鸡包涵体肝炎病原检测及病理学观察

王 婉，王彦红，刘 伊，金文杰，石火英

(扬州大学兽医学院病理教研室，禽类预防医学教育部重点实验室，扬州 225009)

鸡包涵体肝炎病原检测及病理学观察

王 婉，王彦红，刘 伊，金文杰，石火英*

(扬州大学兽医学院病理教研室，禽类预防医学教育部重点实验室，扬州 225009)

取临床疑似鸡包涵体肝炎病例的肝组织，接种SPF鸡胚获取尿囊液，对获取的尿囊液进行PCR扩增和基因测序分析，成功分离并鉴定出1株鸡包涵体肝炎病毒，同时对送检病例采样进行病理组织学观察。将病死鸡肝组织研磨后，经尿囊腔接种9日龄的SPF鸡胚，用获得的尿囊液提取病毒DNA,成功获得DNA模板。根据已发表的Ⅰ群禽腺病毒hexon全基因的保守区域设计并合成1对引物，用这对引物对病毒的DNA模板进行PCR扩增,结果扩增出与目的基因大小一致的片段。病理学观察见肝组织淤血，细胞核浓缩，发生坏死，核内出现包涵体，伴有脂肪变性。测序分析表明，分离株与Ⅰ群禽腺病毒中血清4型相似性为98.6%，与其他血清型的相似性为68.7%～96.9%，与Ⅱ群禽腺病毒的鸡出血性肠炎病毒和Ⅲ群禽腺病毒的减蛋综合征病毒的相似性为44.6%，最终确定分离病毒为Ⅰ群禽腺病毒，为进一步鉴定和分离Ⅰ群禽腺病毒提供了依据。

鸡包涵体肝炎；禽腺病毒；分离；鉴定；hexon基因

禽腺病毒(fowl adenovirus，FAV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属，根据其抗原性的不同可分为3个群，其中从鸡分离的Ⅰ群FAV有12个血清型(FAV1～12)。Ⅱ群FAV包括火鸡出血性肠炎病毒(HEV)、大理石脾病病毒和鸡大脾病病毒，它们与Ⅰ群FAV无抗原相关性。Ⅲ群FAV有减蛋综合征病毒(egg drop syndrom virus，EDSV)和从鸭分离到的腺病毒，它们与Ⅰ群FAV只有部分的共同抗原。Ⅰ群FAV含有相同的群抗原，其中比较著名的病毒株有鸡胚致死孤儿病毒(CELO virus)、鹌鹑支气管炎病毒、鸡包涵体肝炎病毒[1]。而由Ⅰ群FAV引起的鸡包涵体肝炎，作为一种散发病，虽时有发生，但若无并发症，死亡率并不高，尚未引起广泛关注，加之目前国内尚无有效的疫苗，该病时有发生，给养殖环境带来了潜在威胁[2]。鸡包涵体肝炎(inclusion body hepatitis in chicken，IBH)又称鸡贫血综合征(anemia syndrome)，是由FAV引起的鸡的一种急性传染病，主要侵害雏鸡，多呈急性经过。IBH潜伏期一般23 d，特征是发病后34 d突然出现死亡，高峰期一般第5天停止，但偶尔也持续2～3周。发病率低，病鸡呈卷曲姿势，羽毛粗乱，在2 d内死亡或康复，死亡率为10%～30%，与传染性法氏囊病、鸡新城疫、禽白血病、马立克病、网状内皮增生症、大肠埃希菌病等发生混合感染时可导致鸡群较高的死亡率[3]。正常情况下IBH多见于3～7周龄的肉鸡，但早至7日龄，晚到20周龄也有发病。

本试验通过观察鸡的大体病变，病理学观察，用鸡肝病料接种SPF鸡胚分离病毒，提取DNA，再经PCR鉴定，最终通过对FAVhexon基因进行序列及遗传进化分析，确定该病毒为鸡包含体肝炎病毒(IBHV)，为Ⅰ群FAV的诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要设备及试剂

SW-CJ-1F 型单人双面净化工作台、特种净化工作台均购自苏州净化设备有限公司，隔水式电热恒温培养箱购自上海跃进医疗器械厂，离心机、单道移液器均购自Eppendorf，高压蒸汽灭菌器购自基因有限公司，基因扩增仪购自 Applied Biosystems，显微镜购自德国ZEISS，医用冷冻箱购自 SANYO，DYY-8C 型电泳仪购自北京市六一仪器厂。测序公司为南京金斯瑞公司。

超纯水，5×buffer、10×buffer，dNTP，上游引物，下游引物，cDNA 模板，MgCl2，高保真酶，20 mg·mL-1蛋白酶K，10%SDS，苯酚，氯仿，无水乙醇，70%乙醇，PBS，四抗 PBS 等。

1.2 病料及处理

疑似鸡包涵体肝炎的病死肉鸡，由江苏省某地区的鸡场送检。

采病死鸡的肝，在灭菌研钵中用剪刀剪碎，加含有抗生素的PBS(含青霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素)进行研磨，分装到1.5 mL指形管中，反复冻融3次后，3 000 r·min-1离心15 min，取上清液作为待检样品，放到-20 ℃保存。

采病死鸡肝于15%福尔马林溶液(5.55%～6%甲醛溶液)中固定。

1.3 病理学观察

常规制备石蜡切片，HE染色，中性树脂封片，观察病变并拍照。

1.4 鸡胚接种

10日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。取2 SPF鸡胚，分别进行标记，照胚画出气室及接种部位，经碘酒、酒精消毒后，用镊子开孔。经尿囊腔接种上述病毒分离液0.2 mL，置37 ℃孵化，每日观察1次，连续7 d。收集17 d后冻死胚的尿囊液，做病毒鉴定。

1.5 病毒DNA的提取

取接种疑似鸡包涵体肝炎病毒的尿囊液437.5 μL，经90 ℃水浴10 min作预处理后，加入20 mg·mL-1蛋白酶K 12.5 μL(终质量浓度为500 μg·mL-1)、10%SDS 50 μL(终相对体积质量浓度为1%)，置56 ℃水浴作用40 min，再加入等体积的苯酚和氯仿各200 μL，充分混匀，10 000 r·min-14 ℃离心5 min，小心取上层液体置于另一指型管中，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20 ℃沉淀20～30 min。取出后以12 000 r·min-14 ℃离心15 min，弃上清，70%乙醇洗涤一次，室温干燥，用30 μL 超纯水悬浮，-20 ℃保存备用。

1.6 引物设计和合成

根据GenBank发表的FAVⅠ群的hexon基因保守序列，设计一对引物。上游引物为5′-ATGTCAGCAGTAGGCGATTGT-3′；下游引物为5′-CCCGTCATGCCGTCGCTCTCTAAGGGT-3′；预期扩增片段2 914 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.7 鸡包涵体肝炎病毒hexon基因的扩增

以1.5提取的DNA为模板，扩增hexon目的基因。采用25 μL体系，PCR反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，51 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸15 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.8 测序和分析

将1.7中的PCR产物送至金斯瑞公司测序，应用DNAStar软件MegAlign的Clustal W方法将序列与禽腺病毒各群hexon核苷酸和推测的氨基酸序列进行分析，比较其相似性及差异性，找出不同血清型之间的序列差异和氨基酸差异，从而通过hexon的全基因序列区分出不同血清型。

2 结 果

2.1 大体病变结果

对病死鸡进行剖检，可见心包积液，蓄积大量黄褐色液体(图1)；肝出现明显的出血斑和出血点。

2.2 病理学观察结果

将病死鸡肝组织用福尔马林进行固定，制作切片，HE染色后观察发现，肝细胞发生脂肪变性(图2)，肝组织淤血，并可见炎性细胞浸润；部分肝细胞发生坏死。胞质溶解呈空网状，组织界限不清，正常结构消失；肝细胞中出现嗜碱性包涵体(图2)。

图1 病鸡心包积液Fig.1 Pericardial effusion in sick chicken

A.病鸡肝细胞内有嗜碱性包涵体； B.病鸡肝细胞脂肪变性A.Basophilic inclusion bodies of liver cell in sick chicken；B.Fatty degeneration of liver cell in sick chicken图2 病鸡肝组织病理变化 (HE染色) 1 000×Fig.2 Histopathological changes of liver in sick chicken (HE staining)1 000×

2.3 PCR检测结果

提取SPF鸡胚尿囊液的DNA进行PCR扩增。根据鸡包涵体肝炎病毒的hexon基因组序列设计的特异性引物，以来自疑似病料的基因组DNA做模板进行扩增。反应产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳观察，得到特异性扩增条带，与预期设计的扩增片段大小相符，长度约为2 914 bp(图3)。

2.4 测序结果

经金斯瑞公司测序和拼接，得知该IBHVhexon基因序列有2 914 bp，约编码900个氨基酸，简称BHT-2N。从GenBank中下载已经登陆的其他FAV相关毒株(相应毒株登录号为FAV1：U46933.1;FAV4：NC-015323.1；FAV8：GU734104.1；FAV9:AF083975.2；FAV10：U26221.1；HEV:AF074946.1；EDS：Y09598.1) 的hexon基因序列，通过DNAStar软件MegAlign工具ClustalW方法对测序结果进行多序列比较分析。分析表明，分离株与Ⅰ群FAV中血清4型相似性为98.6%，与其他血清型

M.DL10000 DNA相对分子质量标准；1.病毒DNA的PCR扩增产物M.DL10000 DNA marker；1.PCR amplification results of DNA图3 病毒DNA的PCR扩增产物Fig.3 PCR amplification results of Inclusion Body Hepatitis virus DNA

的相似性为68.7%～96.9%，与Ⅱ群FAV的HEV和Ⅲ群FAV的EDSV相似性为44.6%(图4)。遗传进化分析显示(图5)，本试验分离株与Ⅰ群FAV亲缘关系最近，特别是与血清4型和10型的FAV更接近，与血清8型、9型和1型相对较远，与Ⅱ群FAV的HEV和Ⅲ群FAV的EDSV明显属于不同分支，亲缘关系最远，结果显示，分离株为Ⅰ群禽腺病毒。

3 讨 论

鸡包涵体肝炎的病理特征是变质性肝炎，最显著的变化是肝大，呈土黄色至褐色，质地脆弱，没有光泽，被膜下散在出血点或出血斑，并有针尖大黄白色坏死灶[4]。同时，心包积液也是禽类的一种疾病[5-6]，通过病毒分离，用电子显微镜可以确定其与禽腺病毒有关[7-8]。许多造成心包积液的病毒属于FAV 4型，并且是高致病性的[9]。在该病例中，肝出现出血点，心包积液，肝和心同时发生病变可能是造成鸡感染鸡包涵体肝炎病毒后死亡的原因。

图4 分离的FAV毒株与其他毒株hexon基因氨基酸和核苷酸序列的相似性比较Fig.4 The nucleotides homology comparison of the isolated virus and other viruses

图5 FAV hexon基因核苷酸序列系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree based on FAV hexon nucleotides

最具有诊断意义的镜检病变也在肝[8]，该病例组织切片中肝细胞坏死，发生脂肪变性，细胞核溶解消失，在肝细胞的核中出现嗜碱性小体，这是鸡包涵体肝炎镜检的典型病变。

FAV在肝、胰腺及肠管中的含量最高，一般不感染异种动物。Ⅰ群FAV可以在鸡胚中增殖，因此用鸡胚来扩增病毒可以很好地分离Ⅰ群FAV。本试验尝试用肝组织直接提取DNA，进行PCR鉴定后，没有分离到病毒，通过SPF鸡胚进行病毒扩增后，从尿囊液中提取DNA，进行PCR鉴定后分离到病毒。但是病毒分离株对鸡胚没有明显致病作用，鸡胚接种病毒后未见眼观的病变，这与Ⅰ群FAV其他分离株的特性不完全一致，通常鸡胚的病变包括胚体充血或出血、发育不良、胚体卷曲、不同程度肝炎和脾大等。另外，病毒的增殖没有致死鸡胚，在鸡胚17日龄将其冻死，取尿囊液提取DNA。

Hexon蛋白是FAVⅠ的主要结构蛋白，它与五邻体蛋白和纤维蛋白一起构成FAVⅠ的外壳，Hexon蛋白含有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，是中和抗体的靶目标和主要保护性抗原基因，与致病性密切相关，因此作为诊断抗原具有良好的应用前景[10]。hexon基因开放阅读框长约2 829 bp，编码943个氨基酸，是病毒引起宿主免疫应答的重要保护性抗原决定簇，含有大量的保守性区，抗原性强，暴露性好，并具有群特异性，是Hexon蛋白的主要抗原区[11]。据报道，hexon基因编码的六邻体蛋白带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇[12]，可以引起极强的中和反应，当六邻体被替代或突变将导致中和免疫缺失[13]。本研究通过对分离毒株的hexon基因进行序列分析，比较该毒株与禽腺病毒4型标准毒株的核苷酸序列，发现本试验分离到的病毒有的基因发生了突变，该突变基因是否与病毒的中和反应有关尚需进一步研究。

目前，在该病毒的基因中，hexon是研究范围最广的，具有群与型的特异性，包括4个可变环L1- L4结构[14，15]，不同毒株的hexon序列均已公布，因此，选取该基因进行克隆与序列分析[16-17]，可鉴定出分离株属于FAV哪个群[18]，并可区分同一个群的不同血清型。本试验中，用hexon基因序列组设计的引物进行PCR扩增与克隆，测序片段包括了该基因的全序列，分离株与Ⅰ群FAV同源性最高，亲缘关系最近，特别与血清4型最接近，而与Ⅱ群、Ⅲ群FAV亲缘关系最远，属于不同的进化支。本研究为进一步研究鸡包涵体肝炎病毒打下坚实的基础。

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(编辑 白永平)

Pathogenic Detection and Pathological Observation of Inclusion Body Hepatitis in Chicken

WANG Wan，WANG Yan-hong，LIU Yi，JIN Wen-jie，SHI Huo-ying*

(KeyLabforAvianPreventiveMedicineofMinistryofEducation，CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

One strain of the inclusion body hepatitis virus (IBHV) was isolated and identified based on pathological changes，PCR and sequence analysis in sick chicken.The DNA of the IBHV was extracted from allantoic fluid obtained from SPF egg，which was inoculated with the sick chicken liver.The primers were designed based on the conservedhexonsequence of avian adenovirus.The PCR product of avian adenovirus was amplified and sequenced.The fatty degeneration，karyopyknosis，cell necrosis and basophilic inclusion bodies were observed in liver tissue from sick chicken.The sequencing results indicated that the virus shared 98.6% identity with FAV-4 in group Ⅰ and 68.7%-96.9% identity with other serotypes in group Ⅰ，and 44.6% identity with hemorrhagic enteritis virus in group Ⅱ and egg drop syndrom virus in group Ⅲ.These results confirmed that the isolated virus is a member of fowl adenovirus groups，and can cause chicken inclusion body hepatitis.Our research provides the basis for isolation and identification of group Ⅰ avian adenovirus.

inclusion body hepatitis；fowl adenovirus；isolation；identification；hexongene

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.014

2014-06-17

国家自然科学基金(31172300)；江苏省高校自然科学重大项目(12KJA230002)；高等学校博士学科点专项科研基金(博导类)(20133250110002)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)；江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

王 婉(1989-)，女，甘肃白银人，硕士生，主要从事禽传染病方面的研究，E-mail:wangjiawanyun@126.com

*通信作者：石火英，E-mail:hyshi@yzu.edu.cn

S852.659.1

A

0366-6964(2015)02-0273-06