组蛋白去乙酰化酶抑制剂 SAHA 对卵巢癌SKOV3细胞的化疗增敏作用

梁 冰，刘 扬，宋金萍，曲丹华，刘纯岩

(1. 吉林大学护理学院妇产科护理教研室，吉林 长春130021；2．吉林大学公共卫生学院放射医学实验教学中心，吉林 长春 130021；3．吉林大学基础医学院病理学与病理生理学系，吉林 长春 130021；4. 吉林大学第二医院呼吸内科，吉林 长春130041； 5．吉林大学第二医院放射线科，吉林 长春 130041)

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤[1]，据统计，全世界每年有近204 000例新发病例，并有近125 000名妇女死于卵巢癌，其严重威胁女性的生命健康[2]。上皮性卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统肿瘤，约占卵巢恶性肿瘤的90%[3]。尽管大多数卵巢癌患者在标准治疗后达到了预期效果，但其5年生存率无明显改善。在细胞减灭手术和基于铂或紫杉醇药物化疗后，由于存在原发和继发耐药现象，卵巢癌复发率高达70%[4]。因此，寻找卵巢癌化疗耐药后的敏感新药和优化化疗联合方案势在必行。据报道[5]：组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)在各种癌症(包括卵巢癌)中过度表达。HDAC抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)是新兴的且有开发前景的抗肿瘤化合物。辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)为一种常用的HDACIs，已被用于治疗实体瘤和血液肿瘤[6]。SAHA在体外可抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖、诱导凋亡，但目前尚无关于SAHA联合长春新碱(vincristine，VCR)作用于卵巢癌的研究报道。本研究应用SAHA作用于卵巢癌SKOV3细胞，体外观察SAHA对SKOV3细胞增殖及化疗敏感性的作用，并探讨其对细胞凋亡、自噬及周期的影响，进一步为临床研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器 人卵巢癌SKOV3细胞由加拿大British Columbia Cancer Research Centre的Dr Ling惠赠。α-MEM培养基和胰蛋白酶购自美国 Gibco公司，VCR和SAHA 粉末购自美国Sellek公司，细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁公司，单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC)染料购自美国Sigma公司。流式细胞仪购自美国BD公司，酶标仪购自美国伯腾公司。

1.2 细胞培养 人卵巢SKOV3细胞采用α-MEM培养基(含15%FBS、青霉素和链霉素各100 U·mL-1)置于37℃、5% CO2培养箱中培养，采用0.25% 胰酶(含0.2% EDTA)消化并传代，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 CCK-8法检测细胞生存率 收集对数生长期SKOV3细胞，接种于96孔培养板内，每孔加入1×104个细胞，置于37℃、5%CO2环境中孵育24 h。按照实验需求处理细胞并将细胞分组。VCR组：终浓度分别为0(对照组)、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、10.00、20.00、30.00和40.00 mg·L-1；SAHA组：终浓度分别为0(对照组)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8和25.6 μmol·L-1；SAHA+VCR组：SAHA浓度为3和5 μmol·L-1，VCR浓度分别为0、0.01、0.05、0.10和0.50 mg·L-1，作用时间均为24 h。对照组细胞不给予任何处理(VCR 0 mg·L-1)。每组设3个复孔，置于 37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。24 h后弃去原培养基，每孔加入90 μL新鲜培养基及10 μL CCK-8溶液，低速振荡混匀，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2 h，于酶标仪450 nm波长处测定各孔吸光度(A)值，计算细胞生存率。细胞生存率=实验组A值 /对照组A值×100%。

1.4 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率、自噬和周期分布 取对数生长期细胞分为对照组(0 μmol·L-1SHHA， 0 μmol·L-1VCR)、SAHA组(3或5 μmol·L-1)、VCR组(0.1 mg·L-1)、SAHA+VCR组(3或5 μmol·L-1SAHA +0.1 mg·L-1VCR)，置于 37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，收集各组细胞，采用PBS洗涤3次，调整细胞浓度保证每个样品收集1×105个细胞。① 细胞凋亡率检测：每个样品分别加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI染色液，混合均匀，室温下避光孵育 20 min。染色后1 h 内，采用FCM Cell Quest软件检测并分析各组细胞凋亡率。② 细胞自噬率检测：每个样品分别加入终浓度为0.05 mmol·L-1MDC，于37℃避光孵育30 min，PBS 洗涤3次，每个样品加入1 mL 4%多聚甲醛，室温避光固定15 min，PBS 洗涤1次，FCM检测分析各组MDC阳性细胞百分率(即细胞自噬率)，所得数据采用Cell Quest软件进行分析。③ 细胞周期检测：每个样品分别加入400 μL RNAse A，200 μL PI(含Triton-X 100)，充分混匀，室温避光孵育20 min，FCM检测细胞周期，Cell Quest软件收集，ModFit软件分析数据，结果以各期细胞百分率表示。每个样本至少设 3复孔。实验重复 3 次。

2 结 果

2.1 各组SKOV3细胞生存率 与对照组比较，SAHA组和VCR组SKOV3细胞生存率降低，尤其在0.10、0.50、1.00、10.00、20.00、30.00、40.00 mg·L-1VCR组(P<0.05)和1.6、3.2、6.4、12.8、25.6 μmol·L-1SAHA组(P<0.05)，并且其诱导的细胞毒性具有剂量依赖性，见表1。与SAHA 或VCR 组比较，SAHA + VCR组SKOV3细胞生存率明显降低(P<0.05)。见表2。

2.2 各组SKOV3细胞凋亡率 与对照组(6.11%±0.03%)比较，VCR组细胞凋亡率(17.77%±0.27%)明显升高(P<0.05)，3 μmol·L-1SAHA组(15.03%±0.83)%和 5 μmol·L-1SAHA组(20.24%±0.52%)SKOV3细胞凋亡率升高(P<0.05)，且SAHA浓度越高，细胞凋亡率越高(P<0.05)。与SAHA或VCR组比较，3 μmol·L-1SAHA + VCR 组(27.14%±1.48%)和5 μmol·L-1SAHA + VCR 组(40.12%±2.10%)细胞凋亡率升高(P<0.05)。见图 1。

表1 CCK-8法检测VCR和SAHA组SKOV3细胞生存率

GroupSurvival rateVCR (mg·L-1) 0(control)100.00±9.98 0.0198.17±3.34 0.0597.01±4.09 0.1065.89±4.25* 0.5043.57±6.77* 1.0041.58±4.07* 10.0038.92±3.10* 20.0038.76±4.26* 30.0037.26±4.24* 40.0035.10±2.54*SAHA(μmol·L-1 ) 0(control)100.00±3.26 0.199.83±4.73 0.298.75±1.81 0.495.90±6.52 0.893.15±4.07 1.685.96±1.49* 3.270.09±4.97* 6.452.88±1.00* 12.838.43±2.79* 25.628.40±0.77*

*P<0.05 compared with control group.

2.3 各组SKOV3细胞自噬率 VCR能够诱导SKOV3细胞发生自噬，与对照组比较，3和5 μmol·L-1SAHA 组细胞自噬率明显升高，且SAHA浓度越高，SKOV3细胞自噬率升高越明显(P<0.05)。与SAHA 或VCR 组比较，SAHA + VCR 组细胞自噬率明显升高(P<0.05)。见图 2。

2.4 各组细胞周期分布情况 与对照组比较，只加入VCR(0.1 mg·L-1)和只加入SAHA组(3或5 μmol·L-1)G2/ M 期细胞百分率明显升高(P<0.05)，G1期细胞百分率降低(P<0.05)；与只加入VCR组比较，SAHA + VCR 组G2/ M期细胞百分率升高(P<0.05)；与3 μmol·L-1SHHA组或5 μmol·L-1SAHA组比较，SAHA+VCR组G2/M期细胞百分率升高(P<0.05)。见图 3和表3。

3 讨 论

由于患者对化疗药物的反应差导致其生存率低，是治疗卵巢癌的一个亟待解决的难题。表观遗传学中的乙酰化修饰调节与肿瘤的发生发展密切相关。组蛋白是真核生物体内染色体中的碱性蛋白质，其乙酰化与去乙酰化受组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和HDAC两类酶调节。HDACIs是一种新兴的抗肿瘤化合物，HDACIs可以通过抑制核小体组蛋白中的HDAC活性促进组蛋白乙酰化，进而调节染色质动力学，激活某些基因的转录，最终抑制肿瘤的发生发展[7]。HDACIs具有多种抗癌活性，如可促进细胞周期阻滞、细胞凋亡、血管发生抑制和DNA损伤。

表2 CCK-8法检测SAHA+VCR组SKOV3细胞生存率

SAHA(μmol·L-1) Survival rateVCR (mg·L-1) 00.010.050.100.500100.00±3.7199.58±4.4698.36±2.8469.30±2.03*52.00±1.46*378.07±2.14*76.90±2.46*△74.23±4.77*#41.47±3.53*○▲30.33±1.66*□●563.83±4.51*59.19±4.11*●58.54±3.56*●30.20±2.77*○■17.00±1.25*▲■

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with 0 μmol·L-1SAHA+0.01 mg·L-1VCR group;#P<0.05vs0 μmol·L-1SAHA+0.05 mg·L-1VCR group;○P<0.05vs0 μmol·L-1SAHA+0.10 mg·L-1VCR group;□P<0.05vs0 μmol·L-1SAHA+0.50 mg·L-1VCR group;●P<0.05 compared with 3 μmol·L-1SAHA+0 mg·L-1VCR group;■P<0.05 compared with 5 μmol·L-1SAHA+0 mg·L-1VCR group.

A:Control group;B:3 μmol·L-1SAHA group;C:5 μmol·L-1SAHA group;D:VCR group;E:3 μmol·L-1SAHA+VCR group;F:5 μmol·L-1SAHA+VCR group.

图1 FCM检测各组SKOV3 细胞凋亡率

Fig.1 Apoptotic rates of SKOV3 cells in various groups detected by FCM

A:Control group;B:3 μmol·L-1SAHA group;C:5 μmol·L-1SAHA group;D:VCR group;E:3 μmol·L-1SAHA+VCR group;F:5 μmol·L-1SAHA+VCR group.

图2 FCM检测各组SKOV3 细胞自噬率

Fig.2 Autophagy rates of SKOV3 cells in various groups detected by FCM

HDACIs根据其化学结构分为4种不同类型，分别是异羟肟酸、环肽、短链脂肪酸和苯甲酰胺[8]。SAHA属于异羟肟酸类的HDACIs，是1种具有膜通透性的可逆的竞争性抑制剂，其通过与位于HDAC的催化结构域中的锌离子结合，在细胞质和细胞核中均能发挥抑制HDAC的作用[9]。SAHA能够抑制Ⅰ类HDAC(HDAC1、HDAC2和HDAC3)和Ⅱ类HDAC(HDAC6)，是美国食品和药物管理局(FDA)批准用于皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T cell lymphoma,CTCL)临床应用的第1种HDACIs[10]。SAHA对正常细胞的毒性较低[11]，在结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和口腔鳞状细胞癌等不同肿瘤治疗中具有较大潜力[12]。

本研究结果显示：SAHA以剂量依赖的方式抑制了卵巢癌SKOV3细胞的增殖。联合使用SAHA和VCR能够进一步增加SKOV3细胞的死亡率，即起到增敏作用，这种现象的机制尚未清楚。细胞的死亡方式有很多种，其中最重要细胞死亡方式是凋亡和自噬。VCR能够诱导肿瘤细胞发生凋亡和自噬[13-14]。研究[15]显示：SAHA可以通过诱导凋亡来抑制卵巢癌细胞的生长。并且最近报道[16]指出：HDACIs是肿瘤细胞中有效的自噬诱导剂，在某些高增殖性肿瘤中自噬是HDACIs的重要治疗靶点。将SAHA与其他药物联合应用可增强细胞自噬水平，最终提高抗肿瘤治疗的效果。本研究结果显示：与对照组比较，SAHA与VCR均能够诱导SKOV3细胞发生凋亡；与Dietrich等[15]发现的SAHA可以通过诱导凋亡来抑制卵巢癌细胞生长的结论一致。与SAHA或VCR组比较，SAHA + VCR 组细胞凋亡率进一步升高，说明SAHA 和 VCR联合用药能够使SKOV3细胞凋亡率升高，SAHA可以增强SKOV3细胞对VCR的敏感性。经SAHA或VCR处理后，SKOV3细胞自噬率明显升高。为明确SAHA在VCR诱导卵巢癌细胞自噬性死亡中的作用，本研究分别使用不同浓度SAHA与VCR联合作用SKOV3细胞的结果显示：与单独用药组比较，SAHA+VCR组细胞自噬率升高更为明显，说明SAHA不仅能够诱导卵巢癌细胞发生自噬性死亡，而且增强了VCR诱导的SKOV3细胞的自噬水平。上述结果为SAHA联合化疗药治疗卵巢癌提供了重要的靶点。

A:Control group;B:3 μmol·L-1SAHA group;C:5 μmol·L-1SAHA group;D:VCR group;E:3 μmol·L-1SAHA+VCR group;F:5 μmol·L-1SAHA+VCR group.

图3 FCM检测各组SKOV3 细胞不同细胞周期分布

Fig.3 Distribution of SKOV3 cells at different cell cycles in various groups detected by FCM

表3 FCM检测各组SKOV3 细胞不同周期百分率

GroupPercentage of cellsG1SG2 / MSAHA(μmol·L-1)+ 0+0(control)69.60±1.4515.06±1.9615.34±0.50 VCR(mg·L-1)3+040.41±2.82*13.99±3.8045.60±2.02*5+025.59±0.16*13.46±1.22*60.95±0.28*0+0.130.52±1.09*14.00±0.6655.48±1.76*3+0.115.75±3.65*△#○9.30±3.31*△#○74.95±0.34*△#○5+0.113.87±1.23*△#○6.22±2.53*△#○79.91±1.30*△#○

*P<0.05 compared with control group(0+0)；△P<0.05 compared with 0 μmol·L-1SAHA+0.1 mg·L-1VCR group；#P<0.05 compared with 3 μmol·L-1SAHA group;○P<0.05 compared with 5 μmol·L-1SAHA group.

VCR是从长春花中提取出来的有效成分，主要通过抑制微管蛋白的聚合影响纺锤体微管的形成，使细胞停止在有丝分裂中期而发挥抗肿瘤作用。临床上常用于急性淋巴细胞性白血病的治疗，除此之外，对其他肿瘤如乳腺癌、恶性淋巴肿瘤、卵巢癌和淋巴肉瘤也有疗效。本研究采用FCM检测细胞周期的结果显示：VCR将SKOV3细胞阻滞于G2/ M期。研究[17-18]显示：HDACIs可以抑制cyclin B1蛋白的表达，进而促进肿瘤细胞阻滞于G2/ M期。本研究结果显示：不同浓度SAHA均导致了细胞于G2/ M期进程阻滞，证实了Lee 等[16]研究中SAHA诱导MCF-7乳腺癌细胞发生G2/ M期进程阻滞这一结论。SAHA与VCR联用后，G2/M期细胞数量进一步增加，说明SAHA促进VCR诱导的SKOV3细胞G2/ M期阻滞，为SAHA与化疗药物联合应用治疗卵巢癌提供了理论依据。细胞增殖与细胞周期关系密切，正常细胞周期主要由G0/ G1、S和G2/ M期组成，SAHA联合VCR对细胞G2/ M期有延缓或阻滞效应，可抑制细胞有丝分裂，进而抑制细胞增殖。因此SAHA发挥的细胞周期阻滞作用是其发挥化疗增敏作用的另一重要机制。

综上所述，SAHA可以通过G2/ M期阻滞抑制细胞周期进程，诱导细胞凋亡和发生自噬，最终发挥增强卵巢癌细胞对VCR敏感性的作用。化疗药物具有多种副作用，应用SAHA可以明显降低化疗药物的使用剂量，同时保持相同的治疗效果，因此将SAHA与化疗药物联合应用可能是提高卵巢癌患者化疗疗效的新策略。

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