CC趋化因子受体6在人唾液腺腺样囊性癌组织中的表达及其临床意义

马晓周，刘麒麟，尹唯凰，王 越，于 阳，杨 刚，于子莹

(吉林大学口腔医院口腔颌面外科 吉林省牙发育及颌骨重塑与再生实验室，吉林 长春130021)

腺样囊性癌是唾液腺常见的恶性肿瘤之一，易沿神经侵袭生长，常导致患者在患病早期就出现疼痛、面瘫和麻木等症状[1]，近年来唾液腺腺样囊性癌沿神经侵袭机制的研究已成为学者关注的热点。CC趋化因子受体6(CC chemokine receptor 6,CCR6)是CC趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20， CCL20)的受体，是高度保守的G蛋白偶联七次跨膜受体。CCR6/CCL20生物轴在胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌和血液系统恶性肿瘤的器官特异性转移中发挥着重要的驱动、导向和定位作用。目前，国内外关于CCR6/CCL20生物轴在唾液腺腺样囊性癌嗜神经侵袭中的作用机制研究尚未见报道。本研究通过检测CCR6在人唾液腺腺样囊性癌组织中的表达，分析其与涎腺腺样囊性癌病理分型的关系，并探讨其在涎腺腺样囊性癌神经侵袭中可能的作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2013—2016年在吉林大学口腔医院诊断的唾液腺腺样囊性癌患者30例，其中男性5例，女性25例，年龄25～74岁，平均年龄53岁。30例患者均经病理证实，其中颌下腺来源7例，腮腺来源7例，舌下腺来源16例；病理标本均连续切片，HE染色，每例标本选取不同部位切片5张，镜下观察若发现1处或1处以上癌细胞沿神经束周围或神经束间浸润性生长则为有神经侵袭，其中神经侵袭组18例，非神经侵袭组12例；按照2005年WHO关于腺样囊性癌的病理分类标准，30例唾液腺腺样囊性癌病理标本中筛状型12例，管状型10例，实性型8例。收集2016—2017年在吉林大学口腔医院手术获取的22例正常人唾液腺标本作为正常对照组，其中腮腺10例，颌下腺8例，舌下腺4例；所有标本均经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后连续切片，HE染色。

1.2 主要试剂兔抗人CCR6购自北京博奥森公司，工作浓度1∶100；兔源性超敏二步法免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥公司，该试剂盒中包含试剂：3%H2O2，试剂1(聚合物辅助剂)，试剂2(辣根酶标记抗兔IgG聚合物)；浓缩型DAB试剂盒购自北京中杉金桥公司，该试剂盒中包含试剂：浓缩DAB溶液(20×)，DAB底物液；EDTA抗原修复液(50×)购自上海碧云天生物技术研究所。

1.3 免疫组织化学染色脱蜡、水化组织切片；用EDTA热修复10 min(具体步骤参照说明书)；3%H2O2去离子水孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶；PBS冲洗，2 min×3次；滴加一抗，4℃孵育过夜，PBS冲洗，2 min×3次；滴加试剂1，37℃孵育10 min，PBS冲洗，2 min×3次；滴加试剂2，37℃孵育10 min，PBS冲洗，2 min×3次；应用DAB溶液显色；自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。实验中以PBS代替一抗作阴性对照组。采用Olympus BX51T显微镜进行观察、拍照。

1.4 结果判定标准阳性细胞数量积分：无阳性细胞为0分, 阳性细胞≤25% 为1 分,26% ～50% 为2 分,51% ～75% 为3 分,>75% 为4分；着色强度积分：无色为0分, 淡黄色为1 分,棕黄色为2 分, 棕褐色为3 分。着色强度积分与数量积分相加: 0分为(-), 2和3 分为(±), 4和5分为(+), 6和7 分为(++), 其中(+) 和(++) 为阳性，(-)和(±)为阴性。

1.5 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。CCR6阳性表达率以百分率(%)表示，不同组间及不同临床变量(性别、年龄、病理分级和嗜神经现象)患者唾液腺腺样囊性癌组织中CCR6阳性表达率比较采用Fisher确切概率法。以α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 唾液腺腺样囊性癌患者癌组织和正常人涎腺组织中CCR6表达免疫组织化学染色显示：CCR6在唾液腺腺样囊性癌细胞膜和细胞质中呈弥漫性黄棕色表达(图1A，见插页四)，在正常人唾液腺组织中呈阴性表达(图1B，见插页四)。30例唾液腺腺样囊性癌患者癌组织中有22例CCR6呈阳性表达，阳性表达率为73.33% ；22例正常人涎腺组织中CCR6均呈阴性表达，阳性表达率为0%；2组不同组织中CCR6阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 不同临床病理特征唾液腺腺样囊性癌患者癌组织中CCR6阳性表达率18例神经侵袭组患者癌组织CCR6呈阳性表达17例(图1C，见插页四)，1例呈阴性表达，CCR6阳性表达率为94.44%；12例非神经侵袭组患者癌组织CCR6阳性表达5例(图1D，见插页四)，阴性表达7例，CCR6阳性表达率为41.67%；神经侵袭组患者癌组织中CCR6阳性表达率高于非神经侵袭组(P<0.05)。筛状型和管状型唾液腺腺样囊性癌组织中CCR6主要表达于筛状结构和管状结构中，阳性表达率分别为75.00%和90.00%，实性型唾液腺腺样囊性癌组织中CCR6主要表达于肿瘤细胞团中，阳性表达率为50%，三者间比较差异无统计学意义(P>0.05)。不同年龄和性别唾液腺腺样囊性癌患者癌组织中CCR6阳性表达率比较差异均统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同临床病理特征唾液腺腺样囊性癌患者癌组织中CCR6阳性表达率

3 讨 论

腺样囊性癌是唾液腺最常见的恶性肿瘤之一，具有神经侵袭性的特征。由于唾液腺腺样囊性癌常沿神经浸润生长和转移，常规手术、放疗和化疗等治疗效果不能令人满意，30%～40%的患者在术后2年复发，因此寻找腺样囊性癌基因治疗有效靶点对腺样囊性癌的诊治具有极其重要的意义[2]。

趋化因子是一组可溶性的相对分子质量为8 000～14 000的小分子蛋白，与其同源性G蛋白偶联受体结合后可引发一系列细胞内反应，从而促使细胞发生有向性迁移或趋化行为[3]。趋化因子受体可分为4类[4]：CXC趋化因子受体(CXCR)、CC趋化因子受体(CCR)、CX3C趋化因子受体(CX3CR)和XC趋化因子受体(XCR)。趋化因子及其受体在多种恶性肿瘤中呈高表达，尤其是具有高转移潜能的细胞中，因与肿瘤细胞增殖、转移关系密切而成为目前研究热点，也为抗肿瘤侵袭转移的基因靶向治疗提供了全新的研究方向。王堃等[5]研究发现：CXCR4在卵巢癌细胞中高表达，其表达的上调促进上皮性卵巢癌细胞的转移和侵袭；在唾液腺腺样囊性癌嗜神经侵袭机制的研究中，有研究[6-7]证实：CCR5在唾液腺腺样囊性癌标本中呈阳性表达，且CCR5/CCL5生物轴在涎腺腺样囊性癌嗜神经侵袭中发挥着重要作用；杜贵霞[8]研究发现：CXCL12和CXCR4蛋白在具有神经侵袭现象的人唾液腺腺样囊性癌组织中的阳性表达率高于不具有神经侵袭现象者，提示该生物轴可能在腺样囊性癌嗜神经侵袭中发挥着重要作用。目前研究[9]显示：CCL20是CCR6的唯一配体。Andre等[10]研究发现：乳腺癌组织中有CCR6的表达，且CCR6高表达与乳腺癌的胸膜转移有关联；也有学者[11-12]对乳腺癌组织中趋化因子受体的表达情况进行研究发现：乳腺癌组织中有CCR5和CCR6等的表达，且其表达情况与癌细胞是否转移有关。Lu 等[13]证实：CCR6高表达于喉癌细胞中，CCL20可以明显促进人喉癌细胞株的增殖和迁移。研究[14-20]显示：CCR6对肝癌、胃癌、大肠癌和结肠癌的转移和增殖具有促进作用 。

本研究结果显示：30例唾液腺腺样囊性癌患者癌组织中CCR6的阳性表达率明显高于正常唾液腺组织，在不同病理分型、年龄和性别患者癌组织中CCR6的阳性表达率比较差异无统计学意义，神经侵袭组唾液腺腺样囊性癌患者癌组织中CCR6阳性表达率高于非神经侵袭组。本文作者推测：可能是周围神经释放CCR6的配体CCL20，与腺样囊性癌细胞的CCR6结合后，启动癌细胞内运动和侵袭的信号通路，促进其向周围神经迁移和侵袭。本研究为后续人唾液腺腺样囊性癌的体外研究提供了理论依据。

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