可注射型生物蛋白胶包埋骨髓基质细胞工程化组织的体外实验＊

王晶莹 宋泉生 朱静琳 韩晓光 杨燕琳宋纯理

(北京大学第三医院骨科,北京 100191)

可注射型生物蛋白胶包埋骨髓基质细胞工程化组织的体外实验＊

王晶莹 宋泉生 朱静琳 韩晓光 杨燕琳①宋纯理＊＊

(北京大学第三医院骨科,北京 100191)

目的构建可注射型生物蛋白胶包埋骨髓基质细胞的工程化组织,体外培养并研究其生物学特性,探讨将可注射型生物蛋白胶作为组织工程支架用于临床的实验基础。方法体外培养浇铸有骨髓基质细胞的生物蛋白胶,通过倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜观察载体内细胞生长及载体降解情况,5-溴脱氧尿苷 (5-Bromodeocyuridine,BrdU)掺入标记后免疫组化等方法研究可注射型载体内包埋细胞的增殖情况。结果骨髓基质细胞包埋于生物蛋白胶内能很好地存活并增殖,2 d后细胞呈典型的成纤维细胞形态;6 d后生物蛋白胶边缘部分开始降解,细胞脱落至培养板;体外培养 14 d,细胞生长良好,大部分生物胶降解,脱落的细胞增多,贴壁生长的细胞形态正常;3周后生物蛋白胶完全降解。结论生物蛋白胶聚合后包埋的种子细胞能够正常增殖,生物蛋白胶是一种理想的适用于微创方法修复组织的可注射型组织工程培养和移植的支架。

生物蛋白胶; 骨髓基质细胞; 组织工程; 支架

组织缺损一直是困扰临床的难题,一些组织如骨、软骨等损伤引起的缺损尤其是大尺寸的缺损,自身修复的能力有限。组织工程的迅速发展,为这一难题提供了新的解决途径。常规的组织工程是将种子细胞体外加载到载体上,细胞丢失严重,且耗时较长。载体材料的选择是制约组织工程发展的一个重要因素,寻找能充分发挥组织再生潜力的支架材料是组织工程研究领域的核心内容之一。理想的组织工程细胞支架应具备以下特性:与种子细胞和宿主组织有良好的组织相容性;具有三维立体结构;具有可塑性和良好的生物可降解性。而生物蛋白胶复合以上几种特点。如能采用微创外科技术,采用注射的方法,使种子细胞在体内复合将具有广阔的应用前景。生物蛋白胶又称纤维蛋白黏合剂,是一种低抗原的生物大分子材料,具有良好的生物相容性,同时具有很好的可塑性,易于降解。纤维蛋白胶注射后聚合成形,可用于临床尤其是微创外科中止血,减少创面渗液,还可用于填充组织缺损以及覆盖和保护手术创面,促进创伤愈合,防止粘连,具有良好的效果[1,2]。本研究拟构建可注射型生物蛋白胶浇铸骨髓基质细胞的工程化组织,体外培养并研究其生物学特性,探讨其作为细胞培养支架的可行性,为应用于临床提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM培养基 (Gibco公司),胎牛血清 (北京百灵克生物技术公司),胰蛋白酶 (Sigma公司),医用生物蛋白胶 (广州倍特生物技术有限公司),青霉素、链霉素 (山东鲁抗制药股份有限公司),5-溴脱氧尿苷 (5-Bromodeocyuridine,BrdU)及抗体,冷冻组织包埋剂 (TBS,北京中杉金桥生物技术公司),碘化丙啶 (propidium iodine,PI),双醋酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)(京欣经科生物技术有限公司)

倒置相差显微镜 (Olympus,日本),激光共聚焦显微镜 (Leica,德国),冰冻切片机 (Leica,德国)。

健康雌性 BLAB-C小鼠,8周龄,体重 (9±0.5),共 12只,购买并饲养于北京大学医学部实验动物中心,饲养级别一级。

1.2 方法

1.2.1 骨髓基质细胞的体外培养 8周雌性BALB-C小鼠拉颈处死,75%酒精浸泡消毒,无菌条件下取双侧股骨、胫骨,用咬骨钳分别咬除股骨、胫骨两端的干骺端,DMEM完全培养液冲洗髓腔,充分吹打成细胞悬液,细胞计数板计数,接种于 25 cm2培养瓶,接种密度为 6×106个细胞 /cm2(包含血细胞)。5%CO2,37℃恒温培养箱内培养。第 3天轻轻吸出悬浮细胞,更换培养液。以后每 2～3 d更换一次培养液。

1.2.2 注射型包埋骨髓基质细胞生物蛋白胶的构建与体外培养 第 3代骨髓基质细胞融汇至80%～90%时,0.25%胰酶消化细胞 3 min,含血清的培养液终止消化,反复漂洗,收集细胞,细胞计数板计数,约 107个骨髓基质细胞混于 A管内生物蛋白胶 (主体胶,约 5 ml,主要含有纤维蛋白原复合物和Ⅻ因子),与等量的 B管成分 (催化剂,主要含有凝血敏、氯化钙等),注射后两管成分混合,凝固成浇铸有骨髓基质细胞的凝胶,培养板中加入完全培养液,5%CO2,37℃恒温箱内培养。倒置显微镜下观察生物蛋白胶中骨髓基质细胞的生长情况及支架降解情况。根据培养液的颜色,及时更换培养液。

1.2.3 激光共聚焦显微镜观察 根据活细胞双醋酸荧光素 (fluorescein diacetate,FDA)染色呈绿色荧光,死亡细胞碘化丙啶 (propidium iodine,PI)染色呈红色荧光的特点[3],利用激光共聚焦显微镜的层切功能,可以观察可注射型纤维蛋白胶载体内不同层面浇铸细胞的存活情况。荧光染液配制[3]:PI 5 mg溶于 100 ml PBS溶液作为贮备液,避光保存;FDA 1 mg/ml溶于丙酮作为贮备液,冰冻保存,用前磷酸缓冲液 (PBS)1∶4000稀释。

分别在细胞浇铸 1、3 d后,PBS液漂洗细胞生物蛋白胶聚合体,聚合体置于 2 ml PBS液中,滴加PI母液,终浓度为 5μg/ml,染色 3 min;FDA稀释液染色 5 min。染色后激光共聚焦显微镜观察,层切间距为 10μm。

1.2.4 BrdU细胞标记免疫组化 为进一步观察生物蛋白胶载体内浇铸的细胞是否能够增殖,生物蛋白胶聚合 3 d后,加入 250μg/mlBrdU缓冲液,终浓度为 10μg/ml,避光,37℃孵箱孵育过夜后,4%多聚甲醛固定 10 min,TBS冷冻组织包埋剂包埋后冰冻切片,切片厚度 10μm。

PBS液漂洗 5 min;3%H2O2-甲醇室温 30 min;3%Triton-X 100/PBS破膜;封闭液室温封闭 30 min;BrdU抗体 4℃过夜;生物素标记的二抗 37℃孵育 1 h;PBS漂洗后 HRP标记的三抗 37℃孵育 1 h;PBS漂洗后 DAB显色 3～5 min;脱水,透明,封片,光学显微镜观察并摄片。

2 结果

2.1 细胞形态的倒置相差显微镜观察

可注射型复合骨髓基质细胞的纤维蛋白胶在溶液A与溶液 B混合后很快形成凝胶 (大约 30 s)。倒置相差显微镜下,凝胶呈半透明状,可见浇铸在纤维蛋白胶内的细胞。活细胞包埋后,细胞培养液消耗比普通 24孔板明显加快,培养 1～2 d后,细胞培养液颜色即变黄,而普通贴壁培养一般 3～4 d换液。

可注射型生物蛋白胶载体活细胞浇铸 1 d后,细胞存活在生物胶内,细胞透亮,以球形细胞为主。2 d后部分细胞在载体内伸出伪足,呈多角形或梭形,倒置相差显微镜下,细胞透亮,细胞状态良好。6 d后生物蛋白胶聚合物边缘部分开始逐渐降解,部分细胞脱落后贴附于培养板继续生长,呈典型的成纤维细胞形态,细胞状态良好。培养至 14 d时,生物蛋白胶聚合物大部分崩解成碎片,大部分细胞脱落,贴附于培养板,脱落的细胞贴壁生长良好 (图1)。3周后生物蛋白胶完全降解。

图 1 倒置相差显微镜下观察包埋有骨髓基质细胞的生物蛋白胶 A.活细胞浇铸 1 d,细胞存活良好;B.活细胞浇铸 6 d,生物胶边缘部分降解;C.活细胞浇铸 14 d,大部分生物胶降解;D.活细胞浇铸 3周,生物蛋白胶完全降解,脱落细胞贴壁生长良好

2.2 激光共聚焦显微镜观察

可注射型生物蛋白胶载体活细胞浇铸后,绝大部分细胞 FDA染色呈绿色荧光;只有极少量的细胞PI染色阳性,细胞呈红色荧光。

载体聚合 1 d后,部分细胞呈成纤维状;载体聚合 3 d后,大部分细胞呈成纤维状细胞生长。在 0～5000μm的层切深度中,每隔 5～6层切面观察,绝大部分细胞 FDA染色阳性,呈绿色荧光,细胞形态基本正常 (图 2)。

2.3 BrdU免疫组化

细胞 BrdU标记后,冰冻切片免疫组织化学染色观察,部分细胞核 DAB染色阳性;冰冻切片见生物蛋白胶内部成三维网状结构,孔径大小不一 (图3)。

3 讨论

体外构建工程化组织时需要最大程度地利用细胞资源,尽可能缩短制备时间。目前,主要的方法是利用细胞贴壁生长的特性,将细胞悬液注入材料的孔隙,孵育后使细胞贴附于材料表面。由于重力作用和长时间孵育引起的部分细胞受损而不能与支架材料黏附紧密,不仅造成种子细胞的浪费,而且附着不均匀,单纯提高接种细胞数量难以增加黏附细胞数量。有学者探讨利用三维立体培养,使种子细胞最大限度地贴附在支架材料上[4,5],一定程度上可以增加种子细胞的数量,但存在操作复杂、耗时,且种子细胞仅能贴附在支架表面等实际困难。

生物蛋白胶因在一定条件下能够在液态和固态之间转化的特点,可以在液态时将其与种子细胞充分混合,注射后聚合固化,并且聚合后细胞可被均匀包埋在固态的纤维蛋白网内,实现体内的组织工程化,减少了种子细胞的丢失。同时三维网状结构提供了较大的接触面积和细胞生理活性面积,可以很好地存活、增殖。生物蛋白胶体具有良好的生物相容性、生物降解性、可塑性及止血功能等多种优点,可以作为注射型载体很好地应用到微创外科领域。本实验结果表明骨髓基质细胞包埋于生物蛋白胶内能很好地存活,第 2天细胞伸出伪足,呈典型的成纤维细胞形态;6 d后生物蛋白胶边缘部分开始降解,细胞脱落至培养板;体外培养 14 d,细胞生长良好,大部分生物胶降解,脱落的细胞增多,贴壁生长的细胞形态正常;3周后生物蛋白胶完全降解。

图 2 活细胞包埋 3 d,FDA-PI双染,生物蛋白胶不同层面的 Confocal观察结果,细胞存活良好,FDA染色阳性(绿色荧光),几乎未见 PI染色阳性(红色荧光)的死细胞

图 3 BrdU标记后网状生物蛋白胶内可见 BrdU阳性的增殖细胞,冰冻切片免疫组化染色 ×200

FDA染料只有活细胞才能着色,荧光显微镜下呈绿色荧光;而碘化丙啶 (propidium iodine,PI)在嵌入双链DNA后释放红色荧光,尽管 PI不能通过活细胞膜,但却能穿过破损的细胞膜而对核染色,荧光显微镜下呈红色荧光。FDA-PI荧光双染法能同时对活细胞和死细胞染色,用于检测细胞存活率。激光共聚焦显微镜可以有效地观察到细胞内部与载体内部的形态学变化,我们利用激光共聚焦显微镜的层切功能观察到距离载体表面 5000μm深度的细胞仍然存活良好,分布较均匀,细胞形态正常,很少能看到 PI染色阳性的细胞。

由于生物蛋白胶是多空隙三维结构,能保证营养物质和代谢产物进出支架内外,本实验将可注射型生物蛋白胶聚合后包埋骨髓基质细胞体外培养时,通过倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜等观察,证实骨髓基质细胞在生物蛋白胶中能够很好地吸取营养并生长。生物蛋白胶聚合后包埋骨髓基质细胞于三维网状结构中培养,细胞数量远大于普通贴壁细胞,因此,培养液也消耗较快。

当细胞DNA合成时,BrdU能够作为核苷酸的前体取代胸腺嘧啶核苷被掺入到新合成的 DNA中。在第一个细胞周期时,由于半保留复制的机制,中期染色体的每条染色单体 DNA双链都被掺入 BrdU。本实验结果显示生物胶内包埋的细胞能够增殖,Brdu染色阳性。

临床治疗组织缺损时,常需要不同形状和规格的材料,如能解决材料的可塑性问题,将为临床提供极大的方便。生物蛋白胶在这方面具有自己独特的优势。生物蛋白胶可以任意塑型并具有一定的黏弹性,具有很好的可塑性。另外,由于生物蛋白胶特殊的理化特性,还可以作为药物、细胞因子的缓释载体,以更好地促进工程化组织在体内的转归。利用生物蛋白胶作为骨形态发生蛋白 (bone morphogenic protein,BMP)可以促进骨缺损的修复[6],有研究表明生物蛋白胶包埋骨髓基质细胞移植后可以促进骨缺损的修复[7,8]。在实际应用中还可作为 BMP或其他细胞因子的缓释载体复合种子细胞将更有效地促进骨缺损的修复。我们同样利用生物蛋白胶复合BMP-2,CT引导下在猴椎体前、侧缘采用微创方法穿刺注射后可以很好地成骨,促进椎体融合 (结果另外报道)。

生物蛋白胶在纤溶酶作用下能够完全降解吸收,一般 3～4周可以完全降解吸收,降解时间与局部的纤溶活性等微环境及载体厚度有关。有在生物蛋白胶制备时加入纤溶酶抑制剂如抑肽酶等,能使生物蛋白胶更牢固更持久[9]。如能改善生物蛋白胶的降解速度和力学性能,或联合其它材料用作组织工程支架材料,将会发挥更大的作用。

总之,生物蛋白胶是一种理想的适用于微创操作的可注射的组织工程培养和移植的支架。

1 庞广兴,陈建庭,钟招明,等.椎体内注射医用生物蛋白胶对松质骨创面出血影响的实验研究.中国脊柱脊髓杂志,2009,(5):372-375.

2 喻 磊,谷天祥,姜春力,等.医用生物蛋白胶在骨质疏松患者冠状动脉搭桥手术中的应用.中国医科大学学报,2007,36(1):84-85.

3 杨景山.活细胞的检测.见:杨景山,主编.医学细胞化学与细胞生物学技术.北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社,1990.118-121.

4 吕昌伟,胡蕴玉,白建萍,等.转壁反应器三维立体培养多样本骨髓间充质干细胞实验研究.中国骨与关节损伤杂志,2008,23(7):561-563.

5 何清义,李 强,罗 飞,等.三维立体培养法诱导去分化软骨细胞Ⅱ型胶原的重新表达.中华实验外科杂志,2007,24(3):307-309.

6 Han DK,Kim CS,Jung UW,et al.Effect of a fibrin-fibronectin sealing system as a carrier for recombinant human bonemorphogenetic protein-4 on bone for mation in rat calvarial defects.J Periodontol,2005,76(12):2216-2222.

7 LeongDT,NahWK,Gupta A,et al.The osteogenic differentiation of adipose tissue-derived precursor cells in a 3D scaffold/matrix environment.CurrDrugDiscov Technol,2008,5(4):319-327.

8 LeeOK,CoathupMJ,Goodship AE,et al.Use ofmesenchymal stem cells to facilitate bone regeneration in normal and chemotherapytreated rats.Tissue Engl,2005,11(11-12):1727-1735.

9 Fussenegger M,MeinhartJ,Höbling W,etal.Stabilized autologous fibrin chondrocyte constructs for cartilage repair in vivo.Ann Plast Surg,2003,51(5):493-498.

(修回日期:2010-04-29)

(责任编辑:李贺琼)

Tissue-Engineered Bone Marrow Stromal Cells Embedded with I njectable Fibr in Glue in Vitro

Wang Jingying,Song Quansheng,Zhu Jinglin,et al.Depar tm ent of O rthopedics,Peking University Third Hospital,Beijing100191,China

ObjectiveTo construct tissue-engineered graft with bone marrow stromal cells(BMSCs)imbedded in the polymerized fibrin biopolymer scaffoldin vitro,observe its biological characteristics and degradationin vitro,and explore the biological basis of using injectable fibrin glue as a scaffold in tissue engineering by minimal invasive surgery.MethodsBMSCs embedded with injectable fibrin glue were polymerized and culturedin vitro. Its biological characteristics,including gel for mation,cell growth,histological features,and degeneration time of the fibrin glue were observed under an inverted phase contrast microscope and laser confocalmicroscope.5-Bromodeocyuridine(Brdu)incorporation,frozen section and immunohistochemical staining were employed to study the growth and proliferation of the BMSCs,and the degradation of the fibrin glue.ResultsThe BMSCs embedded in the fibrin glue grew well,homogeneously distributed in the polymerized fibrin glue.Brdu incorporation and immunohistochemical staining showed that the BMSCs embedded in the fibrin glue could also proliferate well.Two days after the embedment,the cellswith typical fibroblastshaped morphology could be observed.The edge of the fibrin glue began to degrade six days later and the cells fell off to the culture template.After fourteen days,most of the fibrin glue degraded and the adherent cells grew well.The polymerized fibrin glue degraded completely after 3 weeks.ConclusionsSeeding cells embedded in polymerized fibrin glue can grow and proliferate well.Fibrin glue is an ideal injectable scaffold for embeddingBMSCs for culture and transplantation bymin imally invasive surgerymethod.

Biological fibrin glue; Bone marrow stromal cells; Tissue engineering; Scaffold

R34

A < class="emphasis_bold">文章编号:1

1009-6604(2010)06-0560-05

2010-03-11)

＊国家自然科学基金资助项目(30300352,30772200)

＊＊ 通讯作者,E-mail:schl@bjmu.edu.cn

① 中心实验室