鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附和侵袭特性

张秀平，陈 陆，赵 军，王川庆，李永涛，刘红英，彭志锋，卢彩景，敬文宪，杨 霞

(河南农业大学，禽病研究所，郑州 450002)

鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附和侵袭特性

张秀平，陈 陆，赵 军，王川庆，李永涛，刘红英，彭志锋，卢彩景，敬文宪，杨 霞*

(河南农业大学，禽病研究所，郑州 450002)

为研究鸭源鸡杆菌(G.anatis)体外黏附和侵袭细胞的能力，选择HeLa 细胞为感染模型，分别以细菌黏附和侵袭HeLa 细胞数量为指标，借助革兰和姬姆萨染色及电镜观察来研究2株不同来源的鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附和侵袭特性。结果显示：黏附计数表明鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附HeLa 细胞，菌株感染30、60、90、120、150 min后每细胞黏附的细菌数分别为0.84、4.68、8.52、9.27、8.2个，而菌株F149T对HeLa细胞有较低的黏附作用。侵袭试验表明Yu-PDS-RZ-1-SLG有低度侵袭力，侵袭的细菌数在150 min时达到最大，约8.27·1 000细胞-1，随后细胞破碎，细胞逐渐脱落，而菌株F149T未检测到侵袭力。染色及电镜试验进一步证实鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG可黏附于HeLa细胞表面并侵入细胞内部。菌株经胰蛋白酶处理后，细菌的黏附率显著降低，表明细菌的表面蛋白参与黏附。黏附和入侵特性是鸭源鸡杆菌定殖在组织表面重要的能力，该细胞模型的建立为进一步研究其致病机制提供了条件。

鸭源鸡杆菌；细胞黏附；细胞侵袭；HeLa 细胞

鸡杆菌属(Gallibacterium)是革兰阴性巴氏杆菌科中一个新属，代表种为鸭源鸡杆菌(Gallibacteriumanatis)[1-2]。鸭源鸡杆菌是构成鸡上呼吸道和下生殖道正常菌群的一部分，最近证明也与产蛋鸡输卵管炎、输卵管囊肿及腹膜炎等有关，能引起鸡产蛋量下降和死亡[3-4]。2008年，王川庆等[5]首次报道了中国鸡场中鸭源鸡杆菌的感染情况，从病鸡的卵巢、输卵管、肝等器官均分离出了鸭源鸡杆菌。对中国部分地区鸡群进行鸡杆菌血清流行病学调查发现，抗体阳性率达45.06%[6]，说明鸡杆菌感染已成为中国鸡群发生腹膜炎和输卵管炎疾病的重要病因。2013年首次报道鸭源鸡杆菌能够感染人[7]，更引起了全世界的高度重视。但目前对其致病机制的研究还相对缺乏。

病原菌定殖和入侵宿主的第一步是黏附，不同的病原菌可以表达不同的黏附因子。一部分病原菌黏附于宿主黏膜上皮细胞表面并在局部繁殖，在整个感染过程中一直停留在那里，进一步分泌毒素或其他毒力因子，作用于被感染的宿主细胞使其发生病变，如霍乱弧菌；而另外一些病原菌在黏附于宿主细胞表面后还要进一步内在化，即侵入宿主细胞内部，这种特性被称作侵袭(invasion)[8]。细菌黏附和侵袭模型包括动物模型、细胞模型等。细胞模型是近年来应用较多的一类细菌黏附和侵袭模型，具有重复性好和周期短的优点，如HeLa细胞(人宫颈癌细胞系)、Int407(人胚胎肠黏膜细胞系)、Vero细胞(非洲绿猴肾异倍体细胞)、CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)及原代细胞模型等；其中 HeLa细胞是生物学与医学研究中被广泛应用的一种传代细胞，已经成为医学研究中非常重要的工具，且在巴氏杆菌科中作为黏附与侵袭模型早有应用[9]。

目前，已经证实鸭源鸡杆菌能黏附到塑性表面及鸡口咽原代上皮细胞上[10-11]，在感染黏膜组织，定殖上呼吸道过程中有重要作用。但鸭源鸡杆菌能否体外黏附和侵袭传代细胞尚未见报道。因此，本试验尝试选择HeLa细胞为感染模型，分别以庆大霉素保护试验、革兰染色和姬姆萨染色及电镜观察来研究鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附和侵袭能力，以期为进一步研究该病原菌的致病机制，控制病原菌的繁殖，降低其侵袭力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鸭源鸡杆菌参考菌株F149T(ATCC43329T)分离自丹麦的健康鸭，由德国勃林格公司惠赠；鸭源鸡杆菌菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG是从平顶山汝州发病鸡的输卵管上分离的菌株，经本实验室鉴定保存。1.1.2 主要试剂 DMEM/F12 细胞培养基购于GIBCO 公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS) 购于武汉三利公司；庆大霉素购自山东华信制药有限公司；细胞培养板购自NEST Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌的培养 取试验菌株接种于绵羊血琼脂平板，37 ℃培养18～20 h，挑单菌落接种于含5%胎牛血清的LB肉汤中，37 ℃ 200 r·min-1培养18～20 h，按1∶100的比例转接于上述新鲜培养基中，37 ℃培养至细菌达到对数期，采用平板活菌计数法测定细菌浓度。试验前，培养物用不含双抗的DMEM/F12培养基洗涤3次，并稀释到所需浓度。1.2.2 细胞培养 HeLa细胞为本实验室保存。将培养瓶中长满单层的细胞，用细胞消化液(2.5 g·L-1胰酶，0.2 g·L-1EDTA)消化后，用不含抗生素的DMEM/F12培养基悬浮，以105个细胞·孔-1接种于24 孔板，置37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养，待长满单层后用于试验。为了确保HeLa细胞在接种鸭源鸡杆菌后，细胞的活力不受影响，试验采用cell counting kit-8 cck-8 试剂盒以及台盼蓝染色检测细胞的活性。

1.2.3 黏附试验 试验参照文献[12]提供的方法并稍加改动。长成单层的细胞，用PBS洗3遍，每孔加入500 μL用DMEM/F12重悬稀释的菌液(细菌与细胞感染比分别为10、50、100)，37 ℃、5% CO2分别培养30、60、90、120、150 min，倾去孔中液体，用PBS洗5次。每孔加入500 μL的胰酶-EDTA消化5 min，收集部分细胞，1 200 × g离心5 min，弃上清，用不含抗生素的DMEM/F12培养基悬浮，通过台盼蓝染色确定细胞活力。剩余的细胞每孔加入500 μL 1% 的Trition X-100溶解混匀，取100 μL连续10倍倍比稀释菌液，均匀涂布于绵羊血琼脂平板，计算每孔溶解液中细菌数量。黏附率表示为在接种鸭源鸡杆菌后，每个HeLa 细胞表面的平均细菌，即每孔溶解的细菌数/每孔接种的细胞数。试验时每个处理设4 个重复，整个试验重复3次。1.2.4 侵袭试验 采用庆大霉素保护试验[12-13]，参照黏附试验接种细菌至细胞上，24孔板在37 ℃含有5% CO2的环境中培养后，倾去孔中液体，用PBS洗3次，接着每孔加入1 mL含庆大霉素(100 μg·mL-1)的DMEM/F12，继续孵育1 h，以杀死细胞外细菌，再用PBS洗5次。为了确保在抗生素使用后能100% 的杀死胞外菌，取100 μL 最后一次的PBS 洗涤液涂布绵羊血琼脂平板。细胞活力测定及细胞溶解的处理方法同黏附试验，最后直接取100 μL 涂布绵羊血平板，计算裂解液中细菌数量。侵袭率表示为在使用庆大霉素后，每个HeLa 细胞里的平均细菌数，即每孔裂解的细菌数/每孔接种的细胞数。试验时每个处理设4 个重复，整个试验重复3次。1.2.5 用胰蛋白酶处理菌体对细菌黏附力的影响 取达到对数期的细菌于离心管中，4 000 × g离心5 min，弃上清液后用2.5 g·L-1胰蛋白酶处理鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG和F149T菌体，37 ℃下孵育10 min。处理后菌体经PBS充分洗涤，悬浮并稀释成所需浓度。处理后再进行菌落计数，然后按“1.2.3”中的方法进行黏附试验。

1.2.6 革兰染色和姬姆萨染色观察细菌黏附和侵袭 细胞接种于预先放有8 mm × 8 mm盖玻片的细胞培养板中，当细胞在盖玻片上形成单层后，接种浓度为107cfu·mL-1的鸭源鸡杆菌悬液1 mL，置37 ℃培养箱中孵育。吸去菌液，用无菌的PBS 洗涤3 次，用甲醇∶冰乙酸=3∶1 固定液固定5 min，自然干燥。经革兰染色和姬姆萨染色后水洗，干燥、封片，置于油镜下观察黏附和侵袭情况。同时以DMEM/F12培养基作为对照组。1.2.7 扫描电镜观察细菌黏附细胞 方法同黏附试验，当细菌在含有玻片的培养基上孵育90 min时，用常规方法固定制片后用S-3400 扫描电镜观察。1.2.8 透射电镜观察细菌侵袭细胞 透射电镜用细胞不加盖玻片，细胞在一次性T25细胞培养瓶中培养至单层，接种细菌悬液共同孵育90 min后，PBS洗3次，用2.5% 的戊二醛溶液固定2 h 后，换新鲜固定液固定过夜，用无菌细胞刮刀刮下细胞，4 000 r·min-1离心10 min，弃去固定液。常规方法固定，超薄切片，枸橼酸铅和醋酸铀双重重金属染色后，置于JEM-1400 透射电镜下观察。

1.2.9 统计分析 所有数据采用Graphpad Prism 5作图表示，应用SPSS11.5 软件进行统计分析。对试验结果采用方差分析T检验进行统计学处理，以P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 鸭源鸡杆菌对HeLa 细胞活力的影响

为确保接种鸭源鸡杆菌后HeLa 细胞的活力不受影响，在接种鸭源鸡杆菌菌株150 min时采用cell counting kit-8 cck-8 试剂盒以及台盼蓝染色检测细胞的活性。与不加细菌的对照相比，鸭源鸡杆菌菌株F149T及Yu-PDS-RZ-1-SLG 在黏附和侵袭试验期间对HeLa细胞均无毒性影响。所有对照组及试验组细胞在接种细菌后150 min时至少有85%～90% 的活力。

150 min后，菌株F149T接种的细胞基本维持正常，而菌株 Yu-PDS-RZ-1-SLG 接种的细胞，细胞破碎、逐渐脱落，因此试验选择150 min之前研究细菌的侵袭和黏附。

2.2 感染复数(MOI)的确定

运用鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株做黏附预试验中，分别以MOI为10、50、100 感染HeLa细胞确定合适的感染复数。从图1可以看出随着时间的推移，黏附数量逐渐增加；30 min时，3个不同浓度组之间均差异不显著(P>0.05)；60、90和120 min时，MOI为50和100的菌量组之间差异不显著(P>0.05)，但二者与MOI为10的浓度组相比均差异显著(P<0.05)，且120 min时，MOI为100黏附数量达到最高，因此在后续的研究中以MOI为100为感染复数进行细菌的黏附和侵袭试验研究。

2.3 鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附结果

2株鸭源鸡杆菌均能黏附HeLa细胞。如图2所示，在MOI为100时2株鸭源鸡杆菌黏附HeLa细胞均具有时间依赖性。随着时间的延长，每个细胞上的黏附细菌数量逐渐增加，至120 min时达到最大的细菌黏附数量，且鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株对HeLa 细胞的黏附数量在60至150 min均显著高于鸭源鸡杆菌F149T株。120 min黏附数量最大时鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株每个细胞黏附数为9.27，F149T株仅为0.99，前者的黏附数量将近是后者的10倍，并且鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株黏附数在90、120、150 min时与30 min时相比，差异显著(P<0.05)。

*表示在60、90和120 min时，MOI为50和100的浓度组与MOI为10的浓度组相比均差异显著(P<0.05)*Significant differences(P<0.05) compared to the incubation at MOI of 10图1 不同MOI浓度鸭源鸡杆菌(10、50、100)在不同时间点黏附HeLa 上皮细胞趋势Fig.1 The general adhesion trend of G.anatis strain to HeLa cells from 30 to 150 min at different MOI(10，50，100)

2.4 鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附染色试验

革兰染色结果表明：鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG对HeLa细胞具有黏附力。光学显微镜油镜(×1 000)下可见到HeLa细胞周围有菌体黏附于细胞表面。感染后30 min时，黏附的细菌数量较少，多数细菌游离在细胞之外。随着时间的延长，黏附在细胞周围的数量逐渐增加，感染后120 min时，单个细胞周围有较多的细菌(图3a～d)，染色结果与黏附数量基本一致。

*表示和30 min 相比差异显著(P<0.05)；**表示和菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG 相比差异显著(P<0.05)*Significant differences(P<0.05) compared to 30 min of incubation；**Significant differences(P<0.05) compared to Yu-PDS-RZ-1-SLG strain图2 鸭源鸡杆菌F149T和Yu-PDS-RZ-1-SLG对HeLa 细胞的黏附Fig.2 Kinetics of adherence of G.anatis F149T and Yu-PDS-RZ-1-SLG strains to HeLa cells

2.5 扫描电镜观察鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附

扫描电镜显示鸭源鸡杆菌菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG感染的HeLa细胞表面有短杆菌黏附(图4a)，进一步确定了鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附。而F149T感染的HeLa细胞表面未见有明显的黏附细菌，单个细菌游离在细胞之外(图4b)。

2.6 用胰蛋白酶处理鸭源鸡杆菌后对HeLa细胞的黏附

胰蛋白酶处理F149T和Yu-PDS-RZ-1-SLG菌体后，细菌的增殖未受到明显影响，而细菌对细胞的黏附数量明显下降，黏附均受到较大程度的抑制(P<0.01)，尤其是Yu-PDS-RZ-1-SLG株下降更显著(图5)，说明表面蛋白参与了细菌的黏附。

2.7 鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的侵袭

庆大霉素保护试验显示，鸭源鸡杆菌F149T株对HeLa无侵袭力，Yu-PDS-RZ-1-SLG株对HeLa细胞有侵袭力，且接种30 min后，每1 000个细胞内的细菌数量为2.73，90 min时达5.87，差异显著；在120、150 min时差异不显著(P>0.05)，但150 min时侵袭数量达到最大值，即每1 000个细胞内侵入细菌数约为8.27。侵袭数在120、150 min时与30、60 min相比，差异显著(P<0.05)(图6)。随后，鸭源鸡杆菌 Yu-PDS-RZ-1-SLG株接种的细胞出现变圆、肿胀、脱落，细胞内颗粒增多的病变现象。

2.8 鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的侵袭染色试验

姬姆萨染色结果表明：鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株对HeLa细胞具有侵袭力。光学显微镜油镜(1 000×)下可见到HeLa细胞周围有染色深浅不一的菌体，黏附于细胞表面或者侵入到细胞的内部。随着时间的延长，黏附和侵入的细菌数量逐渐增加，感染后120 min时，单个细胞表面和内部均有较多的细菌(图3e～h)，染色结果与侵袭结果基本一致。

2.9 透射电镜观察鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的侵袭结果

透射电镜显示鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株感染的HeLa细胞上有细菌紧密结合于细胞膜或细胞表面微绒毛上，细胞内有侵袭现象(图7a)。而F149T感染的HeLa细胞未见有侵袭的细菌，单个细菌游离在细胞间(图7b)。

a～d.鸭源鸡杆菌株Yu-PDS-RZ-1-SLG感染HeLa细胞后30、60、90、120 min时革兰染色(标尺=20 μm);e～h.鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG感染HeLa细胞后30、60、90、120 min时姬姆萨染色(标尺=20 μm)a-d.Gram staining of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG strain at 30，60，90，120 min after infection respectively(Bars = 20 μm);e-h.Giemsa staining of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG strain at 30，60，90，120 min after infection respectively(Bars=20 μm) 图3 鸭源鸡杆菌感染HeLa细胞的染色图片Fig.3 Staining of G.anatis after infection to HeLa cells

3 讨 论

细菌的致病机制错综复杂，其毒力取决于侵袭力和毒素两方面，而侵袭力又由细菌的黏附和侵袭、繁殖与扩散以及对宿主防御机能的抵抗等诸因素构成。黏附是病原菌引起感染发生的第一步，因此，成功地黏附在黏膜表面，才有可能在宿主体内定殖，进而引发感染，表现一系列的病理变化并出现临床症状。尽管鸭源鸡杆菌能黏附上皮细胞[11]，具有凝聚红细胞的能力[14]，但是鸭源鸡杆菌能否黏附和侵袭HeLa细胞尚未见报道。HeLa细胞来源于人的子宫上皮癌细胞株，是研究病原菌感染的理想细胞系，广泛应用于大肠杆菌、沙门菌、志贺菌和巴氏杆菌等的侵袭试验中[9,15-16]。因此，本研究也尝试采用HeLa细胞作为上皮细胞侵袭模型研究鸭源鸡杆菌感染细胞的特性。

a、b.鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG和F149T在MOI=100时，对HeLa 细胞感染90 min时扫描电镜结果a，b.Scanning electron micrograph of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG and F149T strains at 90 min after infection at MOI of 100 respectively图4 鸭源鸡杆菌感染HeLa细胞的扫描电镜Fig.4 Scanning electron microscopy of G.anatis after infection to HeLa cells

*表示和处理组相比差异极显著(P<0.01)*Significant differences (P<0.01) compared with experimental group图5 鸭源鸡杆菌F149T和Yu-PDS-RZ-1-SLG在胰蛋白酶处理后对HeLa细胞的黏附Fig.5 Adherence of G.anatis F149T and Yu-PDS-RZ-1-SLG strains to HeLa cells after treatment with trypsase

*表示和接种30、60 min 相比差异显著(P<0.05)*Significant differences(P<0.05) compared with 30 and 60 min of incubation图6 鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG对HeLa细胞的侵袭Fig.6 Kinetics of invasion of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG strain to HeLa cells

本试验证实，分离的鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株能够黏附HeLa细胞，且随着感染时间的增加，HeLa细胞表面黏附的细菌数也逐渐增加。在120 min时，黏附数目最高，表明细胞表面的受体已经饱和，只有有限数量的细菌能够黏附到HeLa上皮细胞。M.L.S.Lucio等[11]在研究鸭源鸡杆菌对鸡口咽上皮细胞的黏附中，发现F149T能黏附鸡口咽上皮细胞，而且鉴定了两个假定的菌毛蛋白可能参与黏附。本试验中F149T对HeLa细胞的黏附能力相对较弱，推测可能是F149T菌株表面缺乏相应的参与黏附HeLa细胞的因子，部分细菌非特异性黏附在细胞的表面。

庆大霉毒保护试验结果表明，鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株对HeLa细胞有侵袭力，且其随感染时间的增加而增加；另外，在感染该菌150 min后，HeLa细胞的结构发生明显的变化，变圆，肿大，脱落。而菌株F149T对HeLa细胞无明显侵袭力，且其感染的HeLa细胞和对照组相比没有可见的改变。文献[17]显示细菌的致病因素(黏附素)能够使一些细胞的细胞膜发生病变，使细胞膜突起，或者形成褶皱。曾巧英等[18]在研究中发现猪链球菌2 型在黏附扁桃腺上皮细胞5 h后，细胞表面微绒毛脱落，细胞膜吐泡，有明显的凋亡迹象。B.M.Kris-tensen等[19]研究发现鸭源鸡杆菌对巨噬细胞有细胞毒作用，可能在发病机制上扮演着重要的角色。由于本试验中所用鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株有很强的致病性和溶血活性，而菌株F149T无明显的致病力(另文报道)，是否因为2株菌不同的致病性对HeLa细胞的影响不同还有待于进一步研究。

a、b.鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG和F149T在MOI=100时，对HeLa细胞感染90 min的透射电镜(标尺=1 μm)a，b.Transmission electron micrograph of G.anatis Yu-PDS-RZ-1-SLG and F149T strains at 90 min after infection at MOI of 100 respectively (Scale bars=1 μm)图7 鸭源鸡杆菌感染HeLa细胞的透射电镜Fig.7 Transmission electron microscopy of G.anatis after infection to HeLa cells

细菌的黏附通常需要一些结构物质的参与，诸如菌毛、鞭毛、凝集素、细菌蛋白和外膜囊泡等在最初的黏附过程中都起着关键的作用[11,20-21]。为了进一步阐明Yu-PDS-RZ-1-SLG菌株黏附HeLa细胞与哪种黏附分子密切相关。试验中将菌株用胰蛋白酶处理后，发现能显著抑制细菌的黏附，但是用胰蛋白酶处理的细菌的活力却不受影响，表明细菌的某种表面蛋白参与黏附过程。鸭源鸡杆菌表面假定的菌毛能够促进细菌黏附在鸡组织表面，而且可能是多种蛋白质参与细菌的黏附，增加了对易感宿主感染的可能性[11]。而在鸭源鸡杆菌12656-12中已经证实有4个假定的菌毛蛋白[22]，所以，Yu-PDS-RZ-1-SLG菌株黏附HeLa细胞过程是一种蛋白质参与还是多种蛋白质的协同作用还需要进一步证实。因此，后续的工作主要是建立鸭源鸡杆菌菌毛蛋白突变株，鉴定参与这些过程的分子，进一步了解黏附机制。

致病菌与细胞的相互作用机制是目前研究的热点。本研究证明分离自患输卵管炎蛋鸡的鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG株对HeLa细胞具有黏附力和侵袭力，而分离自健康蛋鸡的F149T株与前者的黏附和侵袭特性有明显差异；黏附与侵袭具有时间及剂量依赖性，仅有限的细菌能黏附到细胞的表面，并表达与细胞表面相结合的蛋白质，进而黏附和侵入细胞，这些黏附相关蛋白质可能在其致病过程中起到重要的作用，但其在菌体表面以何种形式存在，还有待进一步研究。虽然体外细胞模型不能完全反映体内的真实情况，并且HeLa细胞的表面受体与宿主鸡输卵管上皮细胞不一致，但很多试验表明，细菌对体外细胞的黏附力和侵袭力与其致病性呈平行关系。

4 结 论

以上研究表明，鸭源鸡杆菌能黏附和侵入HeLa上皮细胞，此模型的建立为该病菌后期致病机制的深入研究奠定了基础。

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(编辑 白永平)

Adhesion and Invasion Characteristics ofGallibacteriumanatisto HeLa Cells

ZHANG Xiu-ping，CHEN Lu，ZHAO Jun，WANG Chuan-qing，LI Yong-tao， LIU Hong-ying，PENG Zhi-feng，LU Cai-jing，JING Wen-xian，YANG Xia*

(InstituteofPoultryDiseases，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China)

In order to determine the cell adhesion and invasion characteristics ofGallibacteriumanatis(G.anatis)，aninvitroHeLa cell model was established.The adhesion and invasion characteristics of 2 strains were evaluated by means of adhesion and invasion experiment，Gram and Giemsa staining，Scanning electron microscopy and Transmission electron microscopy.Adhesion counting assay demonstrated that the high adhesive ofG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain and adhering bacteria numbers were 0.84·cell-1，4.68·cell-1，8.52·cell-1，9.27·cell-1and 8.2 ·cell-1at 30，60，90，120，150 min after infection，respectively.G.anatisF149Tstrain revealed a weak adhesive level.Invasion assay showed weak invasive ofG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain and no invasion ofG.anatisF149Tstrain，and invading bacteria numbers ofG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain reached the maximum at 150 min，about 8.27 per 1 000 cells，but cell disruption，cell activity weakened subsequently.Staining results and electron microscopy experiments further confirmed thatG.anatisYu-PDS-RZ-1-SLG strain adhere to surface and invade Hela cells.Adherence was prevented by treating bacterial cells with trypsin，suggesting the participation of proteins in this process.The adhesive and invasive capacity could be an important ability for colonization of tissue surfaces ofG.anatis.The establishment of cell model provided the basis for further research on pathogenic mechanism ofG.anatis.

G.anatis;adhesion;invasion;HeLa cells

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.017

2014-06-09

国家自然科学基金(31302090)；河南省高校科技创新团队支持计划(14IRTSTHN015)

张秀平(1986-)，女，河南商丘人，硕士生，主要从事分子病原学研究，E-mail：zhangxiuping722@163.com

*通信作者：杨 霞(1973-)，女，河南扶沟人，副教授，博士，主要从事分子病原学研究，E-mail：yangxia66@163.com

S852.612

A

0366-6964(2015)02-0295-08