茵陈提取物对糖尿病大鼠肾组织中miRNAs表达谱的影响及其肾脏保护作用

孙成博，孙 波，刘春禹，李星儒，王志琴，张璟祎，张雪绵，王泽红，于晓艳

(1.吉林大学药学院实验药理与毒理学教研室，吉林 长春 130021；2.吉林省中医院针灸科，吉林 长春 130021)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是由糖尿病引起的一种常见的慢性并发症，中医药防治糖尿病有上千年的历史，中西医结合防治DN在我国已成为趋势。微小核糖核酸 (miRNAs) 是一类含有20～25个核苷酸、具有调控功能的内源性非编码RNAs，约占总基因的4%[1]。近年来，基因芯片和测序等技术的快速发展极大地加速了miRNAs的研究进程，其在DN发病机制中作用的研究也逐步深入，研究[2-13]显示：多种miRNA参与DN的发病过程 ，由于DN发病机制极其复杂，miRNA参与调控的机制更为复杂，miRNA在DN中的具体表达水平、参与DN发展进程的机制以及参与调控的miRNA的种类和数量仍需更多的科学研究来验证。茵陈为菊科植物茵陈蒿或滨蒿的地上干燥部分，我国大多地区皆有分布，在山西和安徽等地最为常见。潘竞锵等[14-15]研究发现:茵陈蒿可降低糖尿病动物空腹血糖水平，改善糖耐量减退。栾智杰[16]研究发现：茵陈蒿汤可在一定程度上改善肾衰大鼠肾功能，延缓肾脏衰竭。目前关于茵陈与DN的研究较少，且多见于复方，迄今为止尚未检索到基于miRNA水平探讨茵陈对于DN防治作用的研究报道。本课题组前期实验[17]已证实：茵陈提取物(herba artemisiae capillaris extracts，HACE)对DN大鼠肾脏有保护作用。本研究将在前期实验基础上进行深层次的研究，从miRNAs角度探讨HACE干预DN的相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器 60只雄性Wistar 大鼠，体质量190～220 g，购于吉林大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(辽)2015-0006。HACE购自湖南诺泽生物科技有限公司(批号131122，经高效液相色谱检测绿原酸百分率为1.32%,对羟基苯乙酮百分率为0.18%)，链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司，批号15215)， All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit和大鼠miRNAs(广州复能基因有限公司)，其他试剂均为国产分析纯。ABI 实时PCR仪(美国应用生物系统公司)，台式高速离心机(中国湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，日立7150全自动生化分析仪(日本日立公司)。

1.2 DN模型的制备和分组 大鼠适应性饲养1周，禁食12 h后，腹腔注射2%STZ(55 mg·kg-1)复制DN模型；将注射等量0.1 mmol·L-1枸橼酸盐缓冲液的大鼠作为对照组(n=12)。1周后选择血糖水平≥16.67 mmol·L-1、尿糖≥的大鼠视为造模成功糖尿病大鼠。将48只造模成功的糖尿病大鼠随机分为模型组(DN)和 HACE组，每组24只。HACE组大鼠每日灌胃HACE(5 g·kg-1)1次，对照组和模型组大鼠每日1次给予等量生理盐水。分别于给药8和16周处死大鼠。在饲养期间，监测各组大鼠血糖和尿糖水平，每周1次。

1.3 大鼠尿白蛋白和尿总蛋白排泄率检测 大鼠处死前代谢笼收集24 h尿量，采用日立7150全自动生化分析仪检测大鼠尿白蛋白和尿总蛋白浓度。尿白蛋白排泄率(mg·24 h-1)=尿白蛋白浓度(g·L-1)×24 h尿量(mL)；尿总蛋白排泄率(mg·24 h-1)=尿总蛋白浓度(g·L-1)×24 h尿量(mL)。

1.4 HE染色观察大鼠肾组织形态表现 石蜡标本切片后进行常规HE染色，观察大鼠肾组织结构。

1.5 miRNAs基因芯片初筛miRNAs差异表达谱 根据大鼠尿蛋白排泄率结果，在给药8周后各组大鼠中随机挑选2个肾脏，由华联生物科技采用MRmiOA 5.0版本芯片测定肾组织中miRNAs表达谱的变化(服务号2r614052802)。miRNAs表达量采用荧光强度表示。

1.6 RT-qPCR法验证大鼠肾组织中miRNAs的相对表达量 分析miRNAs芯片初筛结果，对于差异表达在1.74倍(log2 |Fold change|>0.8)以上、高丰度(信号>800)的miRNAs结合miRNA相关生物信息数据库筛选高表达阳性miRNAs。采用RT-qPCR法分别针对8和16周大鼠肾脏验证筛选的miRNAs的相对表达量。采用△Ct值表示各个miRNAs的相对表达量(△Ct值=目的基因的Ct值-内参U6的Ct值)。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般状态、尿白蛋白和尿总蛋白排泄率 一般状态：与对照组比较，模型组大鼠体质量明显减轻，并出现明显的“三多一少”症状，即多饮、多尿、多食及消瘦；HACE组大鼠的状态明显改善。实验过程中大鼠有死亡情况，其中对照组无死亡，模型组死亡2只，HACE组死亡1只。给药8周后，与对照组(0.23 mg±0.05 mg)比较，模型组大鼠尿白蛋白排泄率(0.47 mg±0.11 mg)明显升高(P<0.05)；与模型组比较，HACE组大鼠尿白蛋白排泄率(0.32 mg±0.13 mg)明显降低(P<0.05)；尿总蛋白排泄率组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药16周后，与对照组(0.36 mg±0.22 mg)比较，模型组大鼠尿白蛋白排泄率(0.79 mg±0.45 mg)明显升高(P<0.05)；与模型组比较，HACE组大鼠尿白蛋白排泄率(0.46 mg±0.22 mg)明显降低(P<0.05)；尿总蛋白排泄率组间比较差异无统计学意义，但与对照组(16.14 mg±4.75 mg)和HACE组(16.55 mg±13.07 mg)比较，模型组大鼠尿白蛋白排泄率(30.63 mg±29.72 mg)有升高趋势。

2.2 各组大鼠肾组织形态表现 对照组大鼠肾小球大小均匀。8周时模型组大鼠部分肾小球出现轻重程度不同的病变，表现为肾小球体积肿大、系膜区扩大、细胞数目增加；16周时大鼠病变肾小球数目明显增多，病变程度明显加重。8和16周时HACE组大鼠病变肾小球数目均少于模型组，且肾小球体积肿大和系膜区扩大等病变程度也有所减轻。见图1(插页三)。

2.3 miRNA芯片初筛miRNAs差异表达谱 对照组和模型组大鼠肾组织中miRNAs的表达谱中共筛选出35个差异表达的miRNAs，筛选标准为差异表达在1.74倍(log2 |Fold change|>0.8)以上且表达信号>800，其中模型组miRNAs上调的基因23个，miRNAs下调的基因12个。HACE组和模型组大鼠肾组织中miRNAs表达谱中共筛选出差异表达的miRNA 17个，其中HACE组miRNAs上调的基因1个，下调的基因16个。见图2。

图2 miRNAs芯片差异表达谱

2.4 各组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量 对于差异表达的miRNAs结合miRNA相关生物信息数据库筛选出7个与DN密切相关且变化较为明显的阳性miRNAs，即miR-21-5p、miR-1306-3p、miR-92b-5p、miR-672-5p、miR-466d、let-7b和miR-3550。采用RT-qPCR法对这7个miRNAs验证的结果显示：给药8周后，与对照组比较，模型组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量明显降低的有miR-1306-3p(P<0.05)、miR-672-5p(P<0.05)和miR-3550(P<0.01)；miR-21-5p和miR-92b-5p表达量虽有降低的趋势，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组比较，HACE组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量明显升高的仅有miR-672-5p(P<0.05)；miR-21-5p、miR-92b-5p和miR-3550相对表达量虽有升高的趋势，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药8周后表达量发生变化且给予HACE后趋于正常的miRNAs仅有miR-672-5p。见表1。

表1 给药8周后各组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量(ΔCt)

GroupnmiR-21-5pmiR-1306-3pmiR-92b-5pmiR-672-5pmiR-466dlet-7bmiR-3550Control12-1.50±0.231.53±0.21-9.37±1.970.51±0.072.75±0.13-1.84±0.296.44±0.19Model24-1.26±0.223.70±0.43*-8.08±1.521.54±0.26*2.96±0.29-1.86±0.417.68±0.38**HACE24-1.68±0.283.83±1.03*-9.26±1.010.77±0.11△3.56±0.52-1.73±0.347.24±0.55*

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group；△P<0.05 compared with model group.

给药16周后，与对照组比较，模型组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量升高的为miR-21-5p(P<0.01)，相对表达量降低的为miR-1306-3p(P<0.05)、miR-672-5p(P<0.01)和miR-466d(P<0.05)；与模型组比较，HACE组大鼠肾组织中miRNAs相对表达量降低的有miR-21-5p(P<0.05)和miR-1306-3p(P<0.05)，相对表达量升高的有miR-672-5p(P<0.05)。给药16周后相对表达量变化且给予HACE后趋于正常的miRNAs有miR-21-5p和miR-672-5p。见表2。

表2 给药16周后各组大鼠肾组织中miRNAs的相对表达量(ΔCt)

GroupnmiR-21-5pmiR-1306-3pmiR-92b-5pmiR-672-5pmiR-466dlet-7bmiR-3550Control12-1.40±0.372.26±0.52-6.80±1.661.14±0.262.58±0.35-1.27±0.256.04±1.28Model24-3.64±0.38**3.31±0.94*-6.85±1.443.28±0.34**4.20±0.58*-0.88±0.287.60±0.66HACE24-1.79±0.37△5.09±0.26△-7.85±1.761.98±0.36△5.10±1.00**-0.90±0.216.74±0.98

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group；△P<0.05 compared with model group.

3 讨 论

本课题组在前期研究[1]的基础上，应用单次腹腔注射STZ复制DN大鼠模型，从肾功能和肾脏病理学改变等方面观察HACE对DN大鼠不同时期的保护作用，并采用miRNA芯片技术筛选DN大鼠差异表达的阳性miRNAs，对部分阳性miRNAs进行相关的验证。

模型组大鼠尿白蛋白排泄率明显升高，肾组织中肾小球出现不同程度的病理变化，给予HACE治疗后，这二方面均有不同程度的改善，且随着给药时间的延长，其改善作用也随之增强，说明HACE可以缓解DN大鼠肾脏功能和组织形态改变，且不论在DN大鼠的任何阶段，HACH均可在一定程度上保护肾脏，抑制肾脏病变的进展。

miRNA芯片筛查与RT-qPCR验证已成为近年来研究miRNAs差异表达的最常用技术手段。多项研究表明：DN状态下miRNAs表达谱出现变化。彭睿等[18]通过芯片筛查检测早期DN患者中miRNAs差异表达谱发现：有明显差异表达的miRNAs共有49个，其中35个表达量升高，14个表达量降低，RT-qPCR验证结果与芯片一致。张政等[19]通过芯片筛查检测早期DN小鼠肾组织中miRNAs差异表达谱结果显示：有66个miRNAs有明显差异表达，其中35个表达量升高，31个表达量降低，差异倍数为1.08～10.20;RT-qPCR进一步验证其中一部分miRNAs表达结果显示：有3个miRNAs呈高表达，4个miRNAs呈低表达。杨雪唯等[20]研究发现：与正常小鼠比较，DN小鼠肾组织中miR-196a、miR-21、miR-200b表达量明显升高，且与血糖、甘油三酯、总胆固醇、24 h尿蛋白排泄率呈正相关关系。Campion等[21]还提出将miRNAs作为DN诊断与预后的重要生物标记物。本研究结果显示：组间多个miRNAs出现差异表达。结合相关研究[22-23]和生物信息学数据库，本课题组选择了7个与DN密切相关且差异表达在1.74倍(log2|Fold change|>0.8)以上、高丰度(信号>800)miRNAs进行RT-qPCR验证显示：本实验中DN miRNAs表达谱存在一定的差异表达，且在疾病的不同时期miRNAs的表达谱也不同，在DN早期(给药8周)时， miR-21-5p相对表达量变化不明显；DN中期(给药16周)时miR-21-5p相对表达量明显升高。在给药8周时miR-466d相对表达量无明显变化，给药16周时其相对表达量明显降低。而给药8和16周时miR-1306-3p和miR-672-5p相对表达量的变化趋势一致。还有一些miRNAs相对表达量在给药8周时有所变化，给药16周时无变化，如miR-3550。上述结果提示DN时miRNAs的变化较为复杂。给予HACE治疗后，部分miRNAs表达发生了变化，本研究分析2个时间点的RT-qPCR结果显示：造模后出现差异变化且给予HACE后表达量趋于正常的miRNAs有miR-21-5p和miR-672-5p，提示HACE可能通过影响这2个miRNAs表达从而延缓DN的发生发展。

综上所述，本研究在证实了HACE的肾脏保护作用基础上，筛查了大鼠DN不同时期miRNAs表达谱的变化，提示多个miRNAs参与DN的发生发展，且部分miRNAs的变化在给予HACE治疗后可趋向于正常，提示部分miRNAs参与了HACE对DN的干预作用。本文作者下一步计划以miR-21-5p或miR-672-5p作为研究目标，深入探讨其在HACE延缓DN发生发展中的具体机制。

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