NO信号通过I－kappaB磷酸化激活人肝细胞内源凝血因子Ⅷ重表达的调控作用

温 泉，何玉霞，周云飞，王 娟，张 军

（重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，重庆 400016）

甲型血友病是因人凝血因子Ⅷ（human cogulation factorⅧ，FⅧ）缺乏引起的，也称作甲型血友病或血友病A，是临床上最常见的血友病。FⅧ是一个大的糖蛋白，在体内生成过程中受多种因素影响，因此该基因的调控机制极其复杂，国内外研究表明：不仅有内部因素如转录、翻译等参与FⅧ基因的调控，还包括外部因素如血管性假血友病因子（VWF）、一氧化氮（NO）和运动等均可参与其表达调控［1］。血友病是一种遗传疾病，必须针对基因进行治疗才有可能根治。目前传统治疗仍停留在补充凝血因子来预防或治疗血友病的出血症状［2］。精氨酸是一种α氨基酸，作为NO的前体，精氨酸可以协助舒张血管［3］。一氧化氮合酶（nitricoxide synthase，NOS）负责将精氨酸中的氮原子，在氧气（O2）及其他辅助因素包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（triphosphopyridine nucleotide，NADPH）、黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucletide，FAD）、黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）、原血红素及四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）存在的环境下合成NO［4］。由于NOS存在2种类型即结构型和诱生型，肝细胞里存在诱生型，在内毒素或细胞因子刺激下可产生NO［5］。本实验研究发现L－精氨酸在体内通过诱导型一氧化氮合酶（iNOS）作用产生NO，进而通过NO信号途径使得I－κB磷酸化，释放NF－κB进入胞核，具有转录活性的NF－κB与FⅧ基因启动子结合启动FⅧ转录表达，为临床治疗甲型血友病以及凝血功能障碍提供新的靶点和理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 人正常肝细胞L02为重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室保存；胎牛血清购自美国Gibco公司，RPMI－1640购自Hyclone公司，Trizol试剂购自Takara公司，逆转录酶购自Promega公司，PCR Mix购自东盛生物技术公司，兔抗人GAPDH单克隆抗体和兔抗人磷酸化I－kappa－B单克隆抗体购自Abcam公司，HRP标记的鼠抗兔IgG和FITC标记的小鼠抗人FⅧ抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，其他试剂为国产分析纯。

1.2 细胞处理 取对数生长期L02细胞，接种于6孔培养板中（4.0×105细胞／孔），分为无处理的对照组、加药组、抑制剂组和抑制剂对照组。待L02细胞贴壁后经PBS洗涤2次，加药组加入含L－精氨酸（终浓度为15mmol·L－1）的 RPMI－1640培养基2mL，对照组用同体积的灭菌水取代L－精氨酸，抑制剂组加入含N－硝基－L－精氨酸甲酯（NG－nitro－L－arginine methyl ester，L－NAME）（终浓度为100μmol·L－1）RPMI－1640培养基1mL，3h后加入含 L－精氨酸（终浓度为15mmol·L－1）RPMI－1640培养基1mL，抑制剂对照组则只加入含L－NAME（终浓度为100μmol·L－1）RPMI－1640培养基2mL，分别培养12、24、36、48和60h后，收集细胞，冻存于－80℃备用。

1.3 Griess法检测细胞内NO水平 细胞处理：取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化，细胞计数板计数，以1×104mL－1细胞密度铺96孔板，分为对照组、加药组、抑制剂组和抑制剂对照组，每组每个时间点铺4个孔，其中3个孔为实验孔，另一个孔为对照孔，对照孔与实验孔同等处理，但不加检测试剂，调零孔不作任何处理，只加检测试剂。12h贴壁后分别培养0、3、6、12、24、36、48和60h，每个时间点再用MTT同等处理来检测细胞的增殖速度。到时间后MTT组加MTT试剂（用高压灭菌后的去离子水配置成5g·L－1）20μL，细胞孵箱孵育4h，吸弃上清，每孔加150μL DMSO，摇床10min。酶标仪比色（NO／570nm、MTT／490nm）。NO标准稀释：精确称量NaNO26.9mg，加去离子水定容至10mL，即为10mmol·L－1NaNO2标准储存液。分别稀释为浓度 （μmol· L－1）1000、100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.560。加样：各孔中分别加入稀释好的标准应用液或待测样品各50μL。向各孔中加入50μL试剂A，于37℃孵箱中反应10min；向各孔中加入50μL试剂B，于37℃孵箱中反应10min；将96孔板轻轻震荡数次，待各孔反应液完全混匀后，于540nm波长检测各孔吸光度（A）值；根据所得A值，拟合NO反应标准曲线，并由标准曲线计算各待测样品的NO水平。

1.4 流式细胞术检测FⅧ蛋白的表达水平 取对数生长期的加L－精氨酸处理的细胞和正常组细胞，PBS清洗细胞2次，胰酶消化2min后加入等量含10%新生胎牛血清的RPMI－1640培养基终止消化，收集细胞并计数，使细胞浓度约为5×105mL－1即可；分别用Buffer清洗细胞3次，1200r·min－1离心10min后，弃去上清液；分别用Buffer重悬细胞成5×105／100μL的细胞悬液；分别加入FITC标记的小鼠抗人FⅧ抗体（1∶50）和相同体积的PBS溶液各5μL，充分混匀后，避光，4℃冰箱孵育30min；取3mL Buffer洗涤细胞，1200r·min－1离心10min，弃上清，重复此步骤2次，适量Buffer重悬细胞，避光，以流式细胞术分别检测L02细胞加药组和对照组FⅧ蛋白的荧光亮度来表示蛋白的表达水平。

1.5 RT－PCR法检测FⅧ及相关基因的转录水平用Trizol试剂分别提取对照组、加药组、抑制剂组和抑制剂对照组0、12、24、36、48和60h时间点的L02细胞总RNA并定量和检测纯度，取4μg总RNA，逆转录合成cDNA第一链，反应条件：70℃变性5min，42℃反应60min。以cDNA链作为模板，进行PCR扩增反应。20μL反应体系：模板cDNA 0.2μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，PCR Mix 10μL，超纯水9.4μL。混匀后相应条件下进行PCR反应（PCR产物4℃保存）：各个基因反应条件不一致，按各自反应温度进行PCR，各基因反应条件见表1；取扩增产物5μL，进行琼脂糖凝胶电泳（2%，50min），用凝胶成像系统（Bio－Rad）成像，Quantity One软件分析目的条带灰度值，以目的条带值与GAPDH灰度值比值表示mRNA转录水平。

表1 引物序列和PCR条件Tab.1 Sequences of primers and PCR conditions

1.6 Western blotting检测磷酸化I－κB 蛋白表达水平 抽提对照组、实验组、抑制剂组和抑制剂对照组0、12、24、36、48和60h时间点的细胞总蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，取50μg蛋白与Loading Buffer煮沸变性，经SDS－PAGE分离后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭3h；分别加入兔抗人GAPDH单克隆抗体 （1∶3000稀释）和兔抗人磷酸化I－κB单克隆抗体（1∶2000稀释），4℃水平摇床上过夜；再加入HRP标记的鼠抗兔IgG （1∶5000），37℃作用2h；洗膜后ECL法显色，凝胶成像系统扫描，Quantity One软件分析条带A值，以目的条带A值／GAPDH A值表示蛋白表达水平。

1.7 统计学分析 采用Origin 6.0统计软件进行统计分析。各组细胞的NO水平和FⅧmRNA、NF－κB1mRNA、I－κB mRNA 及 phosphorylate I－κB蛋白表达水平以表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 流式细胞术检测人FⅧ蛋白表达 流式细胞术检测到加L－精氨酸培养48h后L02中出现人FⅧ蛋白的表达。见图1。

图1 流式细胞术检测L－精氨酸作用后FⅧ蛋白表达Fig.1 Epressions of FⅧ protein after treated with L－arginine detected by flow cytometry

2.2 Griess法检测L02细胞中NO水平 加药组L02细胞中3、6和12h时NO表达水平分别为0.860±0.022、0.910±0.021和1.063±0.021，其表达水平随L－精氨酸作用时间增加而增加，均高于对照组NO表达水平 （0.803±0.011）、抑制剂 （0.810±0.013）和抑制剂对照组 （0.806±0.013）（P＜0.05），24、36、48和60hNO表达水平又基本恢复到正常水平；RT－PCR法检测显示：对照组iNOS mRNA低水平表达，见图2。

2.3 RT－PCR法检测基因转录 加药组L02中有人FⅧmRNA的转录，对照组、抑制剂组和抑制剂对照组均无人FⅧmRNA的转录，加药组NF－κB和 I－κB alpha 转录水平均有上升（P ＜0.05），对照组、抑制剂组和抑制剂对照组上述基因转录水平差异均无统计学意义 （P＞0.05）。见图3～5。

图2 对照组iNOS mRNA表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expression of iNOS mRNA in blank control group

图3 加药组不同时间点FⅧmRNA转录水平电泳图Fig.3 Electrophoregram of transcription levels of FⅧmRNA in experimental group at different time points

2.4 Western blotting法检测磷酸化I－κB 蛋白表达 磷酸化I－κB加药组0、12、24和36hFⅧ表达水平逐渐增加，36h表达水平最高，48和60h表达水平逐渐下降，恢复到正常表达水平，正常组和抑制剂组则无明显变化。见图6。

图4 不同浓度抑制剂L－NAME抑制36h后FⅧ mRNA转录水平电泳图Fig.4 Electrophoregram of transcription levels of FⅧmRNA in 36hafter treated with different does of L－NAME

3 讨 论

Ingerslev等［2］发现：新鲜分离的人肝细胞能分泌FⅧ，Hollestelle等［3］研究发现：离体培养约30d的人肝细胞有合成和分泌FⅧ的能力，而长期离开人体内环境培养的肝细胞合成和分泌FⅧ的能力已经减退。有报道［6－8］显示：肝移植患者手术移植肝脏一段时间后，患者凝血水平出现显著下降。本研究通过RT－PCR法检测正常永生化的人肝细胞L02中FⅧ基因的mRNA转录情况，均无人FⅧ基因的mRNA转录。L－精氨酸是生成NO的前提物质，在NOS的作用下，精氨酸生成NO和L－胍氨酸［9］。Griess法检测L02细胞内NO水平结果显示：加药组前期L－精氨酸通过细胞内的NOS作用后，生成一定量的NO，并透过细胞壁扩散进细胞内，使得L02细胞内NO水平升高，正常组、抑制剂组和抑制剂对照组L02细胞内NO水平则稳定的维持在一个恒定水平。本研究中RT－PCR法检测结果显示：人肝细胞中有iNOS mRNA表达，说明在人肝细胞中存在的NOS为iNOS型。RT－PCR检测结果显示：精氨酸刺激24h开始表达FⅧmRNA，36h达到最高，48和60h表达水平逐渐下降，最后趋于正常的本底表达。本研究通过软件查找出FⅧ启动子上游1000bp转录因子的结合位点，查找出FⅧ上游转录因子结合位点NF－κB1。文献［10］表明：L－精氨酸可以有效促进FⅧA2结构域基因启动，通过作用于A2结构域基因内部的某个调控元件，进而增强人凝血FⅧ基因的转录和表达。RT－PCR结果显示：加药后NF－κB1和I－κB alpha基因的转录水平均有增加，而文献［11］显示：在静息状态下，NF－κB与其天然抑制因子I－κB结合存在于胞质内，对诸多靶基因不发挥调控作用；当细胞受到刺激后，I－κB被磷酸化，随之被泛素化蛋白小体降解，释放NF－κB进入胞核，NF－κB结合于靶基因启动子上的顺式作用元件，从而促使基因表达。当加入精氨酸刺激细胞前3h加入L－NAME后，细胞恢复到正常状态，不再表达FⅧ，转录因子NF－κB1表达水平也不再发生变化，维持恒定水平，说明细胞重表达FⅧ主要是L－精氨酸在iNOS作用下产生NO进而活化NO信号通路引起的。NO是一种嗜脂性物质，很容易透过细胞膜，直接扩散和进入靶细胞［12］。也有学者［13］认为：NOS生成的NO可能先与含巯基的载体分子结合或形成硝基硫醇复合物，到达靶细胞后，NO从载体释放并直接扩散到靶细胞内。进入靶细胞内的NO与鸟苷酸环化酶中的血红素成分 （Fe2＋）结合使之激活，产生cGMP，发挥生物效应［14］。本文作者推测：L－精氨酸在iNOS作用下产生了NO，进而通过NO－cGMP－PKG途径使得cGMP－PKG途径信号通路活化，通过一系列信号级联反应磷酸化I－κB，Western blotting检测的磷酸化I－κB蛋白表达增加也为此推测提供了依据，而其中NO是如何通过NO－cGMP－PKG途径使得I－κB磷酸化将是本课题组下一步研究的重点。

图5 各组L02细胞中人FⅧ、NF－κB1和I－κB基因mRNA转录水平电泳图Fig.5 Electrophoregram of transcription levels of human FⅧ，NF－κB1and I－κB gene mRNA in L02cells in various groups

图6 各组磷酸化I－κB蛋白表达电泳图Fig.6 Electrophoregram of expressions of phosphorylated I－κB protein in various groups

综上所述，L－精氨酸在人肝细胞内通过iNOS作用产生NO，进而通过NO信号通路最终使I－κB磷酸化，释放NF－κB进入胞核，具有转录活性的NF－κB与FⅧ基因启动子结合启动FⅧ转录表达，使得离体的永生化肝细胞L02重新启动表达FⅧ。

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