携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

赵金匣，王志平，陶 燕，贺振华，郭 琦，洪 梅

（兰州大学第二医院泌尿外科研究所 甘肃省泌尿系疾病研究重点实验室甘肃省泌尿系统疾病临床医学中心，甘肃 兰州 730030）

BTG2Pc3／Tis21是一个新发现的抗增殖基因，属于BTG／TOB基因家族，实验室和临床研究［1］均表明BTG2可能是一个抑癌基因。BTG2在细胞周期调控、细胞生长与分化和DNA损伤修复等方面发挥着重要功能，该基因已被证实对多种肿瘤的发生和发展具有抑制作用［2－4］。最初 BTG2Pc3／Tis21基因是在大鼠Pc12嗜铬细胞瘤株cDNA文库中被发现的，Pc3是可被神经生长因子（nerve growth factor，NGF）特异诱导的具有抗增殖活性的蛋白。随后，Fletcher等在小鼠NIH3T3细胞中发现了相似的序列并将其命名为Tis21，Tis21能被肿瘤促进剂佛波酯（12－O－tetradecanoylphorbol－13－acetate，TPA）诱导，属早期应答基因［5］。人BTG2基因最早是由Rouault等在寻找p53的靶基因时发现并克隆成功的，人BTG2基因位于人类染色体1q32区，编码一个含有158个氨基酸的蛋白，蛋白N端含有一个高度保守的APRO功能结构域［6］。BTG2高表达于肾近端小管、肺泡支气管上皮细胞和前列腺腺泡的基底细胞层［7］。研究［8］证明BTG2能被抑癌基因p53诱导而发生转录激活，并进一步参与细胞周期调控和DNA损伤应答。BTG2还能抑制细胞周期蛋白cyclin D1的转录，通过诱导G1期阻滞抑制细胞周期进展。目前的研究提示：BTG2发挥抗肿瘤作用的分子机制，主要是通过转录调控和mRNA降解途径影响一系列肿瘤相关基因的表达，另外还可能通过蛋白质相互结合发挥作用，然而其具体的作用机制并不十分清楚。BTG2是一个新近发现的蛋白，能够从生物公司购买到的抗体虽有不少种，但这些抗体的灵敏度和特异性都非常有限，应用效果欠佳。在缺乏有效抗体的情况下，为开展蛋白质功能研究，本课题组在BTG2的N端插入了一个FLAG标签。FLAG是由8个氨基酸（NAsp－Tyr－Lys－Asp－Asp－Asp－Asp－Lys－C）组 成 的 亲水性短肽，可标记于重组蛋白质的N端、C端或中心。FLAG标签具有抗原性，能被抗FLAG抗体识别，因此带FLAG标签的目标蛋白就可通过Western blotting法和免疫荧光技术等方法进行方便的检测。由于FLAG标签很小，通常对目标蛋白的立体结构和生物活性不会产生影响，可帮助分析靶蛋白的生物学功能［9］。本实验利用蛋白标签的优点，在 pcDNA3.1（＋）－BTG2质粒中插入了FLAG标签，将质粒导入HeLa细胞系中，用标签抗体检测到了目标蛋白的表达，为进一步研究BTG2蛋白的功能奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 HeLa细胞复苏自本研究所冻存细胞，培养基和血清购自美国Hyclone公司。pcDNA3.1（＋）质粒购自美国Invitrogen公司，pSG5－BTG2质粒由意大利Perugia大学Francesco Grignani教授惠赠。DH5α感受态细胞、DNA Marker、氨苄青霉素和质粒提取试剂盒购自天根公司，Prime STAR HS DNA聚合酶、T4DNA连接酶和限制性核酸内切酶购自宝生物公司，引物合成及DNA测序由上海生物工程有限公司完成。Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，蛋白Marker购自美国NEB公司，单克隆 ANTI－FLAG M2抗体购自美国Sigma公司。Odyssey封闭液和IRDye 800CW偶联的羊抗鼠二抗购自北京北方仪涛商贸有限公司。DNA电泳槽和电泳仪为北京六一仪器公司产品，PCR仪、Western blotting所使用的电泳槽和半干转印槽为美国Bio－Rad公司产品，Odyssey近红外激光扫描成像仪为美国Li－Cor公司产品。

1.2 pcDNA3.1（＋）－BTG2载体的构建及鉴定由于pSG5载体表达效率比较低，而且没有可供稳定转染使用的新霉素抗性基因，所以本研究以pSG5－BTG2质粒为模板，用PCR方法扩增出BTG2全长编码序列，重新插入pcDNA3.1（＋）载体的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间。根据BTG2 mRNA序列（NM＿006763.2）的编码区设计PCR引物，在上游引物中插入EcoRⅠ酶切位点（GAATTC）和 Kozak翻译起始序列（GCCACC），在下游引物中插入XhoⅠ酶切位点（CTCGAG）。引物序列如下，BTG2－F：5′－ATAGAATTCGCCACCATGAGCCACGGGAAGGGAAC－3′，BTG2－R：5′－ATACTCGAGCTAGCTGGAGACTGCCATCACGTAG－3′。以pSG5－BTG2质粒为模板，用高保真Prime STAR HS DNA聚合酶进行PCR，PCR 反 应 条 件 为：98℃、10s，55℃、15s，72℃、1min，30个循环。经琼脂糖凝胶电泳验证目的条带后，用PCR产物纯化试剂盒回收BTG2目的片段。用EcoRⅠ和XhoⅠ分别双酶切pcDNA3.1（＋）质粒和PCR产物，用T4DNA连接酶连接载体和插入片段。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，从LA培养板挑取6个单克隆，于100μL LA培养基中培养2h，取1μL菌液在25μL体系中进行PCR鉴定，所用引物同上，选择PCR阳性的菌种送公司测序。

1.3 在pcDNA3.1（＋）－BTG2载体中插入 FLAG标签 设计Oligo DNA：根据FLAG的氨基酸序列设计2条互补的Oligo DNA，合成PAGE纯化级DNA，2条链退火后插入pcDNA3.1（＋）－BTG2载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间。Oligo DNA序列如下，FLAG－top：5′－GATCGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGG －3′，FLAG－bottom：5′－AATTCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCCATGGTGGC－3′。FLAG－top 包 含1个5′－BamHⅠ 酶 切 位 点 的 突 出 末 端 （5′－GATC）、Kozak翻译起始序列（GCCACC）、起始密码子（ATG）和 FLAG 编 码 序 列 （GACTACAAGGACGACGATGACAAG），FLAG－bottom 包 含1个5′－EcoRⅠ酶切位点的突出末端（5′－AATTC）。将 pcDNA3.1（＋ ）－BTG2 载 体 用 BamH Ⅰ 和EcoRⅠ双酶切，退火后的Oligo DNA其突出的黏性末端可连接于酶切后的载体。Oligo DNA的退火和连接：将2条互补Oligo DNA进行退火，先用TE溶解Oligo DNA至浓度为100μmol·L－1，然后将FLAG－top与FLAG－bottom溶液按1∶1混合（浓度为50μmol·L－1），退火条件为：95℃、30s，72℃、2min，37℃、2min，25℃、2min，冰上储存。连接之前先用TE 1∶100稀释退火Oligo至0.5μmol·L－1，连接反应体系如下：酶切载体 （25mg·L－1）2μL，退火 Oligo DNA（0.5μmol·L－1） 1 μL， BSA （10g·L－1）0.5μL，10× T4DNA 连接酶缓冲液1.5μL，T4DNA连接酶（400U·μL－1）0.5μL，无核酸酶水9.5μL，室温连接3h，但不要长于3h，转化前－20℃储存。4μL连接产物转化100μL感受态大肠杆菌DH5α后，在含氨苄青霉素的平板中筛选挑取菌落后抽提质粒。构建的载体用BamHⅠ酶切鉴定，酶切鉴定正确后进行DNA序列测定。

1.4 细胞培养与转染 HeLa细胞在含10%胎牛血清的RPMI－1640培养基中培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。转染前1d将对数生长期的细胞接种于60mm（20cm2）培养皿中，使其在次日细胞融合达到90%，用PBS洗细胞2次，换用无血清培养基培养。利用脂质体Lipofectamine 2000转染试剂，将4μg质粒DNA或10μL Lipofectamine 2000分别加入250μL无血清培养基中混匀，5min后将二者混匀，静置20min后加入HeLa细胞中。转染过程用同等量的空载体质粒作为对照，转染6h后更换含10%血清的培养基。

1.5 Western blotting法检测 FLAG－BTG2蛋白表达 转染后48h收集细胞，用RIPA裂解液抽提细胞总蛋白，13000g、4℃ 离心30min，取5μL上清进行蛋白定量。取40μg总蛋白经10%SDS－PAGE凝胶分离，0.8mA·cm－2恒流30min转移到硝酸纤维素膜上。用Odyssey封闭液封闭1h，一抗为 ANTI－FLAG（1∶1000 稀 释）或ANTI－β－Actin（1∶500稀释），一抗4℃孵育过夜。次日PBST洗膜3次，再与IRDye 800CW偶联的羊抗鼠二抗（1∶5000稀释）室温孵育1h，然后PBST洗膜3次，采用Odyssey CLx红外荧光扫描成像系统进行检测，结果以蛋白表达强度表示。

2 结 果

2.1 pcDNA3.1（＋）－BTG2载体的构建与鉴定以pSG5－BTG2质粒为模板，用PCR法扩增出BTG2全长编码序列，重新插入表达效率高且能稳定转染细胞的pcDNA3.1（＋）载体。为证实载体中是否已插入目的基因，以转化pcDNA3.1（＋）和BTG2连接产物的菌液为模板，进行PCR鉴定（图1）。图1中P为阳性对照（以pSG5－BTG2为模板进行PCR），条带1～6代表不同的菌落，可以看到在500bp处均有单一条带，与理论值大小一致，说明各个载体均已插入BTG2片段。选取2个菌种进行DNA测序，结果表明1号克隆的序列与设计完全一致，说明pcDNA3.1（＋）－BTG2载体构建成功。

图1 PCR法鉴定pcDNA3.1（＋）－BTG2质粒电泳图Fig.1 Electrophoregram of pcDNA3.1（＋）－BTG2vector identified by PCR method

2.2 pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2载体的构建及鉴定 为了表达FLAG－BTG2融合蛋白，本课题组在pcDNA3.1（＋）－BTG2载体中插入了一个FLAG标签 （图2）。首先根据FLAG的氨基酸序列设计并合成2条互补的Oligo DNA，序列设计如图3所示，退火后Oligo DNA突出的黏性末端即可直接连接于酶切后的载体。为便于阳性克隆的鉴定，在设计Oligo DNA时，特别将BamHⅠ酶切位点最右端的一个碱基删除 （图3），这样插入FLAG后载体中的BamHⅠ酶切位点即被破坏，故空载体能被BamHⅠ切开，而插入FLAG的载体无法被BamHⅠ切开 （图3）。用BamHⅠ酶切所构建的载体，1～6号质粒均未切开，说明均已插入FLAG序列 （图4）。酶切鉴定后，将1号和2号阳性克隆送宝生物公司进行DNA测序，测序结果显示：2号克隆的DNA序列正确 （图5），说明pcDNA3.1 （＋）－FLAG－BTG2载体构建成功。

图2 pcDNA－3.1（＋）－FLAG－BTG2载体结构Fig.2 Structure of pcDNA－3.1（＋）－FLAG－BTG2vector

图3 FLAG Oligo DNA设计Fig.3 Oligo DNA design of FLAG

图4 pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2质粒的 BamH Ⅰ酶切电泳图Fig.4 Electrophoregram of pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2 plasmid digested by BamHⅠ

2.3 Western blotting法检测 FLAG－BTG2融合蛋白的表达 带FLAG标签的BTG2融合蛋白在HeLa细胞中能够有效表达 （第3泳道），而第1泳道 （转染空载体）和第2泳道 （转染无FLAG标签的BTG2表达质粒）没有相应的条带。融合蛋白的相对分子质量约为20000，与人BTG2蛋白的相对分子质量接近。Western blotting法检测的结果表明：FLAG－BTG2融合蛋白在HeLa细胞中获得了成功表达。见图6。

3 讨 论

图5 pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2载体DNA测序图谱Fig.5 Sequencing of pcDNA3.1（＋）－FLAG－BTG2vector DNA

图6 Western blotting法检测FLAG－BTG2在HeLa细胞中的表达Fig.6 Expression of FLAG－BTG2in HeLa cells detected by Western blotting method

BTG2是BTG／TOB抗增殖基因家族的成员，研究［10－12］发现：BTG2在肺癌、乳腺癌和胃癌等多种肿瘤中表达水平较相邻的癌旁组织降低，而且过表达BTG2则能抑制肿瘤细胞的增殖和转移。当细胞发生DNA损伤、细胞分化和停止增殖等情况时，BTG2的表达会升高。BTG2还包含核受体LXXLL序列，能够抑制雄激素受体 （androgen receptor，AR）介导的转录调控，明显减缓前列腺癌细 胞 的 生 长 速 度［13］。维 甲 酸 （retinoic acid，RA）通过维甲酸受体 （retinoic acid receptor，RAR）控制造血细胞的分化，BTG2过表达能够增加RARα的转录活性以及RA对白细胞的诱导分化作用。BTG2还参与p53－p21通路诱导的细胞复制性衰老 （replicative senescence），干扰BTG2的表达能够延长成纤维细胞的寿命，这种作用是通过结合和拮抗细胞周期调控蛋白Pin－1完成的［14］。另外，在前列腺细胞中干扰BTG2的表达后，E－Cadherin阳性细胞明显减少，细胞迁移能力升高，细胞出现上皮细胞－间充质转化 （epithelial－mesenchymal transition， EMT） 的 特 征［15］。BTG2是生长因子或DNA损伤等信号通路的下游效应分子，其执行着抑制细胞增殖和侵袭、促进细胞分化和衰老的功能。目前的研究已经证明：BTG2的失活与肿瘤的发生和进展具有密切的关系，但是其发挥作用的分子机制并不十分清楚，因此研究BTG2的功能、揭示其靶基因和相互作用蛋白是亟待解决的问题，这将为肿瘤的诊断和治疗提供新的策略。

蛋白标签 （tag）是指通过DNA重组技术实现标签多肽与目标蛋白 （target protein）的融合表达 （fusion protein），标签有助于对目的蛋白进行方便的检测或纯化。常用的蛋白标签有FLAG、HA、c－Myc、六聚组氨酸 （6×His）、谷胱甘肽巯基转移酶 （GST）和增强型绿色荧光蛋白 （eGFP）等。抗FLAG M2抗体能够用于在蛋白质印迹实验中识别FLAG融合蛋白，或利用免疫沉淀（immunoprecipitation）技术捕获FLAG融合蛋白，可用于研究蛋白质相互的作用。为了给BTG2的功能研究建立实验基础，本课题组在已构建好的BTG2表达载体中插入了FLAG标签，构建了表达FLAG－BTG2融合蛋白的真核表达载体。除了本研究所采用的实验方案外，带标签的表达载体也可以一次构建成功，但是一次完成构建通常需要合成很长的引物，引物过长则在合成DNA时容易出错，导致最后构建完成的载体发生序列错误。而且，本实验所使用的方法同样适用于在空载体或其他目的基因的表达载体中插入各种短小标签 （如c－myc、HA和6×His等）。由于插入的FLAG标签序列非常短小，无法用常规的双酶切方法进行鉴定，所以在设计Oligo DNA时就将BamHⅠ酶切位点最右端的一个碱基删除，这样插入FLAG后的载体无法再被BamHⅠ切开，可以方便地挑出阳性克隆。构建好的质粒转染HaLa细胞后，用抗FLAG抗体能够检测到FLAG－BTG2融合蛋白的表达。图6中除了FLAG－BTG2条带外，在其下方隐约可见另一模糊条带，本文作者认为这是由非特异性反应造成的，是因为在转染空载体的细胞中（第1泳道）也有该条带，而细胞内源性蛋白中并没有FLAG表位。本研究利用标签插入技术成功构建了pcDNA3.1 （＋）－FLAG－BTG2真核表达载体，在转染HeLa细胞后能够有效表达FLAGBTG2融合蛋白，为更深入地研究BTG2蛋白的功能提供了实验平台。

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