结直肠癌组织中B7-H1和B7-H4表达与Foxp3+调节性T细胞浸润的关联性

王 丹，李怡飞，历 春，董志恒，董 营，盖晓东

(1.北华大学基础医学院病理教研室,吉林 吉林 132013；2.吉林省吉林市中心医院骨关节科，吉林 吉林 132011)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。由于外科技术的进步、放疗和化疗药物的使用，临床上CRC患者的预后有明显的改善，但仍有复发和转移的危险。因此，有必要进一步探讨CRC免疫逃逸机制从而开发新的CRC治疗方法[1]。抗原提呈细胞调控T细胞免疫是通过B7家族中的一类共激活分子完成的。B7分子与T细胞表面相应受体结合后，在抗原特异性免疫应答过程中发挥正性或负性调控作用[2]。B7-H1是B7 家族中的负性调控分子，其与受体 PD-1的相互作用在肿瘤免疫应答中发挥重要作用[3]。B7-H4是B7家族中新发现的成员，其在卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌和肺癌等多种肿瘤组织中表达，而在正常组织中几乎检测不到[4]。上述研究结果提示：B7-H1和B7-H4可能作为免疫反应负调节分子，通过不同途径在抗肿瘤免疫中发挥重要的作用[5]。调节性T细胞(Treg)是一个独特的CD4+辅助性T细胞亚群，其特点是CD4+及CD25+阳性表达。叉头转录因子(Foxp3+)是调节T细胞发育及其功能效应的关键因素，也是Treg的特异且可靠的标记[6]。Treg在许多人类肿瘤组织中均有表达，与肿瘤免疫逃避机制有密切关联[7]。研究者[8-9]发现：B7-H1与肿瘤微环境中Treg表达量增加相关，B7-H4对Treg功能具有调控作用。抑制性B7分子在肿瘤细胞中的表达与Treg浸润的相关性目前尚无研究报道。本研究选择56 例CRC患者的癌组织作为研究对象，检测B7-H1和B7-H4在CRC组织中的表达及Treg在CRC组织中的浸润性，并且探讨二者之间的相关性，为CRC的诊断和预后判断提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2007—2009年北华大学附属医院手术切除的经病理诊断为CRC患者的结肠癌标本56例，均取癌组织和癌旁正常组织(大于肿瘤边缘5 cm处)。其中男性患者35例，女性患者21例，年龄34～79岁。24例患者有淋巴结转移，32例患者无淋巴结转移。所有患者均无术前放疗或化疗。根据国际癌症控制联盟(UICC 2002)标准进行病理分期。

1.2 免疫组织化学法检测CRC组织和癌旁正常组织中B7-H1和B7-H4的表达 将OCT胶包埋好的组织标本采用恒冷冰冻切片机(Leica CM1900，德国莱卡公司)切成5 μm厚度的连续切片，室温干燥后以多聚甲醛固定，PBS冲洗。以下步骤按说明书操作：0.3%过氧化氢室温下阻断内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，山羊血清封闭。切片分别滴加抗B7-H1抗体(1∶30稀释)、抗B7-H4抗体(1∶500稀释)和抗Foxp3+抗体(1∶100稀释)，4℃过夜。PBS洗涤切片,以生物素标记的二抗处理，链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物孵育，DAB显色，切片脱水，清洗和封片。

1.3 结果判定标准 采用双盲法评估所有载玻片。高倍镜下(×400)随机取10个视野，每个视野计数100个细胞，以细胞质中有黄至棕褐色颗粒染色者为B7-H1和B7-H4染色阳性。按阳性细胞数计分：0分(无阳性肿瘤细胞)，1分(阳性肿瘤细胞率<10%)，2分(10%≤阳性肿瘤细胞率≤50%)，3分(阳性肿瘤细胞率>50%)。按染色强度计分：未着色或与背景一致为0分，浅黄色为1分，黄褐色为2分，褐色为3分。2项指标的乘积分数小于4归类为低表达，其余为高表达。

根据随机选择的高倍视野(HPF)中阳性染色细胞的百分率来评估Treg细胞的表达情况，以细胞核中有黄至棕褐色颗粒者为判定Treg细胞阳性的标准。每张切片随机选择10个高倍视野 (×400) 计数阳性细胞数,计算Treg阳性细胞数平均值。Treg阳性细胞数平均值≤20为低浸润，Treg阳性细胞数平均值>20 为高浸润。

2 结 果

2.1 CRC患者癌组织和癌旁正常组织中B7-H1和B7-H4的表达 B7-H1和B7-H4阳性表达呈棕黄色颗粒，主要定位于肿瘤细胞的细胞质和细胞膜(图1A和B，见插页四)；癌旁正常组织中其为阴性表达(图1C和D，见插页四)或在肠腺上皮细胞质中呈弱阳性表达。56例癌旁正常组织中B7-H1呈弱阳性表达5例(8.93%)，B7-H4呈弱阳性表达4例(7.14%)。CRC组织中B7-H1高表达27例，高表达率为48.21%；B7-H4高表达27例，高表达率为48.21%。CRC组织中B7-H1阳性表达率为89.29%，明显高于癌旁正常组织(8.93%)(χ2= 72.34，P<0.01)；CRC组织中B7-H4阳性表达率为91.07%，明显高于癌旁正常组织(7.14%)(χ2=78.92，P<0.01)。

2.2 CRC患者癌组织和癌旁正常组织中Treg阳性细胞数 Treg 细胞形态完整,结构清晰， DAB 显色核呈棕黄色， 散在分布于CRC组织中， 尤其在CRC组织和癌旁正常组织交界处分布密集。本研究56例 CRC 组织中均有Treg表达,其阳性细胞数(23.5±7.0 )明显高于癌旁正常组织(0.7±1.9)(P<0.01)。见图1E和F(插页四)。

2.3 不同临床病理特征CRC患者癌组织中B7-H1、B7-H4和Treg的表达 B7-H1表达频数与肿瘤浸润深度有关联(P<0.01)，淋巴结转移阳性者CRC组织中B7-H1高表达频数高于淋巴结转移阴性者(P<0.01)，Duke’s分期C+D者B7-H1高表达频数高于Duke’s分期A+B者(P<0.01)。B7-H1表达频数与患者年龄、性别、肿瘤位置和分化程度无关联(P> 0.05)。见表1。

B7-H4的表达频数与肿瘤浸润深度有关联(P<0.05)，淋巴结转移阳性者CRC组织中B7-H4高表达频数高于转移阴性者(P<0.05)。B7-H4的表达频数与患者性别、年龄、肿瘤位置、分化程度和Duke’s分期无关联(P> 0.05)。Treg阳性细胞数与肿瘤分化程度有关联(P<0.01)，淋巴结转移阳性者CRC组织中Treg阳性细胞数高于转移阴性者(P<0.01)。Treg阳性细胞数与患者性别、年龄、肿瘤位置、分化程度和Duke’s分期无关联(P> 0.05)。见表1。

2.4 CRC患者癌组织中B7-H1、B7-H4表达与Treg浸润程度的关系 本研究56例CRC组织中Treg分布情况：Treg低浸润30例，Treg高浸润26例。Treg高浸润组B7-H1和B7-H4的高表达频数明显高于低浸润组，CRC组织中B7-H1表达与Treg有相关性(P<0.01，Cramer’s=0.463)，CRC组织中B7-H4表达与Treg有相关性(P<0.05，Cramer’s=0.320)。见表2。

3 讨 论

肿瘤细胞可以被抗原特异性T细胞免疫应答识别和攻击。B7家族在抗原特异性T细胞介导的正性和负性免疫调控作用中起核心作用。负性共刺激分子B7表达上调能通过抑制T细胞功能负性调控 T 细胞的免疫应答，从而促进肿瘤免疫逃避[10]。本研究结果显示：负性共刺激分子 B7-H1 和 B7-H4在CRC组织中均呈异常高表达，并且 B7-H1在CRC组织中的高表达与浸润深度、淋巴结是否转移及Duke’s分期有关联；B7-H4高表达频数随着肿瘤浸润深度、淋巴结转移也出现出升高趋势。但 B7-H1 和 B7-H4与CRC患者其他病理特征 (如性别、年龄、部位和分化程度等) 无关联，提示 B7-H1和B7-H4 在CRC的转移和进展中起重要作用，但CRC进程的具体机制尚需进一步探讨。

表1 不同临床病理特征CRC患者癌组织中B7-H1、B7-H4的表达频数和Treg阳性细胞数

Tab.1 Expression frequencies of B7-H1 and B7-H4 and number of Treg positive expression cells in cancer tissue of CRC patients with different clinicopathological features

Clinicopathological featurenExpression frequency of B7-H1LowHighPExpression frequency of B7-H4LowHighPNo.of Treg positive expression cellsPGender Men Women3521191016110.628 821814130.112 221.8±8.018.7±6.20.312 7Age(year) ≤60 >602630131613140.803 4151411160.410 227.1±8.119.9±5.80.522 9Tumor position Colon Rectum2333101913140.299 014159180.256 117.7±5.622.2±6.50.067 2Differentiation degree High Moderate and low2724161011140.209 715912150.197 318.2±4.325.8±6.50.002 9 Infiltration depth T1+T2 T3+T4183815143240.003 014154230.007 09.7±8.821.0±7.50.648 5Lymphnode metastasis Negative Positive322422710170.003 421811160.016 718.9±7.524.4±6.40.006 5Duke’s stage A+B C+D30262189180.003 4191011160.063 219.3±7.623.3±7.00.162 8

表2 CRC患者癌组织中B7-H1和B7-H4表达与Treg浸润的关系

Treg 通过在肿瘤微环境中发挥肿瘤特异性免疫抑制功能而促进肿瘤生长，对肿瘤的发生发展有重要意义[11-12]。本研究探讨了CRC患者肿瘤组织中Treg细胞分布情况,发现肿瘤组织中Treg表达水平明显高于相应的癌旁正常组织。对Treg浸润与临床病理特征关系分析结果显示: 中-低分化患者CRC组织中Treg阳性细胞数明显高于高分化者,肿瘤的异型性越大，Treg阳性细胞数越多,恶性程度越高。这些结果提示Treg在CRC肿瘤免疫中有重要作用，Treg 可能影响了肿瘤的分化， Treg的高表达可能是影响CRC预后不良的因素之一。

目前，在肿瘤微环境中如何趋化Treg细胞并维持 Treg细胞的生存和功能机制尚不清楚。负性共刺激分子B7-H1和B7-H4能增加肿瘤特异性抗原激活的T细胞凋亡、抑制特异性T细胞免疫应答、减少白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素10(IL-10)和干扰素γ(IFN-γ)的分泌，以及阻碍细胞周期的进程[13-15]。研究[16-17]显示：B7-H1在调节诱导性Treg中起关键作用，通过抑制活化T细胞中的细胞外信号调节蛋白激酶、C-Jun N 端激酶、丝裂原激活蛋白激酶P38和AKT信号通路，以影响T细胞的增殖[18]。体内实验结果显示：抑制B7-H1信号通路可抑制肿瘤特异性抗原激活的Treg生成。Treg可诱导人卵巢癌细胞表达B7-H4，从而抑制抗原提呈细胞的活性[19]，表明B7-H4对Treg功能具有调控作用[20]。本研究结果显示：Treg高浸润组B7-H1和B7-H4高表达频数明显高于低浸润组，B7-H1和B7-H4在CRC组织中的表达与Treg有关联性。 随着CRC的发生发展、浸润及转移，肿瘤细胞增殖活性呈递增趋势。

综上所述，CRC患者癌组织中B7-H1、B7-H4和Treg高表达可能促进肿瘤的浸润和转移，并在CRC的发生发展中起抑制作用，B7-H1和B7-H4表达可能是诱导机体产生Foxp3+Treg的机制之一。因此，联合检测B7-H1、B7-H4和Treg的表达对CRC预后评估有较高的临床参考价值。

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