桦褐孔菌皂苷的优化提取及其对HepG2 细胞脂肪堆积的清除作用

张 蕾， 张 琨， 王德利， 任小红，崔 娜， 刘 洋，赵庭勋

(1.牡丹江师范学院生命科学与技术学院制药工程系，黑龙江 牡丹江157011；2.吉林大学第二医院研究中心，吉林 长春 130041 ；3. 吉林大学生命科学学院生物实验示范中心，吉林 长春 130012；4. 中国科学院上海药物研究所药物制剂中心，上海 201210)

非酒精性脂肪肝病( non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)经常伴随中心性肥胖、高血脂症、胰岛素抵抗以及糖耐量异常等代谢综合征，严重危害人类健康[1-4]。近年来，对NAFLD的研究很多，但其发病机制尚不清楚。因此，寻找有效的治疗NAFLD药物非常重要。桦褐孔菌 (Phaeoporusobliquus)又称白桦茸，其化学成分包括多糖类化合物、芳香物质、多酚类化合物和三萜类化合物等物质[5-8]，具有重要的药用价值。从16世纪至今，桦褐孔菌一直被作为一种民间药物，在防治糖尿病、高血压、艾滋病以及抗癌和抗衰老等方面具有显著的效果，但不良反应较多[9-10]，目前有关桦褐孔菌对NAFLD的治疗作用尚未见相关研究报道。本实验模拟临床上NAFLD的病理特点，优化提取桦褐孔菌皂苷提取物，并将其作用于HepG2细胞，从细胞水平评价桦褐孔菌皂苷提取物对细胞脂质堆积的作用以及对细胞中甘油三酯(TG)水平的影响，从而探讨其在防治NAFLD方面的药用价值，为开发预防和治疗NAFLD的药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

HepG2 细胞由哈尔滨工业大学赠送，为实验室传代保存。桦褐孔菌购于黑龙江省绥芬河市。MTT溶液、TG试剂盒、油酸、油红O公司和细胞裂解液购于上海源叶生物科技有限公司，DMEM细胞培养基、血清和胰蛋白酶购于美国Hylone公司，乙醇和异丙醇购于北京化工厂。粉碎机(戴声设备有限公司)，超声波清洗机(杭州法兰特超声波科技有限公司)，电子天平(QUINTIX224-1CN Sartorius，R210，德国赛多利斯公司)，旋转蒸发仪(R300，瑞士BUCHI有限公司)，电子显微成像系统(CX31，日本Olympus公司)，酶标仪(美国Synergy HTX BioTek公司)，静音混合器(MT-360，中国其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2 桦褐孔菌皂苷的提取和总皂苷水平测定

将桦褐孔菌粉末过筛，取更细腻的粉末后准确称取5 g，采用30%乙醇将其溶解，根据设定的时间、温度、料液比和超声波功率处理，用80%乙醇沉淀多糖，4 000 r·min-1离心5 min，取上清液，减压浓缩至浸膏后水浴蒸干，30 mL去离子水溶解，依次用等体积正丁醇溶液萃取3～5次，利用旋转蒸发仪将提取的正丁醇层萃取液进行减压浓缩并蒸干处理后，得粗品桦褐孔菌总皂苷。参照文献[11-12]测定皂苷标准曲线法测定总皂苷水平。

1.3 单因素试验检测桦褐孔菌皂苷提取量的影响因素

设计桦褐孔菌皂苷提取物单因素实验的变量条件分别为提取时间、提取温度、料液比和超声频率，从而确定正交实验中各因素的水平。

1.4 正交试验优化提取工艺

在单因素试验基础上，利用正交试验表L9(34)进行四因素三水平正交实验，各因素和水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.5 MTT法检测HepG2细胞存活率

复苏HepG2细胞，将实验室冻存的HepG2细胞从液氮罐中取出，迅速置于37 ℃水浴锅中融化，用PBS清洗后，1 000 r·min-1离心去上清后将其置于含10% FBS的DMEM培养基中，培养条件：37 ℃、5% CO2和饱和湿度。将培养好的HepG2细胞每隔1 d进行传代培养，并将处于对数生长期细胞转移至含10% FBS的高糖型DMEM培养基备用。

将处于对数生长期HepG2细胞接种于96 孔细胞培养板中，利用细胞计数板计数，使每孔细胞的接种量达到104个，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。设对照组和给药组，给药组桦褐孔菌皂苷提取物终浓度分别为 60.000、6.000、0.600、0.060和0.006 g·L-1，每组设置3个平行孔，继续培养24 h后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，继续在37 ℃、 5% CO2培养箱中培养4 h后取出，缓慢吸去培养液，每孔加入100 μL DMSO，振荡5～10 min，于酶标仪490 nm处测定吸光度(A)值。根据测得的A值计算细胞存活率，选择细胞存活率达到70%以上时的桦褐孔菌皂苷浓度为安全浓度。细胞存活率= 给药组A值/对照组A值×100%。

1.6 细胞中TG清除率的检测

给药组桦褐孔菌皂苷提取物终浓度分别为0.006、0.060和0.600 g·L-1，不给药无细胞的空白孔为对照组，不给药含HepG2细胞孔为模型组。细胞中TG水平检测参照文献[13-15]对细胞中TG水平的测量法。TG清除率 = (不给药组A值-给药组A值) /不给药组A值×100%，A值为酶标仪在500 nm处的读数。

1.7 油红O染色检测各组细胞形态表现

油红O工作液配制：首先配制0.5%油红O储备液，将油红O粉末溶于异丙醇中，储备液用蒸馏水稀释后过滤2次，至液体澄清为止[16-17]。

将 HepG2细胞接种于24孔板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h后取出，分为对照组，模型组，低、中和高浓度(0.600、0.060和0.006 g·L-1) 桦褐孔菌皂苷组，各组所加培养基同“1.6”中所述。孵育24 h后用油红O工作液染色30 min，蒸馏水反复吹洗2次后，在倒置显微镜下观察染色效果。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 桦褐孔菌皂苷类物质提取的单因素实验

2.1.1 桦褐孔菌皂苷的标准曲线 配制人参皂苷标准品浓度分别为10、20、30、40、50、60和70 mg·L-1，标准曲线方程为y=0.006x+0.013，R2=0.999。

2.1.2 提取时间、超声功率、提取温度和料液比时桦褐孔菌皂苷类物质的提取率 提取时间为30 min、超声功率为30%、提取温度为40℃、料液比达到1∶20时桦褐孔菌皂苷提取率最大(图1)。因此，选择提取时间为20～40 min 、超声功率为30%～50%、提取温度为30℃～50℃、料液比为1∶10～1∶20为进一步优化条件。

A:Extraction time;B: Ultrasonic power; C:Extraction temperature; D:Solid-liquid ratio.

2.2 桦褐孔菌皂苷类物质提取的正交优化实验

2.2.1 皂苷提取正交实验设计和结果 通过正交实验确定桦褐孔菌皂苷的最佳提取工艺。正交实验结果表明：影响桦褐孔菌皂苷类物质提取量的因素主次顺序为超声功率>提取温度>提取时间>料液比(D>C>A>B)，即超声功率和超声温度对桦褐孔菌皂苷提取效果影响相对较大，最佳超声功率和提取温度时桦褐孔菌皂苷提取率最大；与提取时间和料液比比较，最佳超声功率和提取温度时桦褐孔菌总皂苷提取率达到最大(P<0.05)。综合以上条件，桦褐孔菌皂苷的最佳提取条件为：A2B2C1D2，即按1∶15 的料液比在温度 30℃下提取 30 min，超声功率为50%，乙醇浓度为30%。见表2。

2.2.2 实验各因素显著性分析 对正交实验结果进行方差分析，各因素对皂苷提取率影响的结果表明：提取时间、超声功率、提取温度和料液比对提取率有影响。见表2。

表2 桦褐孔菌皂苷正交实验结果

2.3 各组HepG2细胞存活率

随着桦褐孔菌皂苷浓度的增加，HepG2细胞存活率降低，说明桦褐孔菌皂苷对细胞有一定的毒害作用。当浓度小于0.600 g·L-1时，细胞存活率>70%，对细胞毒害作用相对较小，为了研究桦褐孔菌皂苷对细胞脂肪堆积的影响，将桦褐孔菌皂苷给药浓度设定为0.006～0.600 g·L-1。见表3。

表3 各组HepG2细胞存活率

2.4 各组 HepG2 细胞中TG清除率

为减少高浓度桦褐孔菌皂苷对细胞的毒性作用，选择小于0.600 g·L-1浓度作为实验浓度。 与对照组比较，模型组HepG2 细胞中TG水平明显升高(P<0. 05)，表明 HepG2 细胞脂肪堆积模型成功建立[14]。与模型组比较，0.060 g·L-1桦褐孔菌皂苷组HepG2细胞中TG 水平升高(P<0.05)；与模型组比较，0.600 g·L-1桦褐孔菌皂苷组HepG2 细胞中TG 水平升高(P<0.01)，并随着桦褐孔菌皂苷浓度升高，TG 清除率也逐渐升高，具有剂量依赖性，其中0.600 g·L-1桦褐孔菌皂苷组细胞中TG 清除率最高，达到32.22%。见表4。

表4 各组HepG2 细胞中TG清除率

GroupConcentration(g·L-1)Level of TG (m/mg)Clearance rateof TG(η/%)Control 00.462±0.5630Model0 1.746±0.631*0Treat-ment0.0061.663±0.4804.700.0601.482±0.437△15.120.6001.189±0.546△△32.22

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05,△△P<0.01 compared with model group.

2.5 各组HepG2中脂质堆积情况 与对照组比较，模型组细胞中出现大量的红色脂滴，同时伴随相互融合现象，说明成功地建立细胞脂肪堆积模型，并随着桦褐孔菌皂苷浓度的升高，HepG2细胞中红色脂滴数目逐渐减少，且脂滴体积变小。在各浓度桦褐孔菌皂苷组中，0.006 g·L-1桦褐孔菌皂苷组的作用效果不明显; 与模型组比较，0.060 g·L-1桦褐孔菌皂苷组细胞中脂质堆积情况稍有改善，细胞中脂质相互融合的现象明显减轻; 0.600 g·L-1桦褐孔菌皂苷组细胞中脂质堆积现象明显减轻，并发现脂滴数目明显减少。见图3(插页四)。

3 讨 论

NAFLD发病率呈现逐年升高的趋势，已经成为一种严重危害人类健康的世界性疾病。NAFLD 是导致肝功能异常的主要原因，肝脏脂肪积聚是其典型特征，但并不能采用单一机制解释其发病的机制。TG是NAFLD患者肝脏中蓄积的主要脂质，是体内TG合成与转化失衡的结果[18]。

因为游离脂肪酸中含油酸水平最高，所以选择油酸来诱导建立肝细胞脂肪堆积模型，符合NAFLD形成的病理生理过程，杨林辉等[19]采用1 mmol·L-1油酸诱导细胞 24 h 后，成功建立肝细胞脂肪堆积模型。采用上述诱导方法建立HepG2细胞脂肪堆积模型，可使细胞中TG大量堆积，但细胞损伤不严重，细胞状态良好。因此，本课题组选取1 mmol·L-1油酸诱导HepG2细胞的脂肪堆积，并可产生氧化应激状态。在单因素实验的基础上通过正交实验得到桦褐孔菌皂苷的最佳提取条件(A2B2C1D2)，将提取的桦褐孔菌皂苷提取物作用于HepG2细胞，并选择NAFLD常规检测指标评价桦褐孔菌皂苷对细胞中脂肪堆积的作用效果。本研究结果显示：桦褐孔菌皂苷提取物在质量浓度0.600 g·L-1时均对HepG2细胞增殖无明显影响，0.600 g·L-1桦褐孔菌皂苷对油酸诱导的HepG2细胞脂肪累积具有促进作用，随着浓度的增加可明显降低细胞中TG的累积，量效关系明显。与模型组比较，0.600 g·L-1桦褐孔菌皂苷组HepG2细胞中TG水平降低，细胞中TG清除率可达 32.22%，并且具有剂量依赖性。油红O染色实验结果显示：3个浓度桦褐孔菌皂苷提取物均可以改善细胞内脂质堆积的现象，其中0.600 g·L-1桦褐孔菌皂苷组中脂滴数目明显减少，说明细胞中脂质堆积现象明显减轻，研究者[17,20-21]在探讨泽泻汤对油酸诱导HepG2细胞脂肪堆积的抑制作用实验中也发现泽泻汤可以改善细胞中脂质堆积现象，这与本研究结果一致。本研究结果表明：桦褐孔菌皂苷提取物具有一定的清除细胞中脂肪堆积的作用，本文作者推测其在脂肪肝治疗方面也具有潜在的药用价值，但目前桦褐孔菌皂苷的降脂机制尚未明确，具体的降脂机制还有待于进一步研究。

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