的其他蛋白质是否有增强或抑制σA和σNS激活PI3K/Akt信号通路的作用，目前还不清楚。W.L.Shih等[9]构建表达ARVσC蛋白的重组表达质粒σC-pcDNA3.1，σC-pcDNA3.1转染Vero细胞后发现，σC蛋白可诱导细胞发生凋亡。σC蛋白的功能，与ARV σA和σNS蛋白的功能(抑制细胞凋亡)相反，σC蛋白的表达是否会抑制σA和σNS蛋白激活PI3K/Akt信号通路，目前也还不清楚。这些问题还有待进一步的研究。

4　结　论

ARV的σA蛋白和σNS蛋白能激活PI3K/Akt信号通路，使细胞P-Akt的表达量增高。

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(编辑白永平)

The Study of the Activation of PI3K/Akt Pathway by the Protein of Avian Reovirus

XIE Li-ji，XIE Zhi-xun*，HUANG Li，XIE Zhi-qin，DENG Xian-wen，LIU Jia-bo，LUO Si-si， HUANG Jiao-ling，ZENG Ting-ting，ZHANG Yan-fang，WANG Sheng

(GuangxiVeterinaryResearchInstitute，GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandDiagnostics，Nanning530001，China)

This study was conducted to find out the avian reovirus (ARV) proteins which can activate the phosphatidylinositol 3-Kinase-dependent Akt(PI3K/Akt) pathway.According to the analysis of amino acid sequence of ARV proteins，the σA，σNS，μA，μB and μNS were selected as the putative proteins which mediated the activation of PI3K/Akt pathway.Reconbinant plasmids，σA-pcAGEN，σNS-pcAGEN，μA-pcAGEN，μB-pcAGEN and μNS-pcAGEN were constructed and transfected into Vero cells，and the expression of the target genes were identified by immunofluorescence test and Western blot.The phosphorylated Akt (P-Akt) profile of transfected cells were examined by flow cytometry and Western blot.The results showed that σA，σNS，μA，μB and μNS genes were expressed in the Vero cells，and the expression of P-Akt of σA-pcAGEN and σNS-pcAGEN groups increased markedly.The PI3K inhibitor LY294002 could inhibit the expression of the P-Akt of σA-pcAGEN and σNS-pcAGEN groups.The results indicate that σA and σNS protein could activate the PI3K/Akt pathway.

ARV；PI3K/Akt pathway； protein

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.09.017

2014-12-19

国家自然科学基金项目(31160512)；广西特聘专家专项(2011B020)；广西科技重大专项(1222003-2-4)

谢丽基(1981-)，女，广西灵山人，副研究员，硕士，主要从事动物传染病病原分子生物学研究, Tel:0771-3120371, E-mail: xie3120371@126.com

*通信作者：谢芝勋， E-mail: xiezhixun@126.com

S852.659.4

A

0366-6964(2015)09-1613-07