解偶联蛋白嵌合体及突变体的构建方法

王 超，刘 洋，段秀梅，田 庄，王银萍，沃夫冈·格莱尔，付 彤

（1.吉林大学第一医院病理诊断中心，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院眼科，吉林 长春 130021；3.奥地利格拉茨医科大学分子生物学与生物化学研究所，奥地利 格拉茨A-8010；4.吉林大学第一医院乳腺外科，吉林 长春 130021）

细胞内的钙离子（Ca2＋）作为第二信使可调控细胞内很多生理活动，如基因转录、肌肉收缩、细胞增殖和细胞死亡等。而且，线粒体摄取Ca2＋已被证实对氧化磷酸化速率[1]、胞浆Ca2＋信号时空调控[2]、库池调节性 Ca2＋输入通道的维持[3]以及凋亡[4]起着非常关键的作用。线粒体Ca2＋积存现象及其特征和生理功能已经有学者详实报道[5－6]。然而，Graier等[7－8]实验数据显示：解偶联蛋白2和3（uncoupling protein 2and uncoupling protein 3，UCP2，UCP3）定位于线粒体两内膜间，属于线粒体Ca2＋输送体超家族成员，是线粒体Ca2＋单一输送体必要组成部分，并解释解偶联蛋白（UCP）中特定结构决定簇对线粒体Ca2＋摄取的影响取决于钙离子供应的来源、方式和强度。尽管UCP2、UCP 3作为通道蛋白在线粒体Ca2＋积存现象中发挥的作用机制还不十分清楚，但其提供了唯一深入阐释潜在机制和生理病理作用的可能性。已证明UCP2、UCP3作为线粒体内膜间第二环状结构（intermembrane Loop 2，IML2）的整体似乎在线粒体摄取Ca2＋机制的功能性上发挥中枢作用[7]，令人感兴趣的是UCP家族中相同的结构域能否执行相同或相近的功能，如UCP1不会影响线粒体Ca2＋摄取能力。反之，当 UCP2、UCP3的IML2结构域被UCP1对应的结构区域置换，那么UCP2、UCP3是否丧失这种参与Ca2＋运输的活性尚需进一步研究。为探讨UCP2和UCP3嵌合体及UCP3IML2中第167位精氨酸（R）定向突变为甘氨酸（G）或第171和172精氨酸（R）和谷氨酸（E）定向突变为2个甘氨酸（GG）后，是否在线粒体Ca2＋摄取不同时相发挥关键作用，本研究首次报道利用重叠延伸拼接（splicing overlap extension，SOE）PCR技术和定向突变技术构建一组UCPs突变体：UCP1嵌合体即其IML2基因被UCP2蛋白的相应结构域基因置换，命名为UCP1UCP2；UCP2和UCP3的嵌合体即UCP2和UCP3的IML2基因被相对应的UCP1结构域基因替代，命名UCP2UCP1和UCP3UCP1；克隆突变1个氨基酸UCP3R167G和突变2个氨基酸UCP3RE171/172GG的重组质粒。本研究旨在通过制备UCPs嵌合体和突变体方法的介绍，为探讨其他蛋白结构功能域的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试 剂 限制性内切酶（EcoRⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ）、T4DNA连接酶、DNA marker、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System、Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System均购自Promega公司；Ex Taq DNA Polymerase购自TakaRa 公 司；QuikChange ○RXL Site-Directed Mutagenesis Kit购自美国Stratagene公司；Original TA Cloning○RKit，pcDNA3.1Plasmid购自 Invitrogen公司；重 组 质粒 pcDNA-UCP1/UCP2/UCP3由格拉茨医科大学Michael Trenker博士惠赠。

1.2 UCPs嵌合体引物 根据GenBank中UCPs mRNA 序 列（UCP1：NM ＿021833.3；UCP2：NM＿003355.2；UCP3：NM＿003356.2）设计引物序列。

UCP1UCP2： ①5′-AAGAATTCCAGTCTCTGAGTGAAGATGG-3′； ② 5′-TCAAGCCTTCCTCTCGGGCAATGGTCTTGTACGCATTATAAGTCCCCG-3′； ③ 5′-TAATGCGTACAAGACCATTGCCCGAGAGGAAGGCTTGACGGGTCTTTG-3′； ④5′-CCGCTCGAGTTATGTGGCA CAGTCCATAG-3′。

UCP2UCP1：①5′-AAGGTACCATCAGCATCATGGTTGGGTTCAAGG-3′；②5′-GGAACCCTTCGGTTGTTGCTATTATTCTGTAGGCATTGACGGTGCTTT-3′；③5′-CAATGCCTACAGAATAATAGCAACAACCGAAGGGTTCCGGGGCCTCTG-3′； ④5′-AACTCGAGTCAGAAGGGAGCCTCTCGGGAAGTG-3′。

UCP3UCP1：①5′-AAGGTACCCCAGGACTATGGTTGGACTGAAGCC-3′；②5′-TGACTCCTTCGGTTGTTGCTATTATTCTGTAGGCGTCCATAGTCCCGC-3′；③5′-GGACGCCTACAGAATAATAGCAACAACCGAAGGAGTCAGGGGCCTGTG-3′；④5′-AACTCGAGTCAAAACGGTGATTCCCGTAACATC-3′。

每组设计2对引物。克隆引物对①④，分别取自 UCP1、UCP2、UCP3的 CDS 5′－和3′－编码区序列，下划线者为酶切位点。嵌合引物对②③，分别取自UCP1、UCP2、UCP3的IML2两侧的序列，斜体部分为互补的IML2序列，嵌合引物用于将2个靶片段拼接起来，即UCP1的IML2氨基酸编码序列162RIIATTE168被UCP2的KTIAREE置换后成 UCP1UCP2嵌合体，UCP2的IML2氨基酸编码序列164KTIAREE170被UCP1的RIIATTE置换后成 UCP2UCP1嵌合体，UCP3的IML2氨基酸编码序列167RTIAREE 173被UCP1的RIIATTE置换后成UCP1UCP2嵌合体。

1.3 UCP3定向突变引物 根据pcDNA-UCP3重组质粒序列，用Srtatagene公司网站QuikChange引物设计程序软件，设计突变引物序列。UCP3R167G： ⑤ 5′-CTATGGACGCCTACGGAACCATCGCCAGG-3′；⑥5′-CCTGGCGATGGTTCCGTAGGCGTCCATAG-3′。加黑碱基是定向突变的碱基，从UCP3CDS序列起始密码子至499位点碱基A→G，使167位氨基酸R突变为G。UCP3RE171/172GG：⑦5′－CAGAACCATCGCCGGG

GGGGAAGGAGTCAGG-3′； ⑧ 5′-CCTGACTCCTTCCCCCCCGGCGATGGTTCTG-3′。 加 黑 碱基是定向突变的碱基，从UCP3CDS序列起始密码子至511、515位点碱基A→G，使171、172位氨基酸RE突变为GG。

1.4 PCR分别扩增UCP1、UCP2及UCP3蛋白IML2两侧的基因片段 以pcDNA-UCP1/UCP2/UCP3重组质粒为模板，分别加入各组的引物①②和③④，扩增IML2两侧基因片段。PCR反应条件：96℃预变性10min；96℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸50s，35个循环；72℃终延伸5min。扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。用DNA凝胶提取试剂盒回收纯化PCR产物。

1.5 SOE-PCR 获 得 嵌 合 型 UCP1、UCP2 及UCP3基因序列 利用各组引物②③之间的互补序列，可以将UCP1/UCP2/UCP3拼接起来。以第1次PCR纯化产物作为模板。PCR反应参数：首次循环，94℃变性45s、37℃退火10min、72℃延伸2min；其余循环，94℃变性45s、57℃退火15s、72℃延伸45s，循环30次；终延伸72℃、5min。扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析。用DNA凝胶提取试剂盒回收纯化PCR产物。SOE-PCR利用引物②③之间有要拼接的互补序列，把退火温度降得很低（37℃），使得互补序列之间通过共价键结合。在只有引物①④的情况下，即可扩增得到嵌合型UCP1、UCP2及UCP3基因。

1.6 SOE-PCR产物的克隆及测序 分别将纯化的PCR产物即嵌合型UCP1、UCP2及UCP3基因片段与测序载体pCR2.1于14℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞TOP10涂布于LB培养皿（Kana 50mg·L－1），37℃过夜培养，进行蓝白筛选。挑选白色菌落，接种于液体LB培养基（Kana 50mg·L－1），37℃、160r·min－1振荡过夜。用质粒DNA纯化试剂盒提取质粒，以其为模板进行PCR鉴定，并分别用EcoRⅠ-XhoⅠ（UCP1UCP2）、KpnⅠ-XhoⅠ（UCP2UCP1和UCP3UCP1）进行双酶切鉴定。重组阳性克隆pCR－UCP1UCP2、pCR－UCP2UCP1和 pCR－UCP3UCP1进行测序。

1.7 pcDNA-UCP1UCP2、 pcDNA-UCP2UCP1及pcDNA-UCP3UCP1重组质粒的构建及鉴定 pCRUCP1UCP2和pcDNA3.1分别用EcoRⅠ-XhoⅠ双酶切，pCR-UCP2UCP1/pCR-UCP3UCP1和 pcDNA3.1分别用KpnⅠ-XhoⅠ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，DNA凝胶提取试剂盒分别回收靶序列和线性化的载体，16℃过夜连接后转化感受态TOP10，提取质粒，经PCR和双酶切鉴定筛选正确克隆。

1.8 定 向 点 突 变 pcDNA-UCP3R167G/pcDNAUCP3RE171/172GG以 pcDNA-UCP3 重 组 质 粒 为 模板，分别加入点突变引物⑤⑥和⑦⑧，用PfuDNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应参数：95℃预变性1min；95℃变性50s，60℃退火50s，68℃延伸7min，18个循环；68℃终延伸7min。扩增产物中有缺口的环状质粒和闭合环状重组质粒模板，用DpnⅠ酶能够识别甲基化位点将模板酶切去除，将DpnⅠ处理的PCR产物做转化，再筛选出阳性克隆，并提取质粒，进行测序。

2 结 果

2.1 SOE-PCR获得UCP1、UCP2及UCP3嵌合型基因序列 利用①②和③④两对引物分别获得UCPs IML2结构两侧基因片段，PCR产物长度与预期设计的目的基因中包含的碱基数量吻合UCP1UCP2（637bp，461bp）、UCP2UCP1（544bp，459bp） 及 UCP3UCP1（542bp，464bp）。SOE-PCR利用引物②③之间互补序列通过共价键结合使UCPs IML2两侧基因片段拼接起来，由引物①④可扩增得到嵌合型UCP1、UCP2及UCP3基因（图1）。UCP1的IML2氨基酸编码序列162RIIATTE168被UCP2的KTIAREE置换后成UCP1UCP2嵌合体，UCP2的IML2氨基酸编码序列164KTIAREE170被UCP1的RIIATTE置换后成UCP2UCP1嵌合体，UCP3的IML2氨基酸编码序列167RTIAREE 173被UCP1的RIIATTE置换后成 UCP1UCP2嵌合体（图2）。

2.2 UCPs嵌合体重组质粒的鉴定 pcDNA-UCP1UCP2、pcDNA-UCP2UCP1及 pcDNA-UCP3UCP1重组质粒分别用EcoRⅠ-XhoⅠ（UCP1UCP2）、KpnⅠ-XhoⅠ（UCP2UCP1和 UCP3UCP1）进行双酶切鉴定，酶切片段大小均与对应的嵌合型基因长度一致（图3）。

图1 UCP1/UCP2/UCP3基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of UCP1/UCP2/UCP3gene

图2 UCP2和UCP3与UCP1之间的嵌合体基因组成Fig.2 Generation of the chimera between UCP2and UCP3 with UCP1

图3 重组质粒pcDNA-UCP1UCP2/UCP2UCP1/UCP3UCP1的酶切鉴定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pcDNAUCP1UCP2/UCP2UCP1/UCP3UCP1 by enzyme digestion

2.3 定向点突变 UCP3R167G/UCP3RE171/172GG利用定向点突变技术成功将重组质粒pcDNA-UCP3中的UCP3野生型基因第499位点碱基A→G，使167位氨基酸R突变为G；第511、515位点的2个碱基A→G，使171，172位氨基酸R和E突变为G和G（图4）。

图4 定向突变产生UCP3突变体Fig.4 Mutagenesis of the UCP3mutants

3 讨 论

线粒体Ca2＋摄取对于调节器官的生理功能和功能障碍是非常重要的[9－10]。线粒体Ca2＋通道从功能上已经被鉴定，不仅证明在线粒体IMM上有功能的Ca2＋通道存在，而且揭示了具有不同特性的线粒体Ca2＋通道的存在，这个观点挑战了线粒体上只存在Ca2＋单一输送体的概念。与一些关于线粒体Ca2＋通道功能特性等相反的是线粒体Ca2＋通道蛋白至今还没最终定论性鉴定。近年来有研究[11－12]报道：在未经刺激的细胞中 UCP2/3对线粒体的Ca2＋积累有重要作用，这些蛋白或者作为线粒体Ca2＋选择性离子通道传导亚单位，或者发挥线粒体Ca2＋摄取通路中必需调节子的功能[13]。UCP2/UCP3蛋白对线粒体摄取Ca2＋机制方面发挥重要功能性作用的结构组成就是IML2结构，然而这个结论也备受争议。要揭示UCP2/3依赖的线粒体Ca2＋单向运输的关键因素还要取决于实验操作和模型的选择[7]。所以，构建 UCP2/UCP3与UCP1之间互相置换IML2的嵌合体和UCP3定向点突变体，从分子结构水平上阐释UCP2/3是线粒体Ca2＋单一输送体的必要组成具有重要意义。

本研究成功构建了UCPs嵌合体重组真核表达质 粒（pcDNAUCP1UCP2、pcDNAUCP2UCP1和pcDNAUCP3UCP1）和突变体重组真核表达质粒（pcDNA－UCP3R167G/pcDNA －UCP3RE171/172GG）。 利用SOE-PCR获得嵌合型UCP1、UCP2、UCP3基因序列。SOE-PCR的原理：由3个PCR构成，第一阶段的PCR产物作为第二阶段的PCR模板。产生每个UCP嵌合基因的SOE-PCR过程中都需要2对引物：1对克隆引物（①④），1对嵌合引物（②③）。根据要拼接的2条已知的基因序列来设计嵌合引物，使得引物②的5′端含有一段UCPs IMM下游5′端的互补序列，而引物③的5′端含有一段UCPs IMM上游3′端的序列。嵌合引物②③中都包含一段需置换的IMM基因序列。这样嵌合引物引物②的5′端和嵌合引物③的3′端就含有一段互补的序列。在第一阶段的PCR中，UCPs IMM上游的PCR产物的3′端带有UCPs IMM下游5′端的一段序列，同理UCPs IMM下游的PCR产物的5′端带有UCPs IMM上游3′端的一段序列。因此每种PCR产物的拼接点上都含有另一个PCR产物的序列。这样在第二阶段的PCR中，当这2种PCR产物混合，作为模板时就能够部分退火结合，再使用1对克隆引物①④，就能形成完整的嵌合型UCPs的基因序列。

当使用普通Taq酶作为第一阶段PCR的反应酶时，其PCR产物的3′端总是多出一个腺嘌呤核苷酸，即A。这样在第2阶段的PCR反应中，就很容易产生碱基的移位，最终导致氨基酸读码框的改变，出现蛋白变异。解决这一问题的方法是采用具有3′外切纠错功能的ExTaq酶。在第2阶段的PCR反应中，当含有互补序列的2条单链低温退火结合时，ExTaq酶可切除其3′端突出的A，保证拼接序列具有正确的读码框。SOE-PCR是1种多重的PCR扩增，拼接产物的合成至少要经过两重的PCR反应。易发生碱基的错配，导致氨基酸的突变。ExTaq酶不仅具有3′外切纠错功能，还有较高的保真性。因此在整个的SOE-PCR过程中，都采用了该酶。本实验结果证明：使用ExTaq酶的效果较好，测序结果显示未产生碱基的突变。

利用定向突变的方法获得带有1和2个氨基酸突变的UCP3突变体。首先设计1对突变引物，这种突变引物都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11～12bp。若两边引物太短，很可能会造成突变实验失败。那么，以pcDNA-UCP3重组质粒为模板，经PCR可把整个质粒都给扩增出来，得到的PCR产物是两条带有缺口的互补链，此时PCR产物中混有模板，再用DpnⅠ酶去掉模板，DpnⅠ能够识别甲基化位点并将其酶切，本研究用的模板重组的pcDNA3.1是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnⅠ酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，然后直接把通过DpnⅠ处理的PCR产物进行转化，筛选阳性克隆，并提取质粒，进行测序来验证。需要强调一点，DpnⅠ处理的时间需长些，最好消化2～3h，因为如果模板处理得不干净，残留的模板就会在平板上长出来，导致实验失败。进行这种定点突变PCR需要用高保真Pfu DNA聚合酶，这样的酶具有3′到5′外切酶（校正）活性。当聚合反应发生碱基错配时，聚合酶的校正活性可将错配的碱基切除，扩增得到的PCR产物为平端，3′端不带有A碱基，避免造成插入突变。

通过上述方法得到UCPs突变体，采用瞬时转染技术，以转染UCPs嵌合体、突变体重组真核表达质粒的人脐静脉内皮细胞为模型测定线粒体Ca2＋，证实 UCP2/3的IML2结构域对线粒体Ca2＋积聚现象的影响发挥重要作用（另文已发表）[14]，尤其由 UCP2/3组成的线粒体摄取 Ca2＋机制或是来自细胞内Ca2＋的释放或来自胞外Ca2＋，IML2中2个不同分子位点对于Ca2＋敏感性至关重要，这些发现与线粒体Ca2＋单输送体对Ca2＋有着不同敏感性的报道是一致的。因此，构建解偶联蛋白功能结构域的嵌合体和突变体，对于理解UCP2/3依赖的线粒体Ca2＋摄取的分子机制以及深入了解UCP2/3对线粒体Ca2＋积聚现象的作用机制具有重大意义。

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